Name: ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: חקור את הבגרות והנדידה של תאי דנדריטיים בריאות בעכברים במהלך דלקת דרכי נשימה אלרגית. השיטה משתמשת באובלומין וניתוח זרימה כדי להעריך תגובות חיסוניות ריאתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקים CIHR ו CF קנדה ד&quot;ר ג&#39;ים הו על ידי studentship PhD הוענק רהול Kushwah ידי CF קנדה.

1. רגישות של עכברים עם Ovalbumin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של OVA (V בכיתה; Sigma, MO) ב סטרילית PBS בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להכין OVA-אלום התערובת, קח אלום בצינור ולהוסיף פתרון OVA באופן dropwise תוך vortexing צינור ביחס של 1:1. מערבבים את התערובת במשך 30 דקות ולהשתמש מיד לאחר ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל, להזריק 0.2 מ&quot;ל של התערובת לתוך חלל הצפק העכבר ולחזור על הזריקה שוב לאחר 2 שבועות. </li></ol> 2. האתגר של אפי עכברים עם Ovalbumin תווית FITC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 ימים לאחר ההזרקה השנייה של אלום-OVA, עכברים מוכנים לערער intranasally עם OVA-FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של OVA-FITC (Sigma) באמצעות PBS סטרילית בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו חנות aliquots ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים גזה סטרילית בחלק התחתון של 50 מ&quot;ל בז צינור וב h כימיOOD, מוסיפים 5 מ&quot;ל של Aerrane על גזה. על מנת להרדים עכברים, לכוון את בעל החיים לתוך הצינור של כ 5-10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את בעל החיים מורדם בתנוחה זקופה ושימוש טיפים פיפטה סטרילית, μl 100 פיפטה של ​​פתרון OVA-FITC על גבי nares של עכברים בצורה טיפה חכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על האתגר אפי עם OVA-FITC ביומיים הקרובים. </li></ol> 3. הכנת תרחיף תא יחיד מן הריאות ואת בלוטות הלימפה וניקוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים באמצעות הזרקת intraperitoneal של Euthanyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להקטין את זיהום מקרופאג, מה שעלול לסבך את ניתוח DC, שטיפה ריאה מתבצע. כדי שטיפה של הריאות, וקנה הנשימה עכבר נחשפים לרגע cannulated עם קטטר ו מזרק, באמצעות קר כקרח PBS עם 5 mM EDTA, מערכת הנשימה התחתונה לשטוף 3 פעמים כדי להסיר את התאים מן החללים מכתשיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הריאות עם 10 מ&quot;ל של PBS המכיל 10 U / ml heparבכל דרך החדר הימני של הלב, כדי להסיר כדוריות דם בכלי הדם של הריאות. בצע את perfusions עד הריאות להפוך לבן, מעיד על הסרת ביותר של כדוריות הדם. זה חשוב במיוחד להסרת תאים מזהמים מן הדם ההיקפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הריאות החוצה להסיר בלוטות הלימפה mediastinal (mln) ולמקם את בלוטות הלימפה צלחת נפרדת. (נסו לצמצם את החשיפה של רקמות להדליק למנוע מרווה FITC של הקרינה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הריאות על צלחת פטרי ו לרכך באמצעות מספריים. הבא לעכל את הריאות במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות 250 U / ml collagenase ד &#39;(רוש) ולהוסיף EDTA (10 mM הריכוז הסופי) במשך 5 הדקות הבאות להפסיק פעילות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את שברי הריאות מתעכל דרך מסננת 100 מיקרומטר התא ולבצע תמוגה hypotonic להסיר אריתרוציטים. ההשעיה תא בודד הוא מוכן לניתוח נוסף של DCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להכין את ההשעיה תא בודד מתוך mln, לאלהקל על mln באמצעות מחטים דקות ולעכל עם collagenase כמתואר לעיל ולאחריה מאמץ דרך מסננת התא. </li></ol> 4. מכתים עבור DC סמנים להעריך מטורציה / הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לזהות DCS בריאות, מכתים מבוצע CD11c ו CD11b. יתר על כן להעריך על התבגרות, מכתים מבוצע CD86 ו CD80, אשר שהוגברו כמו DCS עוברים התבגרות. CD11c + CD11b + OVA-FITC תאים + ב mln מזוהים DCS ריאתי נודדות מהריאות mln בתגובה לאתגר דרכי הנשימה OVA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות תאים בריכוז של 10 x 10 6 תאים למ&quot;ל ב FACS חיץ (PBS עם 1% FBS ו 1 מ&quot;מ EDTA) ו 150 aliquot μl ההשעיה תא / צינור עבור מכתים FACS. זיהוי של DCS ריאה, כתמים הבאים נדרשים: שליטה בלא כתם (לתאי ריאה מעכברים שלא נחשפו OVA-FITC), OVA-FITC שליטה, בקרה CD11c אחד, CD11b בקרה אחד, CD11b+ + CD11c בקרה כפולה, CD11b + OVA-FITC + שליטה כפולה, CD11c + OVA-FITC + כפול שליטה, MHC II בקרה אחד, שליטה יחיד CD86, CD80 שליטה יחיד דגימות מוכתם עבור OVA-FITC + + CD11c CD11b + + MHCII , OVA-FITC + + CD11c CD11b + CD86 + ו-OVA FITC + + CD11c CD11b + CD80 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ההגירה DC, לבצע ספירת תאים מוחלטים של השעיה תא בודד מתוך mln ולאחר מכן להכין את הצינורות הבאים: שליטה בלא כתם (תאים mln של עכברים שלא נחשפו OVA-FITC), OVA-FITC בקרה, CD11c + שליטה יחיד, CD11b + בקרה כפולה, CD11b + OVA-FITC + כפול שליטה, CD11c + OVA-FITC + כפול מלאה CD11c + CD11b + OVA-FITC דגימות +. </li></ol> 5. נציג תוצאות את נקודות הזמן הנדרש רגישות intraperitoneal לגרום לדלקת דרכי הנשימה אלרגית חשוב וצריך להתבצע כפי מתואר באיור 1. בעקבות רגישות intraperitoneal ו OVA אתגר דרכי הנשימה, כדי לאשר גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית, עכברים כמה אפשר להקריב וניתוח היסטולוגית יכול להתבצע על החלקים ריאה כפי שמוצג באיור 2. הנוכחות של תאים דלקתיים שניתן לאשר על ידי Hematoxylin &amp; Eosin הכתם (איור 2 א) ונוכחות של ייצור ליחה ניתן להעריך על ידי תקופתיים, חומצה שיף הכתם (איור 2 ב). בסך הכל זה יהיה לאשר גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית בעקבות האתגר של OVA OVA רגיש עכברים 8. לעומת זאת, חלקים מן ריאות בעכברים שטופלו מלוחים צפויים להיות ללא כל דלקת, יחד עם העדר כל ייצור ריר. יתר על כן, האתגר OVA הבאה, ריאות DCS unde<html> RGO התבגרות והגירה לאחר ניקוז בלוטות הלימפה. ניתוח CD11c + תאים בקשרי הלימפה mediastinal (mln) מעכברים רגישים ו תיגר עם OVA צפויה להראות שיעור גבוה יותר של תאים CD11c + לעומת מלוחים שטופלו עכברים (איור 3 א). יתר על כן, ניתוח של ספירת תאים המוחלט של CD11c + CD11b + OVA-FITC + תאים mln של עכברים OVA רגיש וקרא תיגר, צפוי להראות באופן משמעותי גבוה יותר (כלומר פי כמה וכמה יותר) מספר כי עמיתיהם מן העכברים שטופלו מלוחים ( איור 3 ב). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig1.jpg" /> באיור 1. פרוטוקול ניסיוני לזירוז של ovalbumin (OVA) דלקת דרכי הנשימה הנגרמת על אלרגיות אצל עכברים יחד עם האתגר דרכי הנשימה עם FITC ovalbumin שכותרתו (OVA-FITC). fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. רגישות OVA ואחריו אתגר דרכי הנשימה OVA מובילה גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית כמו מזוהה על ידי צביעה Hematoxylin &amp; Eosin סעיפים ריאה המוצגים () וגם מוביל ייצור ליחה בדרכי הנשימה מזוהה על ידי צביעה שיף תקופתיים חומצה הריאה חלקים, כפי שמוצג (ב &#39;). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig3.jpg" /> איור 3. OVA-FITC אתגר גורם ההגירה DC מהריאות אל קשרי הלימפה mediastinal (mln). (א) מגרשים cytometry זרימה המתאר את הפרופורציות של CD11c + תאים mln שליטה או OVA רגיש עכברים. (ב) מונה מוחלטים של CD11c + CD11b + OVA-FITC תאים + ב mln של עכברים מלוחים או OVA-רגיש. * P &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4014/4014fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> .

<ol><li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dendritic+cells+in+the+induction+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells.</a> Cell Biosci. 20, (2011).</li>
<li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+of+dendritic+cell+subsets+and+their+function+in+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system.</a> Immunology. 133, 409-419 (2011).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+our+breath+away%3A+dendritic+cells+in+the+pathogenesis+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma.</a> Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).</li>
<li>Hammad, H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+epithelial+cells%3A+linking+innate+and+adaptive+immunity+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).</li>
<li>Lloyd, C. M., Murdoch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerizing+allergic+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tolerizing allergic responses in the lung.</a> Mucosal. Immunol. 3, 334-344 (2010).</li>
<li>Herz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+murine+animal+models+to+study+the+development+of+allergic+bronchial+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma.</a> Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).</li>
<li>Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+animal+models+to+study+the+central+role+of+T+cells+in+immediate-type+hypersensitivity+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).</li>
<li>Nakae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+can+contribute+to+multiple+features+of+ovalbumin-induced+allergic+inflammation+of+the+airways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).</li>
<li>Guth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+environment+determines+unique+phenotype+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).</li>
<li>Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pulmonary+T+cell+response+to+helper-dependent+adenoviral+vectors+following+intranasal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery.</a> J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).</li>
<li>Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+dendritic+cells+induce+tolerance+in+mice+through+suppression+of+dendritic+cell+maturation+and+induction+of+antigen-specific+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells.</a> J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השיטה המוצגת כאן מציעה cytometry זרימת הגישה מבוססת על ניתוח DCS ריאתי, המבוססים על משלוח של OVA-FITC לאתגר דרכי הנשימה. זה מאפשר ניטור סלקטיבי של DCS ריאתי, אשר תופסים OVA-FITC ולכן האוכלוסיות DC, אשר נמצאות תחת פיקוח הם למעשה אלה המשתתפים בתגובה החיסונית דרכי הנשימה במהלך OVA דלקת דרכי הנשימה הנגרמת אלרגית. בעכברים שליטה, בהעדר דלקת דרכי הנשימה אלרגית, מספר DCS נודדות (OVA-FITC + DCS) שזוהו mln מעידים על שיעורי הבסיס של DC הגירה, המאיצה בתגובה לדלקת דרכי הנשימה אלרגית והתוצאה הי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Ovalbumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5503 </td></tr><tr><td> צריף </td><td> Thermo Scientific </td><td> 77161 </td></tr><tr><td> OVA-FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9771 </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> רוש </td><td> 11088858001 </td></tr><tr><td> נוגדנים </td><td> דואר Bioscience </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של התבגרות ריאתי cell migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית airway

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

תאים דנדריטים (DCS) הם השחקנים המרכזיים המעורבים בייזום של תגובה חיסונית אדפטיבית ידי הפעלת אנטיגן ספציפי בתאי T. DCS נמצאים ברקמות הפריפריה במצב יציב, אולם בעקבות גירוי אנטיגן, DCS לקחת את האנטיגן במהירות נודדים אל קשרי הלימפה שם הם מרוקנים ליזום בתגובה תא T נגד 1,2 אנטיגן. בנוסף, DCS גם לשחק תפקיד מרכזי בייזום תגובה חיסונית אוטואימונית, כמו גם אלרגי 3. DCS לשחק תפקיד חיוני הן ייזום של התגובה החיסונית אינדוקציה של סובלנות על רקע הסביבה ריאות 4. סביבה בריאה היא tolerogenic במידה רבה, בשל החשיפה מגוון רחב של אנטיגנים סביבתיים 5. עם זאת, אצל אנשים מסוימים יש הפסקה סובלנות, אשר מוביל אינדוקציה של אלרגיה ואסטמה. במחקר זה, אנו מתארים אסטרטגיה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפקח על דרכי הנשימה התבגרות הבירה מיגהמנה בתגובה לאנטיגן המשמש רגישות. מדידה של התבגרות DC דרכי הנשימה והגירה מאפשר הערכה של קינטיקה של התגובה החיסונית בזמן דלקת דרכי הנשימה אלרגית וגם מסייע בהבנת סדר הגודל של התגובה החיסונית לאחר מכן יחד עם המנגנונים. האסטרטגיה שלנו מבוססת על שימוש ovalbumin כסוכן רגישות. Ovalbumin-Induced אסתמה אלרגית היא מודל בשימוש נרחב להתרבות eosinophilia דרכי הנשימה, דלקת ריאות ו-IgE רמות שנמצאו במהלך אסטמה 6,7. לאחר רגישות, עכברים מאותגרים על ידי משלוח של אפי ovalbumin FITC שכותרתו, אשר מאפשר תיוג ספציפית של דרכי הנשימה אשר DCS ovalbumin ספיגת. לאחר מכן, באמצעות מספר סמנים הבירה מסוימים, אנחנו יכולים להעריך את ההבשלה של DCS אלה ניתן גם להעריך את הנדידה אל קשרי הלימפה וניקוז על ידי העסקת cytometry הזרימה.

אנו מתארים אסטרטגיה לפקח התבגרות והגירה של תאים דנדריטים ריאה בתגובה ovalbumin בסביבה של דלקת דרכי הנשימה הנגרמת ovalbumin אלרגית. אסטרטגיה זו ניתן לשנות על מנת להעריך ההגירה של תאים דנדריטים ריאתי ההגדרות של זיהום.

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

תאים דנדריטיים (DCs) הם השחקנים המרכזיים המעורבים בייזום התגובה החיסונית האדפטיבית על ידי הפעלת תאי T ספציפיים לאנטיגן. תאים דנדריטיים נמצאים ב...

מטרת הליך זה היא להעריך את הבשלת התאים הדנדריטיים (DC) בריאות ואת הגירתם במהלך דלקת דרכי נשימה אלרגית המושרה על ידי Val Boomin בעכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי רגישות של העכברים ל-Val Boomin, ולאחר מכן חשיפה של דרכי הנשימה ל-Val Boomin המסומן ב-fitsy. לאחר מכן, נאספים הריאות וקשרי הלימפה mediastinal.לבסוף, מוכנה תרחף של תאים בודדים מרקמות הריאה וקשרי הלימפה. בסופו של דבר, ניתן להעריך באמצעות אנליזת ציטומטריה זרימה את מצב הבשלות ומספר התאים המוחלט של תאי דנדריטיים בבלתם שנמצאו בקשרי הלימפה המדיאסטינליים לאחר אתגר FITC Val Boomin. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בנוגע לתגובות חיסוניות ריאתיות, כגון האם תאים דנדריטיים עוברים בשלות בעקבות חשיפה לאנטיגן, והאם הם נודדים לקשרי הלימפה הרלוונטיים.ובמידה והם אכן נודדים, מהו קצב הנדידה. התחילו בהוספה של תמיסת Val Boomin שהוכנה טרייה, בטיפות וביחס של אחד לאחד לשפופרת המכילה alum תוך כדי ערבוב ב-vortex. ערבבו את התערובת במשך 30 דקות ולאחר מכן מלאו מזרק של 1 ml ב-0.2 ml מהתערובת.באמצעות האגודל והאצבע המורה של יד אחת, אחזו את העכבר המיועד להזרקה באזור העורף קרוב לבסיס הגולגולת. לאחר מכן, השריצו בעזרת היד השנייה את תמיסת ה-Val Boomin alum לחלל הפריטוני של העכבר. שבעה ימים לאחר ההזרקה השנייה של Val ב-alum, החזיקו בעמידה בעל חיים שהורדם והורגש ל-val ב-alum, ולאחר מכן, בעזרת טיפים של פפט סטרילית, טפטפו 100 microliters של תמיסת val in fxi שהוכנה זה עתה אל ה-NAS של העכבר.התחילו בחיבור קטטר במידה 20 למזרק של מילליטר אחד. לאחר אישור מותו של העכבר (euthanasia), פתחו את חלל בית החזה של בעל החיים עד לצוואר כדי לחשוף ולהחדיר קנולה לטרכיאה של העכבר. קריטי ביותר לבצע שטיפה (lavage) של הריאות ופרפוזיה של הלב כדי לוודא שכל המקפגים האלבולריים (alveolar macrophages) והתאים החד-גרעיניים המזהמים הנוכחים בדם הפריפרי הוסרו.ודאו כי שני השלבים הבאים מבוצעים בזהירות וכמובן, ביד יציבה. כעת, הגשילו PBS קר מאוד עם EDTA שלוש פעמים דרך הקטטר כדי לשטוף את דרכי הנשימה התחתונות ולהסיר תאים מהחללים האלveאולריים. לאחר מכן, לאחר התאמת מזרק של 10 מיליליטר עם מחט בכילוי 20, בצעו פרפוזיה לריאות עם 10 מיליליטר של PBS המכיל heparin דרך החדר הימני של הלב.הסרת תאי דם שנותרו מכלי הדם של הריאות נחשבת לשלמה כאשר הריאות הופכות ללבנות. לאחר מכן, הסר את קשרי הלימפה של המדיאסטינום והנח אותם בצלחת נפרדת. מנע כיבוי פלואורסצנציה (quenching) על ידי צמצום החשיפה של הרקמה לאור.לאחר מכן, נתחו את הריאות שפרופו אותן והניחו אותן בצלחת פטרי; קצצו את הריאות באמצעות מספריים. לאחר מכן, עובבו את רקמת הריאה בטמפרטורה של 37 °C בריכוז של 250 units/mL של collagenase D. לאחר 25 דקות של דגירה, הוסיפו EDTA לתערובת למשך חמש דקות כדי לעצור את פעילות ה-collagenase. לבסוף, העבירו את שברי הריאות המעובבות דרך מסנן תאים של 100 micron ובצעו ליזיס של האריתרוציטים באמצעות באפר היפוטוני.הפרידו את קשרי הלימפה המדיאסטינליים באמצעות מחטים עדינות ועובבו אותם באמצעות קולגנאז, כפי שהודגם זה עתה עבור הריאות, ולאחר מכן סננו את הרקמה דרך מסנן תאים בעקבות הזרקה תוך-peritoneal, רגישות ומסלול נשימה. Val באתגר. ניתן להעריך את נוכחותם של תאים דלקתיים באמצעות צביעת hemat, toin ואוזין בחתכים מייצגים של ריאות מקבוצת הביקורת.בבעלי חיים שטופלו בתמיסת מלח, הרקמות נטולות דלקת, כפי שמוצג בגרפיקה העליונה. לעומת זאת, תאים דלקתיים נפוצים בכל רחבי נתיבי הריאה מ-Val בבעלי חיים שעברו רגישן ואתגר, כפי שניתן לראות למטה. בגרפיקה, ניתן להשתמש בצביעת periodic acid shift כדי להעריך ייצור מוקוס, כפי שמוצג בגרפיקה התחתונה זו.השראת דלקת אלרגית בדרכי הנשימה בעקבות אתגר ב-val בעכברים שרוגשו ל-val מאושרת על ידי נוכחות של ריר. לעומת זאת, היעדר מוחלט של ייצור ריר נצפה בעכברי ביקורת שטופלו במי מלח, כפי שמוצג בגרפיקה העליונה. בעקבות אתגר ב-val, תאי dcs ריאתיים עוברים הבשלה ונדידה עוקבת לקשרי הלימפה המנקזים.כאן מוצג ניתוח מייצג של קשרי לימפה מדיאסטינליים בעכברים, המראה כי זוהתה עלייה צנועה אך עקבית בשיעור התאים החיוביים ל-CD 11 C בעקבים שהורגשו ונחשפו ל-Val Boomin בהשוואה לעכברים שטופלו במי מלח. יתרה מכך, ניתוח מספר התאים המוחלט של תאים חיוביים ל-CD 11 C, CD 11 B ו-Val Boomin fits מקשרי הלימפה המדיאסטינליים בעכברים שהורגשו ונחשפו, מראה כי בעכברים שנחשפו מתרחשת עלייה הגבוהה פי כמה במספר ה-DC בהשוואה לבעלי חיים שטופלו במי מלח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לנו הבנה טובה מאוד של הטכניקה לניתוח הבשלת תאי דנדריטיים ריאתיים וכן של נדידתם.ברגע שתבינו היטב טכניקה זו, תוכלו להמשיך ולשנות אותה כדי להעריך תגובות של תאי דנדריטיים ריאתיים לפתוגנים אחרים וכן לגורמים ניסיוניים אחרים.

analysis-pulmonary-dendritic-cell-maturation-migration-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מדידות חוזרות של הפיזיולוגיה מכרסם הנשימה דגימה של תאים דלקתיים בדרכי האוויר רצויות, אבל בדרך כלל לא ריאלי. כאן אנו מתארים את שיטת הדיר עבור בעל פה intubating עכברים המאפשר מדידות חוזרות של דרכי הנשימה ואת hyperreactivity דגימה של תאים דלקתיים בדרכי האוויר.

הפיך, לא פולשני שיטת ההתנגדות מדידות דרכי הנשימה ואת נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית דגימה של עכברים

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

תאי חיסון שוכני ריאות, כולל תאים דנדריטיים (DCs) בבני אדם, הם קריטיים להגנה מפני פתוגנים ואלרגנים בשאיפה. עם זאת, בשל המחסור ברקמת ריאה אנושית, המחקרים מוגבלים. עבודה זו מציגה פרוטוקולים לעיבוד ביופסיות אנדוברונכיאליות ברירית אנושית לחקר DCs ריאתיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה וזרימה ציטומטרית.

האדם תאים דנדריטים ריאות: הפריסה המרחבית וזיהוי פנוטיפי ב Endobronchial ביופסיות שימוש אימונוהיסטוכימיה ו cytometry זרימה

אנו מתארים שיטה לייצור פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS) ו immunostaining להם לדמיין את הלוקליזציה של סוגי תאים שונים חיסוניים הבריא. פרוטוקול שלנו ניתן להאריך לדמיין את המיקום והתפקוד של סוגי תאים שונים תחת מגוון של תנאים.

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

מטרת המאמר הנוכחי היא לספק תיאור מפורט של נהלים מומלצים כדי להעריך את תפקוד מערכת הנשימה בעכברים בהכרה מאת כפול-תא plethysmography.

הערכה של תפקוד מערכת הנשימה בעכברים בהכרה על ידי כפול-תא Plethysmography

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בציטומטריה של זרימה כדי לזהות את השינויים בהרכב תאי מערכת החיסון, בפרופיל הציטוקינים ובפרופיל הכימוקין בסביבה הריאתית לאחר חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי, מודל מוריני של שבץ איסכמי.

אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית

כאן אנו מספקים פרוטוקול לסינון גורמי שעתוק פוטנציאליים המעורבים בפיתוח של תא דנדריטי (DC) באמצעות transduction lentiviral של shRNA כדי להשיג קווי תא נוק-אאוט יציבים עבור בידול במבחנה DC.

מחקר של התפתחות תאים דנדריטיים על ידי קצר סיכות ראש RNA מתווך RNA נוקאאוט גזע הגבעול Hematopoietic וקו תא האב הקדמה במבחנה

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

חקור את הבגרות והנדידה של תאי דנדריטיים בריאות בעכברים במהלך דלקת דרכי נשימה אלרגית. השיטה משתמשת באובלומין וניתוח זרימה כדי להעריך תגובות חיסוניות ריאתיות.

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

גלה סרטונים נוספים