ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

מטרת הליך זה היא להעריך את ההתבגרות והנדידה של תאים דנדריטיים ריאתיים או DC במהלך דלקת אלרגית בדרכי הנשימה הנגרמת על ידי ואל בומין בעכברים. זה מושג על ידי רגישות העכברים תחילה עם Val Boomin, ולאחר מכן אתגר דרכי הנשימה עם תווית Val Boomin. לאחר מכן, נקצרים הריאה ובלוטות הלימפה המדיאסטינליות.

לבסוף, מכינים תרחיף תא בודד מרקמות הריאה ובלוטות הלימפה. בסופו של דבר, ניתן להעריך את מצב ההתבגרות ומספר התאים המוחלט של תאים דנדריטיים הנמצאים בבלוטת הלימפה המדיאסטינלית לאחר אתגר FITC Val Boomin על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח לגבי תגובות חיסוניות ריאתיות, כגון האם תאים דנדריטיים עוברים התבגרות, ירידה בחשיפה לאנטיגן והאם הם נודדים לבלוטות הלימפה המדורגות.

ואם הם אכן מהגרים, אז מה קצב ההגירה. התחל בהוספת תמיסת Val Boomin טרייה שהוכנה Dropwise ביחס של אחד לאחד בשפופרת של אלום תוך כדי מערבולת. מערבבים את התערובת במשך 30 דקות ואז ממלאים מזרק מיליליטר אחד ב 0.2 מיליליטר מהתערובת.

בעזרת האגודל על האצבע המורה של יד אחת, אחוז בעכבר שיוזרק על ידי שאריות הצוואר קרוב לבסיס הגולגולת. לאחר מכן הזרקו את תמיסת האלום Val Boomin לחלל הצפק של העכבר ביד השנייה. שבעה ימים לאחר ההזרקה השנייה של Val באלום, החזק val מורדם בבעל חיים רגיש לאלום במצב זקוף, ולאחר מכן השתמש בקצות פיפטה סטריליות 100 מיקרוליטר ובתמיסת val in fxi שהוכנה טרייה על ה-NAS של העכבר בצורה טיפתית.

התחל בחיבור קטטר בגודל 20 למיליליטר אחד של מזרק. לאחר מכן, לאחר אישור המתת חסד של העכבר, פתח את חלל בית החזה של החיה עד הצוואר כדי לחשוף ולשרוף את קנה הנשימה של העכבר. זה קריטי לחלוטין לשטוף את הריאות ולהעשיר את הלב כדי לוודא שכל המקרופאגים המכתשית המזהמים והתאים החד-גרעיניים הנמצאים בדם ההיקפי הוסרו.

והקפידו לבצע את שני השלבים הבאים בזהירות וכמובן ביד יציבה. כעת יש לתת PBS קר כקרח עם EDTA שלוש פעמים דרך הצנתר כדי לשטוף את דרכי הנשימה התחתונות ולהסיר תאים מהחללים המכתשית. לאחר מכן, לאחר התאמת מזרק של 10 מיליליטר עם מחט בגודל 20, יש לחלחל את הריאות עם 10 מיליליטר PBS המכיל הפרין דרך החדר הימני של הלב.

הסרת כל תאי הדם שנותרו מכלי הדם של הריאה נחשבת למושלמת כאשר הריאות הופכות לבנות. לאחר מכן, הסר את בלוטות הלימפה המדיאסטינליות והניח אותן בצלחת נפרדת. מנע כיבוי התאמה על ידי מזעור החשיפה לאור של הרקמה.

לאחר מכן מנתחים את הריאות המוחדרות ומניחים אותן בצלחת פטרי בעזרת מספריים טוחנים את הריאות. לאחר מכן, עכל את רקמת הריאה ב-37 מעלות צלזיוס ב-250 יחידות למיליליטר קולגנאז D.לאחר 25 דקות של דגירה, הוסף EDTA לתערובת למשך חמש דקות כדי להפסיק את פעילות הקולגנאז. לבסוף, העבירו את שברי הריאות המעוכלות דרך מסננת תאים של 100 מיקרון ושוכבים את האריתרוציטים עם חיץ היפוטוני.

להפריד את בלוטות הלימפה המדיאסטינליות באמצעות מחטים עדינות ולעכל אותן עם קולגנאז כפי שהודגם זה עתה עבור הריאות, ולאחר מכן לסנן את הרקמה דרך מסננת תאים לאחר תוך צפק, רגישות ודרכי הנשימה. ואל באתגר. ניתן להעריך את נוכחותם של תאים דלקתיים על ידי צביעת המט, טואין ואאוזין בקטעי ריאה מייצגים מבקרה.

בעלי חיים שטופלו במי מלח, הרקמות נטולות דלקת כפי שמודגם בגרפיקה העליונה. לעומת זאת, תאים דלקתיים נפוצים בכל חלקי הריאה מוואל בבעלי חיים רגישים ומאותגרים כפי שניתן לראות בתחתית. ניתן להשתמש בצבע גרפי תקופתי של הסטת חומצה כדי להעריך את ייצור הריר כפי שמוצג בגרף התחתון הזה.

השראת דלקת אלרגית בדרכי הנשימה בעקבות val באתגר ב-Val בעכברים רגישים מאושרת על ידי נוכחות ריר. לעומת זאת, היעדר מוחלט של ייצור ריר מוצג על ידי שליטה. עכברים שטופלו במי מלח כפי שמודגם בגרף העליון לאחר val באתגר dcs ריאתי עוברים התבגרות ונדידה לאחר מכן לבלוטות הלימפה המנקזות.

כאן ניתוח מייצג של בלוטות לימפה מדיאסטינליות בעכברים מראה כי עלייה צנועה אך עקבית בשיעור התאים החיוביים CD 11 C מזוהה בבעלי חיים רגישים ומאותגרים עם Val Boomin בהשוואה לעכברים שטופלו במי מלח. יתר על כן, ניתוח מספר התאים המוחלט של CD 11 C חיובי CD 11 B Val Boomin מתאים לתאים חיוביים C מבלוטות הלימפה המדיאסטינליות של Val בעכברים רגישים ומאותגרים מראה כי עלייה גבוהה פי כמה במספרי DC מתרחשת בעכברים מאותגרים בהשוואה לבעלי חיים שטופלו במי מלח. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אנחנו אמורים להבין טוב מאוד את הטכניקה שלנו לניתוח התבגרות תאים דנדריטיים ריאתיים, כמו גם נדידה.

וברגע שאתה באמת מבין את הטכניקה הזו, אתה יכול להמשיך ולשנות אותה כדי להעריך את תגובות התאים הדנדריטיים הריאתיים לפתוגנים אחרים כמו גם לגורמים ניסיוניים אחרים.