Name: טוען מדרדר עצבים, קטעי צליל, ושורשים השדרה עם צבעי ניאון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: למד טכניקה פשוטה וזולה להטענת צבעים פלואורסצנטיים ורגישי סידן לתוך נוירונים ומסלולים עצביים באמצעות פיפטות שאיבה מפוליאתילן. השיטה מאפשרת הדמיה יעילה של פעילות עצבית במחקר נוירומדעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המיפוי של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ במכון הלאומי לבריאות. אנו רוצים גם להודות לד&quot;ר ג&#39;ורג&#39; Mentis תרומות קודמות שלו לשיטה וכן את הנתונים באיור 3.</p

Dextrans פלורסנט שימשו ככלים אנטומיים לפעילות ההדמיה העצבית 1-4. שדות ואח&#39;, (2009) 4 שפורסם פרוטוקול ליישום יון מתח רגישים צובעת את שטחי axonal עם דגש על חוט השדרה כמערכת מודל. כאן אנו מתארים את הליך מפורט יותר על יישום צבע פלואורסצנטי ו / או יון רגיש השורשים הגחון לחתוך, שורשים הגב או כל בדרכי עצבי של חוט השדרה של חוץ גופית מחקרים optophysiological ו מורפולוגי. 1. Type-I ו-II סוג טפטפות התחל על ידי משיכת שני קטעים קצרים של צינורות פוליאתילן (PE90, מותג קליי אדמס) מעל להבה של נר אלכוהול 7 לייצר בטפי להחדרת נוזלים עם טיפים מחודדות. אחת פיפטה (Type-I) צריך להיות קצר (3-7 מ&quot;מ) עם קצה קטן שיכול להחזיק חזק את שורש היעד או דרכי (קוטר חיצוני: 0.2-0.4 מ&quot;מ, קוטר פנימי: 0.1-0.3 מ&quot;מ). ואז למשוך פיפטה 2 (סוג-II) עם מוט ארוך (8-12 ס&quot;מ), דק יותר עצה טובה מאוד (קוטר חיצוני: 0.2-0.3 מ&quot;מ, קוטר פנימי: 0.1-0.2 מ&quot;מ), כי יכול להיות מוכנס לתוך סוג, אני פיפטה עד עצה שלה. פיפטה דקה 2 ישמש לשאוב ולהציג מלאכותית הנוזל השדרתי (aCSF) פתרון צבע בהתאמה מ פיפטה סוג-I. 2. המיקום של סוג, אני פיפטה לנתח ולבודד את חוט השדרה 8,9 ולמקם אותו באמבטיה, superfused עם aCSF צונן (~ 16 מעלות צלזיוס) לאורך כל תהליך הטעינה. מניחים את סוג-I פיפטה על בעל אלקטרודה (H1/12 בעל אלקטרודה, Narishige), כך פתח את גבו ניתן לחבר בקלות את המזרק (1ml U-100 מזרק אינסולין, בקטון דיקנסון או מקביל) באמצעות צינור גמיש (PharMed BPT, קול, בן הזוג, # AY242002: 10 ס&quot;מ) (Fig.1A-B). 3. דיי יישום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק, תחילה לציירaCSF אל פיפטה Type-I (Fig.1B: 2 א) ואחריו מערכת axonal או שורש להתמלא (איור 2 ב). צינורות גמישים אז יש להסיר הפתיחה האחורי. Type-II פיפטה מצורף מזרק אחר ונוסף Type-פיפטה אני מחזיק את דרכי שורש axonal או. שימוש במזרק המצורף פיפטה מסוג II, aspirate aCSF כך aCSF שיורית רק מכסה את דרכי axonal (Fig.1C, 2C-D). ואז לסגת מסוג II פיפטה מ פיפטה סוג אני. לפקח על רמת aCSF במשך כמה דקות כדי לוודא חותם טוב על מערכת העצבים או axonal (ראה סעיף 3 של פתרון בעיות עבור &quot;חותם טוב&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הצבע בתוך aCSF או 0.2% טריטון X-100 במים מזוקקים פעמיים ולמשוך אותה פיפטה Type-II תוך שימת לב שלא לכלול בועות אוויר. הכנס Type-II פיפטה המכיל צבע לתוך סוג, אני פיפטה אל הפתרון aCSF שיורי (2E איור). לאט לאט לשחררצבע לתוך aCSF באמצעות לחץ חיובי עדין (איור 2F). להיזהר לא להציג את כל בועות האוויר או לגרום לעקירה של רקמת היעד מבפנים עצה. משיכה מסוג II פיפטה אחרי כמות מספקת של הצבע כבר פורסמו (3-5 μL של פתרון צבע). </li></ol> 4. דגירה דגירה רקמות בחושך בין 6 עד 20 שעות בהתאם לסוג הניסוי. לאחר מספיק זמן כבר אפשר למלא, בעדינות להתרחק האלקטרודה מרקמות עוזב רקמות מוכן הדמיה או היסטולוגיה. פתרון בעיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם רקמת המטרה לא נכנס בקלות לתוך קצה סוג, אני פיפטה או רופף פעם אחת בפנים, אז בקוטר עצה הוא בגודל הלא נכון. במקרה זה, להוציא ולהשתמש פיפטה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הוספת צבע כדי aCSF ב פיפטה סוג-I, ודא aCSF מספיק עדיין, כך שניתן יהיה להגיע עםמסוג II פיפטה עצה (איור 2 ד). שאם לא כן, הפער האוויר יהיה קיים פעם צבע נוסף. אם זה יקרה, אל תוסיף צבע ולהסיר את דרכי axonal מ טפטפת ואז למשוך אותו בחזרה עם aCSF מספיק כדי להגיע אליו פיפטה Type-II. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם רמת aCSF את סוג, אני עולה פיפטה לאחר להישאף עם פיפטה Type-II, פירוש הדבר כי החותם עם רקמות לא טוב. השתמש אלקטרודה שונה, אחרת הצבע יהיה מדולל במהלך ההליך תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בועת אוויר מוחדר פיפטה סוג, אני תוך הזרקת צבע, לנקז את הבועה על ידי קידום קרוב Type-II פיפטה עצה לבעבע בעדינות הפעלת לחץ שלילי חלש שימוש במזרק המצורף. </li></ol> 5. נציג תוצאות Motoneurons כדי להמחיש את היישום של השיטה, העמסנו בו זמנית, afferents חושיות interneurons השדרה עם dext 3 שונהרץ למוצרי מצומדות צבעי ניאון (איור 3 א). כפי שמודגם באיור. 3B, שלושה סוגים של נוירון מסומנים; afferents חושיות (אדום), interneurons מקרין לתוך חבל הטבור הגחון (ירוק) ו motoneurons (כחול). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי המציג פיפטה Type-I ו-II סוג הרכבה. (א) Type-אני פיפטה (אור כחול) מושם על בעל אלקטרודה, כך היא חזרה פתיחתו ניתן לחבר בקלות צינורות אלסטומר גמיש (ב &#39;) שלתוכו Type-II פיפטה ניתן להכניס (C). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי המציג את תהליך הטעינה של motoneurons עם צבעי ניאון. (א) פיפטה סוג, אני ממוקם ליד השורש הגחוני להתמלא. (ב) יניקה מוחל על פיפטה לצייר aCSF אל פיפטה ואחריו השורש. (C-D) נתק את צינור אלסטומר גמיש מ backend של פיפטה Type-I ו להפחית את כמות aCSF על ידי יישום יניקה כדי פיפטה Type-II. (ה) הכניסו את קצה פיפטה Type-II המכיל צבע מומס לתוך aCSF שנותר פיפטה סוג-I. (EF) לאט לאט למלא את סוג פיפטה, אני עם צבע ולאחר מכן הסר Type-II פיפטה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> איור 3. היישום של הליך מילוי לחוט השדרה עכבר בודד. (א) סכמטי המראה את סוג 3, אני טפטפות המשמש למילוי כיתות עצביים שונים בחוט השדרה. Motoneurons (כחול, כחול אשד dextran) ו afferents חושיות קודש (אדום, טקסס האדום dextran) היו backfilled דרך השורשים הגחון ועל הגב, בהתאמה. Fluorescein dextran שימש כדי לטעון interneurons השדרה (ירוק) אשר אקסונים לעלות דרך חבל הטבור הגחון (VF). 1 מ&quot;ג של כל צבע dextran (10,000 מגוואט; בדיקות מולקולריות)פורקה ב 6 מים מזוקקים μL המכיל 0.2% טריטון X-100 (ב). התמונה confocal סעיף מחוט עצם העצה של חוט השדרה שבו הנוירונים חזרו שכותרתו כמתואר הערה א &#39;כי afferents חושיות שכותרתו הם ipsilateral בעיקר עם תחזיות הנגדי בלבד. את motoneurons שכותרתו הם ipsilateral לשורש הגחון מלא ואילו interneurons שכותרתו הם הנגדי לצד מילוי (ראש חץ). כיול בר 200 מיקרומטר.

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran-amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
<li>McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+neuronal+activity+in+tissue+labeled+by+retrograde+transport+of+Calcium+Green+Dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran.</a> Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).</li>
<li>Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nervous+system+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging nervous system activity.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3(2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+neurons+retrogradely+and+anterogradely+labelled+with+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes.</a> J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).</li>
<li>Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+recording+using+retrogradely+transported+dye+in+the+chicken+spinal+cord%3A+staining+and+signal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).</li>
<li>Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology+II%3A+Extracellular+Suction+Electrode+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication.</a> J. Vis. Exp. (48), e2580(2011).</li>
<li>Smith, J. C., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+brainstem-spinal+cord+preparations+for+study+of+motor+systems+for+mammalian+respiration+and+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion.</a> J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (35), e1660(2010).</li>
<li>Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+reduced+sensorimotor+connections+form+with+normal+specificity+despite+abnormal+muscle+spindle+development%3A+the+role+of+spindle-derived+neurotrophin+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3.</a> J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).</li>
<li>Mentis, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+impairment+of+sensory-motor+connectivity+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neuron. 69, 453-467 (2011).</li>
<li>Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+sacral+neurons+involved+in+activation+of+the+lumbar+central+pattern+generator+for+locomotion+in+the+neonatal+rodent+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Neurosci.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord.</a> Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+spatiotemporal+organization+of+neural+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord.</a> Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).</li>
<li>Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterns+of+vestibular-mediated+synaptic+inputs+to+axial+and+limb+motoneurons+in+the+neonatal+mouse+assessed+by+optical+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording.</a> J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).</li>
<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; אין לנו מה למסור.</p

<p class="jove_content"&gt; אנחנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט וחסכוני מציגה צבעים לתוך נוירונים, עצבים קטעי השדרה. שיטה זו כרוכה בחשיפת מסלולים אנטומיים המזוהים לפתרון צבע ריכוז גבוה למשך כל תהליך הטעינה. התוצאה היא תיוג מדרדר של אתר היעד עם רקע קצת לעומת microinjections, יישומים אמבטיה וטכניקות electroporation. עם זאת, שיטה מוגבלת אתרים במערכת העצבים שבו מערכת של אקסונים יכול להיות מבודד. יתר על כן, כי הצבע נראה לפזר לאורך האקסונים להגיע גופי התא, זמן הטעינה יהיה תלוי במרחק ממקום היישום לצבוע את somata העצבית. לפחות על פי<em&gt; במבחנה</em&gt; הת...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td colspan="2"<strong&gt; חומר שם</strong</td&gt;<td<strong&gt; החברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגי</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="2"&gt; Tubing</td&gt;<td&gt; PE90 (IDxOD: 0.034 &quot;x0.050&quot;; Thikness הכותל: 0.008 &quot;)</td&gt;<td&gt; קליי אדמס מותג Intermedic</td&gt;<td&gt; 427421</td&gt;<td&gt; עבור סוג I &amp; Type II בטפי להחדרת נוזלים</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NSF-51 (IDxOD: 1/16x1/8; Thikness החומה: 1/32)</td&gt;<td&gt; PharMed BPT, קול, בן הזוג</td&gt;<td&gt; AY242002</td&gt;<td&gt; עבור צינור גמיש</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מזרק</td&gt;<td&gt; מזרק אינסולין 1ml U-100</td&gt;<td&gt; בקטון דיקנסון</td&gt;<td&gt; 329650</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מחט</td&gt;<td&gt; 19G x1-1/2 &quot;מחט מתכת Hub</td&gt;<td&gt; MONOJECT</td&gt;<td&gt; 200136</td&gt;<td&gt; חיבור מסוג II פיפטה כדי המזרק</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; אלכוהול מנורה</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; שסתום</td&gt;<td&gt; שלוש דרך שסתום עם מתאם זכר Slip Luer</td&gt;<td&gt; בקסטר בריאות קורפ</td&gt;<td&gt; 2C6241</td&gt;<td&gt; השתמש במזרק</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="3"&gt; מחזיק</td&gt;<td&gt; H-1 בעל אלקטרודה</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; H-1/12</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מגנט דוכן</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; GJ-8</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Micromanipulator</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; M-3333</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מלקטת</td&gt;<td&gt; S &amp; T דומונט שוויצרי 00632-11</td&gt;<td&gt; דומונט</td&gt;<td&gt; JF-5 TC</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"&gt; * אלה הם חומרים שהציע. ניתן להחליף את כל המוצרים התואמים</p

טוען מדרדר עצבים, קטעי צליל, ושורשים השדרה עם צבעי ניאון

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

תיוג מדרדר של נוירונים הוא אנטומי רגיל שיטת 1,2 כי שימש גם לטעון סידן מתח רגישים צבעים לתוך נוירונים 3-6. באופן כללי, צבעים חלים גם גבישים מוצקים או על ידי הזרקה בלחץ מקומי באמצעות בטפי להחדרת נוזלים זכוכית. עם זאת, זה יכול לגרום לדילול של עוצמת תיוג לצבוע מופחת, במיוחד כאשר כמה שעות נדרשים עבור דיפוזיה צבע. כאן אנו מדגימים טכניקה פשוטה בעלות נמוכה להכנסת צבעי ניאון ו יון רגיש אל הנוירונים באמצעות שאיבה פוליאתילן פיפטה פתרון מלא צבע. שיטה זו מציעה דרך אמינה לשמירה על ריכוז גבוה של צבע במגע עם אקסונים בכל הליך הטעינה.

אנו מתארים טכניקה פשוטה עלות נמוכה להכנסת ריכוז גבוה של צבעי ניאון וסידן רגיש אל הנוירונים או כל בדרכי העצבית באמצעות טפטפת יניקה פוליאתילן.

סימון רטרוגרדי של נוירונים הוא שיטה אנטומית סטנדרטית1,2 המשמשת גם להחדרת צבעים רגישים לסידן ולמתח חשמלי אל תוך נוירונים3-6. ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר ריכוז גבוה של צבע פלואורסצנטי או צבע רגיש ליונים לנוירונים או לכל מסלול עצבי באמצעות טכניקה פשוטה וזולה. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור שני סוגים של פיפטות, סוג אחד וסוג שני. לאחר מכן, מחברים צינור אלסטומר גמיש לפיפטה מסוג אחד ומפעילים לחץ חיובי כדי לשאוב את המסלול העצבי המיועד אל תוך הפיפטה מסוג אחד, תוך וידוא שנוצר איטום תקין.בשלב הבא, הכניסו את הפפית מסוג שני לתוך הפפית מסוג ראשון והשתמשו בפפית מסוג שני כדי לשאוב את שארית ה-A CSF מהפפית מסוג ראשון. לאחר מכן, הכניסו את הצבע לפפית מסוג ראשון, אך ודאו שלא נכנסו בועות אוויר. השלב הסופי הוא דגירה של הנוירונים בחושך למשך 6 עד 20 שעות.בסופו של דבר, לאחר הסרת פיפטה מסוג אחת, הדגימה מוכנה למחקרי in vitro, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים או מחקרים מורפולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון יישום באמבט (bath application), הזרקת BOS ואלקטרופורציה, הוא שה-D מועבר לאוכלוסייה נוירונלית מוגדרת. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון פעילות, קישוריות, מורפולוגיה והפצה של נוירונים מוגדרים.באופן כללי, הטכניקה דורשת תרגול, ובמיוחד הבטחה שהצבע לא ייהמר בתוך פיפט מסוג 1 ושלא יחדרו אליו בועות אוויר. התחילו את ההליך על ידי מתיחת צינור פוליאתילן מעל להבת מנורת אלכוהול כדי ליצור שתי פיפטות קצרות עם קצות מסתייגות. ראשית, מתחו פיפט קצרה מסוג 1 עם קצה קטן שיכול להחזיק בחוזקה את השורש או את המסלול המיועד.בשלב הבא, קחו פיפט מסוג 2 בעלת מוט ארוך ודק יותר וקצה עדין מאוד שניתן להחדיר אל תוך הפיפט מסוג 1 עד לקצהה. לאחר מכן, חברו את הפיפט מסוג 2 למחט 19 gauge עם תפס EC. לאחר מכן, הנחו את חוט השדרה המבודד בתוך אמבט.במהלך תהליך הטעינה, השתמש ב-A CSF מקורר כדי להבטיח ספיגה מלאה. לאחר מכן, הנח את פיפט מסוג 1 על תומך אלקטרודות, כך שניתן יהיה לחבר בקלות את הפתח האחורי שלו למזרק באמצעות צינור גמיש. בפרוצדורה זו, שלוף תחילה CSF אל תוך פיפט מסוג 1 באמצעות מזרק.בשלב הבא, שאירו את המסלול האקסונלי או את השורש המיועדים למילוי. לאחר מכן, הסירו את הפיתול הגמיש מהפתח האחורי. לאחר מכן, חברו את הפ pipette מסוג 2 למזרק אחר.הכנס אותה לפ pipette מסוג 1, המחזיקה מסלול אקסוני או שורש עצבי תחת המיקרוסקופ. השתמש במזרק המחובר ל-pipette מסוג 2 כדי לשאוב A CSF, כך שה-A CSF שנותר יכסה רק את המסלול האקסוני. לאחר מכן, הוצא את ה-pipette מסוג 2 מתוך ה-pipette מסוג 1.עקבו אחר מפלס ה-A CSF למשך מספר דקות כדי לוודא אטימה טובה של המסלול האקסונלי או העצבים. לאחר מכן, המיסו את הצבע ב-A CSF או ב-0.2%Triton X 100 במים מזוקקים פעמיים. שאבו את התמיסה אל פיפטה מסוג 2 על ידי הפעלת לחץ שלילי חלש במזרק המחובר, תוך הקפדה לא לשאוב בועות אוויר.כעת הכניסו את פיפטה מסוג 2 המכילה את הצבע אל תוך תמיסת ה-A CSF שנותרה. בפיפטה מסוג 1, שחררו לאט את הצבע אל תוך ה-A CSF תוך הפעלת לחץ חיובי עדין באמצעות המזרק. הקפידו לא להחדיר בועות אוויר ולא לגרום להעתקה של הרקמה המטרה מתוך קצה הטיפ. אם חודרת בועת אוויר לפיפטה מסוג 1 בזמן הזרקת הצבע, הוציאו את הבועה על ידי קירוב קצה פיפטה מסוג 2 אל הבועה, ולאחר מכן הפעלת לחץ שלילי חלש בעזרת המזרק המחובר.לאחר ששוחררה כמות מספקת של צבע, הוצא את פיפטה מסוג שתיים. לאחר מכן, הדגר את הרקמה בחושך למשך שש עד 20 שעות, בהתאם לסוג הניסוי. לאחר שחלף זמן מספיק למילוי, משוך בעדינות את האלקטרודה מהרקמה.לאחר מכן הרקמה מוכנה לדימוי או להיסטולוגיה. להלן תרשים סכמטי המראה טעינה סימולטנית של שלושה צבעים פלואורסצנטיים שונים המצומדים לדקסטראן אל נוירונים מוטוריים, נוירונים סנסוריים אפרנטים ונוירונים אינטרספינליים; נוירונים מוטוריים ונוירונים סנסוריים אפרנטים סקראליים מולאו באופן רטרוגרדי (backfilled) עם Cascade blue Dextran ו-Texas red dextran דרך השורשים הוונטרליים והדורסליים בהתאמה. דקסטראן פלואורסצנטי ירוק נטען לנוירונים אינטרספינליים שאקסוניהם עולים דרך ה-ventral funiculus.מוצגת כאן תמונת קונפוקלית של חתך מהחוט השדרני הסקראלי שבו בוצע סימון רטרוגרדי (back labeling) של הנוירונים. שימו לב כי הסיבים התחושתיים האפרונטים המסומנים הם בעיקר איפסילטרליים. לצד מספר בלטות קונטרלטרליות, הנוירונים המוטוריים המסומנים הם איפסילטרליים לשורש הוונטרלי הממולא, בעוד שהנוירונים האינטרנוירונליים המסומנים הם קונטרלטרליים לו, כפי שמוצג על ידי ראש החץ.בעקבות נוהל זה, ניתן לבצע שיטות נוספות במטרה לענות על שאלות מפתח כגון קישוריות תפקודית, מעממם מעכב, סוג סינוס, ההתפלגות וייצור מתווכי עצביים בנוירונים של שדה ה-DI. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירופיזיולוגיה של חוט השדרה וגזע המוח לסמן אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות באמצעות צבעים רגישים ליונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן היישום של צבעים פלואורסצנטיים ו/או צבעים רגישים ליונים בנוירונים ובסיבים תחושתיים בחוט שדרה מבודד.

retrograde-loading-nerves-tracts-spinal-roots-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סידן הוא שליח בכל מקום במערכת העצבים, חיוני מפעילה שחרור הנוירוטרנסמיטר ושינויים חוזק סינפטי. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת Ca 2 +-אינדיקטורים לתוך מסופי תסיסנית עצב. אנחנו גם מדגימים המצאה של המנגנון הנדרש ולהדגיש נקודות קריטיות להצלחת הטכניקה.

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה...

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

מקור: Inal, M. A. et. al., מעקב לאחור אחר Drosophila נוירונים מוטוריים עובריים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים ליפופיליים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את שיטת התיוג לאחור של נוירונים מוטוריים Drosophila באמצעות צבעים ליפופיליים. הצבע נכנס לאקסון, נע לאחור ומסמן את הנוירונים בירוק, מה שמאפשר הדמיה מפורטת של המורפולוגיה וההקרנות שלהם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

תיוג רטרוגרדי של נוירונים מוטוריים של דרוזופילה באמצעות צבעים ליפופיליים פלואורסצנטיים

מקור: }Wang, J., . הדמיה של העצב האימונוריאקטיבי של פפטיד הקשור לגן קלציטונין של הגולגולת של חולדה עם אימונופלואורסצנציה ומעקב עצבי. J. Vis. exp. (2021).  }סרטון זה מדגים שיטה להתחקות אחר מקורותיהם של נוירונים חושיים בדורה מאטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עוקב רטרוגרדי מוחדר לדורה מאטר החשוף של חולדה מורדמת. העוקב נקלט על ידי אקסונים עצביים חושיים ונוסע לאחור לגופי התאים שלהם בתוך הגנגליון הטריגמינלי וגרעיני השורש הגבי הצווארי. לאחר מכן הגנגליונים נחתכים, מוכתמים בנוגדנים המסמנים את העוקב...

חקירת המקורות של נוירונים חושיים בדורה מאטר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופ זמן-lapse של עירור שני פוטונים כדי לדמיין בו זמנית את הדינמיקה של פגיעות אקסון ומיאלין בזמן אמת. פרוטוקול מוצע זה מאפשר מחקרים של גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד שיכולים להשפיע על גורל האקסון המיאליני המרכזי לאחר פציעה ולתרום לנכות קלינית קבועה.

Ex Vivo חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק תיוג.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

כאן, אנו מתארים שיטה לטעינת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת וניתוח של טרמינטים סידן מהיר בקצות העצבים ההיקפיים.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

למד טכניקה פשוטה וזולה להטענת צבעים פלואורסצנטיים ורגישי סידן לתוך נוירונים ומסלולים עצביים באמצעות פיפטות שאיבה מפוליאתילן. השיטה מאפשרת הדמיה יעילה של פעילות עצבית במחקר נוירומדעי.

טוען מדרדר עצבים, קטעי צליל, ושורשים השדרה עם צבעי ניאון

גלה סרטונים נוספים