ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway
23 ביולי 2012
אנו מתארים אסטרטגיה לפקח התבגרות והגירה של תאים דנדריטים ריאה בתגובה ovalbumin בסביבה של דלקת דרכי הנשימה הנגרמת ovalbumin אלרגית. אסטרטגיה זו ניתן לשנות על מנת להעריך ההגירה של תאים דנדריטים ריאתי ההגדרות של זיהום.
מטרת הליך זה היא להעריך את הבשלת התאים הדנדריטיים (DC) בריאות ואת הגירתם במהלך דלקת דרכי נשימה אלרגית המושרה על ידי Val Boomin בעכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי רגישות של העכברים ל-Val Boomin, ולאחר מכן חשיפה של דרכי הנשימה ל-Val Boomin המסומן ב-fitsy. לאחר מכן, נאספים הריאות וקשרי הלימפה mediastinal.
לבסוף, מוכנה תרחף של תאים בודדים מרקמות הריאה וקשרי הלימפה. בסופו של דבר, ניתן להעריך באמצעות אנליזת ציטומטריה זרימה את מצב הבשלות ומספר התאים המוחלט של תאי דנדריטיים בבלתם שנמצאו בקשרי הלימפה המדיאסטינליים לאחר אתגר FITC Val Boomin. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בנוגע לתגובות חיסוניות ריאתיות, כגון האם תאים דנדריטיים עוברים בשלות בעקבות חשיפה לאנטיגן, והאם הם נודדים לקשרי הלימפה הרלוונטיים.
ובמידה והם אכן נודדים, מהו קצב הנדידה. התחילו בהוספה של תמיסת Val Boomin שהוכנה טרייה, בטיפות וביחס של אחד לאחד לשפופרת המכילה alum תוך כדי ערבוב ב-vortex. ערבבו את התערובת במשך 30 דקות ולאחר מכן מלאו מזרק של 1 ml ב-0.2 ml מהתערובת.
באמצעות האגודל והאצבע המורה של יד אחת, אחזו את העכבר המיועד להזרקה באזור העורף קרוב לבסיס הגולגולת. לאחר מכן, השריצו בעזרת היד השנייה את תמיסת ה-Val Boomin alum לחלל הפריטוני של העכבר. שבעה ימים לאחר ההזרקה השנייה של Val ב-alum, החזיקו בעמידה בעל חיים שהורדם והורגש ל-val ב-alum, ולאחר מכן, בעזרת טיפים של פפט סטרילית, טפטפו 100 microliters של תמיסת val in fxi שהוכנה זה עתה אל ה-NAS של העכבר.
התחילו בחיבור קטטר במידה 20 למזרק של מילליטר אחד. לאחר אישור מותו של העכבר (euthanasia), פתחו את חלל בית החזה של בעל החיים עד לצוואר כדי לחשוף ולהחדיר קנולה לטרכיאה של העכבר. קריטי ביותר לבצע שטיפה (lavage) של הריאות ופרפוזיה של הלב כדי לוודא שכל המקפגים האלבולריים (alveolar macrophages) והתאים החד-גרעיניים המזהמים הנוכחים בדם הפריפרי הוסרו.
ודאו כי שני השלבים הבאים מבוצעים בזהירות וכמובן, ביד יציבה. כעת, הגשילו PBS קר מאוד עם EDTA שלוש פעמים דרך הקטטר כדי לשטוף את דרכי הנשימה התחתונות ולהסיר תאים מהחללים האלveאולריים. לאחר מכן, לאחר התאמת מזרק של 10 מיליליטר עם מחט בכילוי 20, בצעו פרפוזיה לריאות עם 10 מיליליטר של PBS המכיל heparin דרך החדר הימני של הלב.
הסרת תאי דם שנותרו מכלי הדם של הריאות נחשבת לשלמה כאשר הריאות הופכות ללבנות. לאחר מכן, הסר את קשרי הלימפה של המדיאסטינום והנח אותם בצלחת נפרדת. מנע כיבוי פלואורסצנציה (quenching) על ידי צמצום החשיפה של הרקמה לאור.
לאחר מכן, נתחו את הריאות שפרופו אותן והניחו אותן בצלחת פטרי; קצצו את הריאות באמצעות מספריים. לאחר מכן, עובבו את רקמת הריאה בטמפרטורה של 37 °C בריכוז של 250 units/mL של collagenase D. לאחר 25 דקות של דגירה, הוסיפו EDTA לתערובת למשך חמש דקות כדי לעצור את פעילות ה-collagenase. לבסוף, העבירו את שברי הריאות המעובבות דרך מסנן תאים של 100 micron ובצעו ליזיס של האריתרוציטים באמצעות באפר היפוטוני.
הפרידו את קשרי הלימפה המדיאסטינליים באמצעות מחטים עדינות ועובבו אותם באמצעות קולגנאז, כפי שהודגם זה עתה עבור הריאות, ולאחר מכן סננו את הרקמה דרך מסנן תאים בעקבות הזרקה תוך-peritoneal, רגישות ומסלול נשימה. Val באתגר. ניתן להעריך את נוכחותם של תאים דלקתיים באמצעות צביעת hemat, toin ואוזין בחתכים מייצגים של ריאות מקבוצת הביקורת.
בבעלי חיים שטופלו בתמיסת מלח, הרקמות נטולות דלקת, כפי שמוצג בגרפיקה העליונה. לעומת זאת, תאים דלקתיים נפוצים בכל רחבי נתיבי הריאה מ-Val בבעלי חיים שעברו רגישן ואתגר, כפי שניתן לראות למטה. בגרפיקה, ניתן להשתמש בצביעת periodic acid shift כדי להעריך ייצור מוקוס, כפי שמוצג בגרפיקה התחתונה זו.
השראת דלקת אלרגית בדרכי הנשימה בעקבות אתגר ב-val בעכברים שרוגשו ל-val מאושרת על ידי נוכחות של ריר. לעומת זאת, היעדר מוחלט של ייצור ריר נצפה בעכברי ביקורת שטופלו במי מלח, כפי שמוצג בגרפיקה העליונה. בעקבות אתגר ב-val, תאי dcs ריאתיים עוברים הבשלה ונדידה עוקבת לקשרי הלימפה המנקזים.
כאן מוצג ניתוח מייצג של קשרי לימפה מדיאסטינליים בעכברים, המראה כי זוהתה עלייה צנועה אך עקבית בשיעור התאים החיוביים ל-CD 11 C בעקבים שהורגשו ונחשפו ל-Val Boomin בהשוואה לעכברים שטופלו במי מלח. יתרה מכך, ניתוח מספר התאים המוחלט של תאים חיוביים ל-CD 11 C, CD 11 B ו-Val Boomin fits מקשרי הלימפה המדיאסטינליים בעכברים שהורגשו ונחשפו, מראה כי בעכברים שנחשפו מתרחשת עלייה הגבוהה פי כמה במספר ה-DC בהשוואה לבעלי חיים שטופלו במי מלח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לנו הבנה טובה מאוד של הטכניקה לניתוח הבשלת תאי דנדריטיים ריאתיים וכן של נדידתם.
ברגע שתבינו היטב טכניקה זו, תוכלו להמשיך ולשנות אותה כדי להעריך תגובות של תאי דנדריטיים ריאתיים לפתוגנים אחרים וכן לגורמים ניסיוניים אחרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתווה שיטה להערכת הבשלתן ונדירתן של תאים דנדריטיים ריאתיים בתגובה לאובאלבומין במהלך דלקת אלרגית של דרכי הנשימה. ניתן להתאים גישה זו לחקר התנהגותם של תאים דנדריטיים בהקשרי זיהום שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- מחקר אלרגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- תאים דנדריטיים ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- הבנת נדידתם והבשלתם חיונית למחקר על אלרגיות.
- Ovalbumin משמש באופן נפוץ להשראת תגובות אלרגיות במודלים ניסיוניים.
- מחקר זה מתמקד בתגובה החיסונית הריאתית בעכברים.
מטרת המחקר
- להערכת מצב הבגרות של תאי דנדריטיים ריאתיים.
- לבחינת נדירת תאים אלו לקשרי לימפה במהלך דלקת אלרגית.
- לספק תובנות לגבי הדינמיקה של תגובות תאי דנדריטיים לאלרגנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עכברים עוברים רגישות לאובאלבומין.
- אתגר דרכי הנשימה מבוצע באמצעות אובאלבומין המסומן ב-FITC.
- הריאות וקשרי הלימפה של המדיאסטינום נאספים לאחר האתגר.
- ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה מבוצע על תרחיפי תאים בודדים.
תוצאות עיקריות
- השגת הערכה של מצב הבשלת התאים הדנדריטיים.
- ניתוח דפוסי נדירה של תאים דנדריטיים לקשרי לימפה.
- מענה לשאלות מרכזיות בנוגע לתגובות חיסוניות.
- הממצאים תורמים להבנת דלקת דרכי נשימה אלרגית.
מסקנות
- השיטה מנטרת ביעילות את התנהגות התאים הדנדריטיים בתגובות אלרגיות.
- התובנות שיירכשו עשויות לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות לאלרגיות.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למחקר על מחלות זיהומיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת הבשלת תאי דנדריטיים והגירה שלהם היא קריטית להפחתת סיכונים באימות מטרות (target validation) בתהליכי גילוי תרופות מונחי-אימונולוגיה. שיטה זו מספקת תוצאים כמותיים המבוססים על ציטומטריה של זרימה, המאפשרים תובנה מכניסטית לגבי מודלים של דלקת דרכי נשימה אלרגית. היא תומכת בביטחון ניבוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור חשיפה לאנטיגן לדינמיקה של תאי מערכת החיסון הרלוונטית לטיפולים באסמה ובאלרגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של נתיבי הפעלה של תאי דנדריטיים בתגובה לחשיפה לאנטיגן.
- ערך תפעולי: מספק מדדים סטנדרטיים להערכת קינטיקה של הבשלה ונדידה של תאי מערכת החיסון.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת היפותזות של מטרות טיפוליות המעורבות בתגובות חיסוניות המתווכות על ידי תאים דנדריטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים הניתנים לשחזור על פנוטיפים של תאי דנדריטיים באמצעות סממנים מוגדרים.
- ערך תפעולי: מכונן פלטפורמת בדיקה ניתנת להעברה לניטור תנועה של תאי מערכת החיסון במודלים של רקמת ריאה.
- מוכנות הבדיקה: התוצאים תואמים לניתוח בעל תוכן גבוה (high-content analysis) ולסטנדרטיזציה בין מעבדות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין הפעלת מערכת החיסון המולדת לבין התניית תגובה חיסונית נרכשת במערכת הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב אורך של תגובות חיסוניות משלב הרגישות (sensitization) ועד לשלבי החשיפה (challenge).
- רצף תרגומי: מאפשר הערכה של תפקוד תאים דנדריטיים במודלים פרה-קליניים לאלרגיה, בהתאמה לסמנים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילויים האימונולוגיים, ותומכת החל משלב תיקוף המטרה המוקדם ועד להסרת סיכונים מכניסטיים בשלב הפרה-קליני במחקר על אלרגיה ואסתמה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקה מבוססת היפותזה של תגובות תאי דנדריטיים ספציפיים לאנטיגן ושל מודולציה של מסלולים.
- סריקה: מספק תוצאות קוואנטיטביות סטנדרטיות להבשלה ולנדידה של תאי חיסון תחת תנאים מבוקרים.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של שכיחות תאים דנדריטיים ומצבי הפעלה בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דינמיקה חיסונית תאית לבין הפעלת תאי T ותוצאות דלקתיות ברקאות.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לאלרגנים, פתוגנים או תרכובים אימונומודולטוריים מרובים במסלולי גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במודלים של מחלות ממשקיות באמצעות ויזואליזציה ישירה של התנהגות תאי דנדריטיים.
- ערך תפעולי: מקדם שחזור של בדיקות וסנכרון רב-תחומי בין צוותי אימונולוגיה ופרמקולוגיה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת תוצאות אימונולוגיות מוקדמות הקשורות לפנוטיפים קליניים כמו דלקת בדרכי הנשימה וייצור ריר.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים על בסיס השפעתם על הבשלה ונדידה של תאי דנדריטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונולוגיה של עכברים, איסוף רקמות ותכנון פאנלים לציטומטריה זרימה.
- תלוי בגישה למערכות עיכול באמצעות קולגןאז, מסנני תאים וציוד למיון תאים מופעל פלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי רגישות לאנטיגן ואתגרי (challenge) בין מעבדות.
- התאמה למערכות מודל חלופיות עשויה לדרוש אופטימיזציה של עיכול הרקמה ושל פאנלי הסמנים.
- רגישותו של אנטיגן המסומן ב-FITC לאור מחייבת טיפול זהיר בדגימות כדי למנוע כיבוי (quenching) של האות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Sensitizing and Intranasal Challenge of Mice with Ovalbumin
2:39
Preparation of Single-cell Suspension from the Lungs and the Draining Lymph Nodes
5:37
Results: OVA Sensitization and Challenge Induces an Increase in CD11c+ Cell Trafficking to Murine Mediastinal Lymph Nodes
7:33
Conclusion
