ב electroporation לג'ימי של המוח התיכון צ'יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין
3 באוגוסט 2012
כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה המערבת ב לג'ימי Electroporation של מבנים DNA פלסמיד לתוך עובריים הגחון חומוס המוח התיכון אבות נוירונים דופאמין. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להשיג ביטוי יעיל של גנים בעלי עניין לחקור היבטים שונים של התפתחות המוח התיכון והבחנה נוירון דופאמין.
ניסוי זה מדגים אלקטרופורציה in ovo של המוח האמצעי בעובר אפרוח כדי לבחון את השפעתה של ביטוי גנים חיצוניים על התפתחות המוח האמצעי ועל התמיינות נוירונים דופמינרגיים. ראשית, מזריקים למוח האמצעי של עוברי אפרוח בשלב 11 לפי סולם Hamilton את הפלסמיד הרצוי, DNA, כדי לכוון באופן ספציפי DNA חיצוני אל תוך שלפוחית המוח האמצעי המתפתחת. לאחר מכן, באמצעות אלקטרודות קטנות מתוכננות, מבצעים אלקטרופורציה לשלפוחית המוח האמצעי כדי להחדיר את ה-DNA החיצוני באופן ספציפי אל תוך התאי הגזע העצביים של המוח האמצעי.
בשלב הבא, קצרו עוברים בשלב 23 עם ביטוי טוב של M cherry במוח האמצעי והכינו חתכים רוחביים אופטימליים של המוח האמצעי. לבסוף, ניתוח של צביעה אימונוהיסטוכימית לסממנים של נוירונים דופמינרגיים, כגון tyrosine hydroxylase, יכול להראות את ההבדלתו של תאי מוצא עצביים לנוירונים דופמינרגיים בוגרים שהודעת על ידי ביטוי של הגנים הנחקרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות של electroporation in ovo הוא שפרוטוקול זה יכול להשיג electroporation ספציפי לממברנה כדי לחקור את הבחירה של נוירונים דופמינרגיים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות אמצע המוח, ניתן להחיל אותה גם על חלקים אחרים של מערכת העצבים לצורך ביצוע אנליזת מיפוי גורל (fate mapping), ולחקירת הבקרה על ביטוי גנים. כדי להשיג עוברים של hamburger Hamilton, שלב 11, מקמו כל ביצית מופרית על צדה וסמנו את החלק העליון בקו קצר בעיפרון. לאחר מכן, הניחו את המגשים על נדנדה (rocker) בתוך אינקובטור לח ומחומם מראש.
בדקו את הלחות ואת מפלס המים בכל 24 שעות, במועד של 41 שעות לאחר ההפריה (Post fertilization). הוציאו את הביצים מהמדגרה ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר. נקו את פני השטח של כל ביצה עם 70% ethanol ונגבו.
כעת מקמו שתי רצועות של סרט דבק שקוף באורך 4 סנטימטרים אחת לצד השנייה על הביצה, כדי ליצור מלבן גדול מעל סימון העיפרון. החליקו את הסרט אל הביצה כדי למסגר את החלון באמצעות מזרק של 10 מיליליטר המחובר למחט בכימיות 18. נקבו את קליפת הביצה תוך הטיית המחט הרחק מהחלמון, כדי לא להפריע לעובר או לפגוע בו.
שאבו חמישה מיליליטרים של אלבומין מהביצה. נקו את המחט עם 70% ethanol. ייבשו את המחט לפני הדקירה של הביצה הבאה.
הזינו את ההגדרות למכשיר מתיחת המיקרו-פיפטות בלהבה. לאחר מכן, מתחו צינורות קפילריים דקירי-דופן למחטי הזרקה באמצעות פיפטה P 10. שאבו 5 עד 10 µL של תמיסת פלסמיד לתוך טיפ קפילרי ארוך.
לאחר מכן, טענו את מחט הזכוכית לאט בעמוד רציף ללא בועות אוויר. מקמו את המחט הטעונה במחזיק המחטים המחובר למיקרו-מניפולטור ולמיקרו-אינג'קטור. כעת, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, תוך שימוש ברקע כהה כדי להמחיש טוב יותר את המחט, קצצו את המחט בנקודה שבה מסתיים הנוזל הירוק באמצעות מספרי קפיץ.
גזרו חלון בקוטר של שני עד שניים וחצי סנטימטרים מחור המחט הקודם. זאת לצורך שאיבת החלבון (אלבומין). סובבו את הביצה ביד אחת תוך כדי הגזירה.
זכרו לנקות את המספריים באמצעות ניגב Kim wipe הספוג ב-70% ethanol בין ביצה לביצה. המשיכו לצפייה בעובר האפרוח תחת מיקרוסקופ דיסקציה. במידת הצורך, ניתן להדגיש את העובר על ידי הזרקת 20% India ink ב-PBS מסונן ב-0.22 micrometer מתחת לעובר האפרוח. מקמו את העובר במקביל לנתיב המחט, כאשר הראש פונה הרחק מהמחט.
דקרו באיטיות את צינור העצבים (neural tube) בזווית של 45 מעלות בחיבור שבין המוח האמצעי למוח האחורי. התחילו בהזרקה באמצעות מיקרו-מזרקי pico spritzer כאשר משך ההזרקה מוגדר ל-25 milliseconds. התאימו את הזמן בהתאם לכיול המחט, ומלאו רק את שלפוחית העצבים המייצגת את המוח האמצעי ב-plasmid DNA המכיל צבע fast green.
לאחר הוצאת מחט ההזרקה, טפטפו שלוש טיפות של תמיסת pen strep על העובר. ודאו את הגדרות ה-B-T-X-E-M-C eight 30 electro por לצורך אלקטרופורציה יעילה. במיקום של המוח האמצעי הגבאי (ventral midbrain), מקמו את אלקטרודות הפלטינה הקטנות בצורת L שהוכנו בהתאמה אישית באותו מפלס אופקי של בסיס הצינור העצבי, כך שהמוח האמצעי העוברי יהיה ממורכז בין שתי האלקטרודות.
לחצו פעם אחת על מתג הרגל של ה-BTX ושימו לב לבועות האוויר הנוצרות מסביב לאלקטרודות. לאחר כל אלקטרופורציה מוצלחת, הוציאו בזהירות את האלקטרודות מהביצה ונגבו אותן. בעזרת ניגוב כימי (chem wipe) טבול ב-70% ethanol, הניחו שלוש טיפות נוספות של תמיסת pen strep על העובר.
כעת כסו את הפתח בחתיכה של סרט הדבקה שקוף בגודל חמישה סנטימטר על חמישה סנטימטר. מבלי לגעת בתכולת הביצה, אטמו את הביצה היטב והחזירו את הביצים לדגירה כאשר השולחנות המסתובבים כבויים. כאשר יושג השלב הרצוי, העבירו את העוברים החיים לפטרי dish המלא ב-PBS עבור כל תנאי.
בשלב הבא, השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי. סננו את העוברים שנאספו כדי לזהות ביטוי של m cherry, והעבירו את העוברים החיוביים לבארות בודדות בצלחת של 24 בארות. מלאו כל בארה ב-1 mL של 2% paraformaldehyde שהוכן טרי, והדגירו למשך שלוש שעות ב-4 °C.
שטפו את העובריים המקובעים ב-PBS שלוש פעמים, והניחו את העובריים ב-15% sucrose עד להשגת שיווי משקל (equilibration). חזרו על תהליך שיווי המשקל ב-30% sucrose, ולאחר מכן הטמיעו כל עוביר ב-OCT תוך התמצאות נכונה של העובריים כדי להפיק חתכים רוחביים אופטימליים של המוח האמצעי לאנליזות המשך.
הכינו חתכים קריוסטט בעובי 18 מיקרון של המוח האמצעי העבה עבור אנליזות המשך בבדיקת אלקטרופורציה in ovo במוח האמצעי של עובר אפרוח. עוברים של אפרוחים בשלב 11 מוזרקים עם תערובת פלסמידים של סמן פלואורסצנטי m cherry וגנים רלוונטיים, וכן מעקב בצבע fast green לתהליך ההזרקה. לאחר אלקטרופורציה של המוח האמצעי, העוברים מדגרירים הלאה, והעוברים החיוביים ל-m cherry נאספים, מקובעים ומוטמעים.
לאחר מכן מכינים חתכים קריוגניים של המוח האמצעי. הדגימות נסרקות באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית עם סמנים של המוח האמצעי, כגון tyrosine hydroxylase, בעוברים של אפרוחים שהוזרקו ועברו אלקטרופורציה בהצלחה. ביטוי של M cherry נראה בדרך כלל באזור המוח האמצעי לאחר התפתחות נוספת, כאשר ביטוי m cherry משמש כסמן להזרקה.
עוברים המראים ביטוי תקין של m cherry מקובעים, מוטמעים ומכוונים להכנת חיתוכי קריו של המוח האמצעי. כאן, נבחנת קביעת הגורל הדופמינרגי בתאי מוצא עצביים שעברו אלקטרופורציה באמצעות קולוקליזציה של m cherry והגן המסומן ב-flag עם הסמן של נוירונים דופמינרגיים, tyrosine hydroxylase. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להגביל אזורית את ביטוי הגנים לתאי מוצא של נוירונים דופמינרגיים במוח האמצעי העוברי, כולל אופן הזרקת מבני DNA ספציפית לאזור המוח האמצעי, וכיצד לדייק את האלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות קטנות בהתאמה אישית בעקבות פרוצדורה זו.
שיטות אחרות, כגון lockdown המתווך על ידי RNI או ביטוי של מחזקים (enhancers) המקושרים לגנים מדווחים, יכולות לשמש למחקר של תפקוד גנים ובקרה גנטית באזורים ובסוגי תאים ספציפיים של מערכת העצבים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטה לאלקטרופורציה in ovo של DNA פלסמידי לתוך מוכ של עובר אפרוח, במטרה לבחון השפעות של ביטוי גנים על התמיינות נוירונים דופמינרגים. טכניקה זו מאפשרת הובלה ממוקדת של גנים לתאי פרוגניטורים עצביים, ובכך מקלה על חקר התפתחות המוכ.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ויסות גנים
רקע
- נוירונים דופמינרגיים בגב המוח הם חיוניים לתפקודי מוח שונים.
- הבנת התפתחותם יכולה לספק תובנות לגבי הפרעות נוירולוגיות.
- אלקטרופורציה in ovo היא טכניקה המשמשת להחדרת DNA לעוברים מתפתחים.
- שיטה זו יכולה לשפר מחקרים של ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח.
מטרת המחקר
- להערכת תפקוד גנים במהלך התפתחות נוירונים דופמינרגים במרכז המוח.
- לבחינת הבקרה על גנים המעורבים בדיפרנציאציה נוירונלית.
- לביסוס שיטה מהימנה לחקר התפתחות מרכז המוח.
שיטות שהושתמשו
- הזרקת plasmid DNA למוח האמצעי של עוברי אפרוח.
- אלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות מותאמות אישית להשגת העברת גנים.
- קציר של עוברי אפרוח בשלבים התפתחותיים ספציפיים.
- צביעה אימונוהיסטוכימית לסמני נוירונים דופמינרגיים להערכתה של הדיפרנציאציה.
תוצאות עיקריות
- ביטוי מוצלח של גנים בתאי אב עצביים של המוח האמצעי.
- תצפית על דיפרנציאציה של נוירונים דופמינרגיים באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית.
- הדגמת היתרונות של אלקטרופורציה ספציפית לממברנה.
- תובנות לגבי תפקידם של גנים ספציפיים בהתפתחות המוח האמצעי.
מסקנות
- שיטת האלקטרופורציה in ovo יעילה למחקרי ביטוי גנים.
- גישה זו יכולה לקדם את ההבנה של התפתחות נוירונים דופמינרגיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו עבור חקירות גנטיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ביטוי גנים ממוקד בתאי אב דופמינרגיים במוח האמצעי של עובר אפרוח, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות טיפוליות בהפרעות נוירו-התפתחותיות. על ידי מתן אפשרות למחקרי הגברה או אובדן תפקוד (gain- and loss-of-function) ספציפיים לאזור, השיטה מגבירה את רמת הוודאות החזויה בשלבים מוקדמים של תיקוף המטרה. גישה זו מספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך הערכת תפקוד גנים לפני מאמצים לזיהוי מולקולות מובילה (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות בדיקת תפקוד גנים במסלולי התמיינות של נוירונים דופמינרגים.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות תצפית ישירה על הבשלה של נוירונים חיוביים ל-tyrosine hydroxylase.
- ערך חזוי: תומך בסינון תיקי פיתוח על ידי קישור של מודולציה גנטית לקביעת גורל דופמינרגי במודל של חולייתן.
סקר ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות בהמשך, באמצעות זיהוי תאי פרוגניטורים חיוביים ל-mCherry.
- פלט כמותי: מייצרת קריאות מדידות של צביעה אימונוהיסטוכימית לבדיקת יעילות הדיפרנציאציה דופמינרגית.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תומכת ביישום בר-הרחבה על פני אזורים שונים במערכת העצבים עבור מיפוי גורל תאים ומחקרי בקרה גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה התפתחות דופמינרגית של הג cooperating midbrain בבני אדם, הרלוונטית למנגנונים של מחלת הפרקינסון וסכיזופרניה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני באמצעות ביסוס קשרים סיבתיים בין גן לפנוטיפ.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקביעת קריטריונים להתקדמות באמצעות פנוטיפים של דיפרנציאציה הניתנים לשחזור בתאי פרוגניטור שעברו אלקטרופורציה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הטכניקה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות בהתפתחות דופמינרגית לפני שלבי פיתוח הבדיקה וזיהוי המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות המשפיעות על גורל תאי מוצא עצביים.
- סריקה: מספק מערכות מוכנות לבדיקה עם טרנספקציה סטנדרטית וניתנת לשחזור בתאי מוצא עצביים של המוח האמצעי.
- אנליטיקה: מספק תוצרי צביעה אימונוהיסטוכימית כמותית (למשל, קו-לוקליזציה של tyrosine hydroxylase) להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות מדדי בידול של נוירונים דופמינרגיים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית למחקרי ביטוי גנים אזוריים במערכות משנה של מערכת העצבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבואי בתיקוף המטרה באמצעות תצפית ישירה עלהבחנה דופמינרגית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה באמצעות אלקטרופורציה מוגבלת אזורית ומעקב אחר ביטוי mCherry.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי צמצום העמימות המכניסטית במטרות של התפתחות נוירולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף מותאם סיכונים המבוסס על השפעות גנים במודל מאומת של נוירונים דופמינרגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעוברי רפאים ובטכניקות של מיקרו-כירורגיה.
- תלוי באלקטרודות פלטינה מותאמות אישית בצורת L ובהגדרות מדויקות של מכשיר האלקטרופורציה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע, חיתוך וצביעה אימונוהיסטוכימית לצורך ניתוח הדיר.
- התאמה לאזורים עצביים אחרים דורשת אופטימיזציה מחדש של אתרי ההזרקה ומיקום האלקטרודות.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצים של חיות העובר ויחס אות לרעש בדימות של רקמות עמוקות.
