טוען מדרדר עצבים, קטעי צליל, ושורשים השדרה עם צבעי ניאון

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להחדיר ריכוז גבוה של צבע פלואורסצנטי או צבע רגיש ליונים לנוירונים או לכל נתיב עצבי באמצעות טכניקה פשוטה וזולה. הדבר משיג על ידי ייצור שני סוגי פיפטות, סוג אחד וסוג שני. לאחר מכן, מחברים צינור אלסטומר גמיש לפיפטה מסוג אחד ומפעילים לחץ חיובי כדי לשאוב את הנתיב העצבי המיועד לתוך הפיפטה מסוג אחד, תוך וידוא שנוצר אטם טוב.

בשלב הבא, הכניסו את הפפית מסוג שני לתוך הפפית מסוג ראשון והשתמשו בפפית מסוג שני כדי לשאוב את שארית ה-A CSF מהפפית מסוג ראשון. לאחר מכן, הכניסו את הצבע לפפית מסוג ראשון, אך הקפידו שלא ייכנסו בועות אוויר. השלב הסופי הוא דגירה של הנוירונים בחושך למשך שש עד 20 שעות.

בסופו של דבר, לאחר הסרת פיפט מסוג 1, התכשיר מוכן למחקרים ב-in vitro, למחקרים אלקטרופיזיולוגיים או למחקרים מורפולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון bath application, הזרקת BOS ואלקטרופורציה, הוא שה-D מסופק לאוכלוסייה נוירונלית מוגדרת. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון פעילות, קישוריות, מורפולוגיה והפצה של נוירונים מוגדרים.

באופן כללי, הטכניקה דורשת תרגול, ובמיוחד הבטחה שהצבע לא ידולל בתוך פיפט מסוג 1 ושלא יחדרו אליו בועות אוויר. התחילו את הפרוצדורה על ידי משיכת צינור פוליאתילן מעל להבה של מנורת אלכוהול כדי ליצור שתי פיפטות קצרות עם קצוות מחודדים. ראשית, משכו פיפט קצרה מסוג 1 עם קצה קטן שיכול להחזיק בחוזקה את השורש או את המסלול המדובר.

לאחר מכן, השתמשו בפיפט מסוג שני עם מוט ארוך ודק יותר וקצה דק מאוד שניתן להחדיר לתוך הפיפט מסוג ראשון עד לקצהו. לאחר מכן, חברו את הפיפט מסוג שני למחט 19 gauge מקוצצת של EC. לאחר מכן, הניחו את חוט השדרה המבודד בתוך אמבט.

במהלך תהליך הטעינה, יש לשטוף זאת ברציפות ב-A CSF מקורר. לאחר מכן, הנח את פיפטה מסוג 1 על מחזיק אלקטרודות כך שניתן יהיה לחבר בקלות את הפתח האחורי שלה למזרק באמצעות צינור גמיש. בהליך זה, שלב ראשון הוא שאיבת A CSF אל תוך פיפטה מסוג 1 באמצעות מזרק.

בשלב הבא, שרטטו את נתיב האקסונים או את השורש שימולאו. לאחר מכן, הסירו את הפיתול הגמיש מהפתח האחורי. לאחר מכן, חברו את הפ pipette מסוג 2 למזרק אחר.

החדירו זאת אל תוך פיפטה מסוג 1, המחזיקה מסלול אקסוני או שורש עצבי תחת המיקרוסקופ. השתמשו במזרק המחובר לפיפטה מסוג 2 כדי לשאוב A CSF, כך שה-A CSF שנותר יכסה במדויק את המסלול האקסוני. לאחר מכן, הוציאו את הפיפטה מסוג 2 מהפיפטה מסוג 1.

יש לעקוב אחר מפלס ה-A CSF במשך מספר דקות כדי לוודא אטימה טובה של מסלול האקסונים או העצבים. לאחר מכן, המס את הצבע ב-A CSF או ב-0.2%Triton X 100 במים מזוקקים פעמיים. שאב את התמיסה אל פיפט מסוג שתיים על ידי הפעלת לחץ שלילי חלש במזרק המחובר, תוך הקפדה שלא לשאוב בועות אוויר.

לאחר מכן, הכניסו את פיפט סוג 2 המכילה את הצבע לתוך תמיסת ה-A CSF שנותרה. בפיפט סוג 1, שחררו באיטיות את הצבע אל תוך ה-A CSF תוך הפעלת לחץ חיובי עדין על המזרק. הקפידו לא להכניס בועות אוויר ולא לגרום להזזת הרקמה המטרה מתוך קצה הפיפט. אם נכנסה בועת אוויר לפיפט סוג 1 במהלך הזרקת הצבע, הוציאו את הבועה על ידי קירוב קצה פיפט סוג 2 אל הבועה, ולאחר מכן הפעלת לחץ שלילי חלש בעזרת המזרק המחובר.

לאחר ששוחררה כמות מספקת של צבע, הוצא את הפחית מסוג שתיים. לאחר מכן, דגור את הרקמה בחושך למשך שש עד 20 שעות, בהתאם לסוג הניסוי. לאחר שחלף זמן מספיק למילוי, משוך בעדינות את האלקטרודה מהרקמה.

לאחר מכן הרקמה מוכנה לדימיון או להיסטולוגיה. כאן מוצגת תרשים סכמטי המראה טעינה סימולטנית של שלושה צבעים פלואורסצנטיים שונים המצומדים לדקסטראן אל נוירונים מוטוריים, נוירונים תחושתיים אפרנטיים ונוירונים אינטר-ספינליים; הנוירונים המוטוריים והנוירונים התחושתיים הסקרליים האפרנטיים מולאו לאחור (backfilled) בעזרת Cascade blue Dextran ו-Texas red dextran דרך השורשים הוונטרליים והדורסליים, בהתאמה. Dextran פלואורסצנטי ירוק נטען לנוירונים אינטר-ספינליים שהאקסונים שלהם עולים דרך ה-ventral funiculus.

מוצגת כאן תמונה קונפוקלית של חתך מהחוט השדרה הסקראלי שבו בוצע סימון רטרוגרדי של הנוירונים. שימו לב כי התחושתיים האפרנטים המסומנים הם בעיקר איפסילטרליים. לצד מספר השלחות קונטרלטרליות, הנוירונים המוטוריים המסומנים הם איפסילטרליים לשורש הוונטרלי הממולא, בעוד שהנוירונים הביניים (interneurons) המסומנים הם קונטרלטרליים לו, כפי שמוצג על ידי ראש החץ.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות כדי לענות על שאלות מפתח כגון קישוריות תפקודית, איזון מעכב-מעורר, סוג הסינוס, ההפצה, וייצור נוירוטרנסמיטורים בנוירונים של שדה ה-DI. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירופיזיולוגיה של חוט השדרה וגזע המוח לסמן אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות באמצעות צבעים רגישים ליונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן היישום של צבעים פלואורסצנטיים ו/או צבעים רגישים ליונים בנוירונים ובסיבים תחושתיים בחוט שדרה מבודד.