Name: דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ במבחנה דגם מחסום דם מוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: למדו לבודד ולהנציח תאי אנדותל מיקרו-כלי דם ממוח עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר מחסום דם-מוח ומחלות נוירואינפלמטוריות במודל מבחנה אמין ויציב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה DFG תחת מספר מענק FO 315/4-1 וDFG SFB 688.

1. בידוד של המוח Microvessels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד להשתמש בהכנה 09:55 עכברי ילוד מהמין (3-5 ימים ישנים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר על פי המלצות מקומיות IACUC / וטרינר, להסיר את המוח באופן מיידי, והעברה לצלחת הפטר שמכילה את הפתרון הבא: 15 מ&quot;מ (Hepes pH 7.4), 153 המ&quot;מ NaCl, KCl 5.6 מ&quot;מ, 2.3 המ&quot;מ CaCl 2 x 2H 2 הו, 2.6 המ&quot;מ MgCl 2 x 6H 2 O,% 1 (w / v) BSA (להלן כלמאגר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם צוין אחרת, כל נהלי הבידוד צריכים להתבצע בטמפרטורת חדר (RT) (22-24 ° C) מתחת למכסת מנוע הזרימה למינרית. חותך את המוח (מוח בלי מוח קטן וגזע מוח), לאחר הסרת קרומי המוח ושברי נימים, במאגר באמצעות אזמל סטרילי. פיפטה הרקמה שברים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מ&quot;ל עד שלא יופיעו גושים. להעביר את ההשעיה לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל וצנטריפוגה XG ב 250 למשך 5 דקות בRT. </li></ol> הערה: קרום מוח יכול להיות מזוהה כקרומים דקים ושקופים על פני השטח של רקמת המוח. ניתן להסיר אותם בזהירות עם מלקחיים סטרילית. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס את הגלולה במאגר המ&quot;ל 4.5 עם 1.5 מ&quot;ל של 0.75% (w / v) collagenase / dispase (רוש) ודגירה במשך 45 דקות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים (לעתים רועד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את לוחות 12-גם על ידי ציפוי ארבע בארות בקולגן IV (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​הומס בחומצה אצטית 50 מ&quot;מימ). אפשר לדבוק לשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את מערכת העיכול על ידי תוספת של 15 מ&quot;ל החיץ א resuspend קר כקרח הגלולה ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG עבור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר המיאלין, יוסיף 10 25% מ&quot;ל (w / v) BSA (Sigma, טוהר&gt; 98%) וצנטריפוגה XG ב 1000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. BSA 25% צריך להיות מומס ב1x PBS (Paa מעבדות) ומסונן דרך f 0.2 מיקרומטרilter). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך בזהירות את supernatant, לפזר את הגלולה במאגר 10 מ&quot;ל ולהעביר לצינור פלקון חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. גלולת כתוצאה מכילה את תאי האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמי צלחת קולגן IV-12-המצופית היטב עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 4 מ&quot;ל של מדיום גידול (DMEM המכיל 10% FCS, 50U/ml פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין) וצלחת השעית התא לשתי בארות, 2 מ&quot;ל לכל באר. הוסף puromycin לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ודגירה במשך 45 דקות על 37 מעלות צלזיוס בתא תרבות חממה. שלב זה מאפשר הסרת תאים במהירות דבקות הערה:. Puromycin מתווסף ל24 שעות. רק המוח ECs יכול לעכל אותו, לסוגי תאים אחרים puromycin הוא רעיל 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה בינוני 2 מ&quot;ל מכילים תאים שאינם דבקים-מצעד 1.14 לשתי בארות טריות (בארות אלה מכילות שבריר EC). מלא את הבארות עם תאים דבקו מבקעמ &#39;1.14 במדיום טרי מ&quot;ל 2 (בארות אלה מכילים סוגים אחרים של תאים פיברובלסטים, למשל, האסטרוציטים, וניתן לגדל במקביל ומשמשות להשוואות של המורפולוגיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הבינוני ביום המחרת. </li></ol> 2. מנציח את תאי אנדותל כלי הדם במוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח GP + E-86 (ניאו GPENeo) 15 פיברובלסטים, מפרישי וירוס שכפול לקוי עם אונקוגן polyoma אמצע T במדיום DMEM FCS המכיל 10% חום מומת, 50U/ml פניצילין / סטרפטומיצין, ו2 מ&quot;ג / המ&quot;ל G418 ( . Paa מעבדות) בצלוחיות מצופות ג&#39;לטין הערה: transfection אונקוגן T אמצע Polyoma גורם יתרון צמיחה של מעל ECs הלא ECS-מובילה לmonolayer הומוגנית של תאי אנדותל עם מורפולוגיה 4 עד 6 שבועות של התרבות. GPENeo אינו זמין באופן מסחרי וניתן להשיג כחומר ציבורי משותף (עיין בפרסומים מקוריים 4,16). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש במדיום המכיל וירוס עבור<html> הנצחה, לטפח את תאי GPENeo במדיום G418-חינם עבור 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 10 מ&quot;ל של GPEneo supernatant ולהוסיף Polybrene (hexadimethrine רומיד) (Sigma) לריכוז סופי של מיקרוגרם 8 / מ&quot;ל, לעקר דרך 0.45 מיקרומטר מסנן כדי להסיר את הברים הסלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום גידול מתרבויות EC הוכנו בחלק 1 ולהוסיף 2 מ&quot;ל של תערובת GPEneo supernatant / Polybrene לתוך הבארות. חזור על אותו למחרת באמצעות תערובת טריה GPEneo supernatant / Polybrene הערה:. Polybrene משמשת כדי להפוך את הנקבוביות בקיר התא כדי להקל את הזיהום בחלקיקים הנגיפיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את GPEneo תערובת supernatant / Polybrene למחרת, לשטוף את תאי פעמים עם PBS ולשמור את התאים במדיום הגידול המשתנים כל 3 ימים. לאחר המפגש, לפצל את התאים 01:02 על צלחות קולגן IV מצופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, (cEND) קווי אנדותל מוחיים יציבים סלולריים יש לקבל כעבור 4-5 שבועות. </li></ol>&quot;&gt; 3. טיפוח דואר תאי האנדותל כלי הדם במוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר את התאים מcryoaliquot באמבט מים והעברה ב15 מ&quot;ל-פלקון עם 10 בינוניים מראש התחמם מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, להעביר את הכדור בבקבוק קולגן IV המצופה T 25 סנטימטרי 2 תא התרבות עם מדיום גידול מחומם מראש (צפיפות תאים לציפוי צריכה להיות לפחות 1x 10 4 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בינוני למחרת ולאחר שהתאים הגיעו למפגש (בדרך כלל לאחר 5 ימים) לפצל את התאים. </li></ol> 4. פיצול תאי cEND (הערה: פיצול צריך להיעשות רק פעם בשבוע, יש להימנע מפיצול גבוה יותר מאשר 1:4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של טריפסין-EDTA פתרון החם (Paa מעבדות) (75 סנטימטר 2 בקבוק T), דגירה על 37 מעלות צלזיוס ולחכות עד ששכבת תאים מפוזרת (בדרך כלל בתוך 5 עד 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 המ&quot;ל oמדיום גידול f, פיפטה מעלה ומטה, ומעביר לבקבוק קולגן IV מצופה חדש. </li></ol> 5. הקפאת cEND התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את השעית התא כמתואר בשלב 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול (המתקבל מ 2 סנטימטר בקבוק 1 T 75) במדיום הקפאת מ&quot;ל 6 (95% צמיחה בינונית, 5% DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלק את השעית התא לארבע 1.5 המ&quot;ל cryo-aliquots הערה:. Cryo-aliquot אחד יכול להיות seeded על 2 סנטימטר בקבוק T 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את-aliquots cryo תחת טמפרטורת אדי חנקן נוזלית. </li></ol> cEND מדיום גידול: 450 המ&quot;ל DMEM, 10% FCS, 10 מיליליטר L-גלוטמין, 2% MEM-קיט, 2% NEAA, פירובט 10 מיליליטר נתרן, 50 U / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין 6. נציג תוצאות תאי cEND וcerebEND התאפיינו immunostainings של אנדותלnd BBB סמנים כמו גם על ידי מדידות של התנגדות transendothelial החשמלית (TEER) וחדירות. CEND וcerebEND היה מורפולוגיה דומה לתרבויות העיקריות של המוח ECs, עם monolayers של תאים מוארכים צפופים שהוצגו עיכוב גדילה במפגש. התאים בטאו רמות גם לגילוי של claudin-5, occludin וחלבוני VE-cadherin שהיו נקודות בצומת תאי תאים, כפי שמוצגות על ידי immunofluorescence (3 איור) 4,5. תאי cEND culturing במדיום סרום מופחת הובילו לעלייה בTEER (מ 150 Ωcm 2 בנוכחות של 10% בסרום עד 500 Ωcm 2 בנוכחות של 2% סרום), שpotentiated על ידי התוספת של הידרוקורטיזון (800 Ωcm 2) או אינסולין (1000 Ωcm 2) 4. Monolayers של cEND תרבית במדיום סרום מופחת במשך 21 ימים היה TEER של 900 Ωcm 2 (איור 4). TEER נמדד באמצעות הרכבההמכילים אלקטרודות נוכחי גניבה ומתח מדידה (מכשירי Precision עולם). לשם השוואה, כלי דם המוח העיקרי ECs דווח לי ערכי TEER של 200-600 Ωcm 2 ושורת תאי עכבר זמינה מסחרי bEnd.3 היו ערכי TEER של 100-140 Ωcm 2 (לסקירה האחרונה לראות אבוט 2005 וטות et אל., 2011 17,18). בנוסף, המעבר של מקרומולקולות, כגון שאינם טעון FITC-dextrans של המונים מולקולריים 4, 10, 70 ו 500 KDA, או fluorescein (300 דא) על פני monolayer של cEND ב2% בינוניים בידול FCS מעל 4 שעות היה ירידה לעומת תאי ביקורת מנוהלים במדיום גידול המכיל 10% FCS: שטף paracellular הופחת ל 30% מתאי בקרה לfluorescein, עד 26% לFITC-dextrans 10 ו 70 kDa, ושטף הופחת ל -4.5% מתאי בקרה לFITC Dextrtan-500 kDa. בדומה לTEER ערכים, החדירות היו ברמה הנמוכה ביותר בתאים בתרבית בנוכחות gluc4 ocorticoids (GC). במחקרים נוספים, זיהו את גני מטרת glucocorticoid, occludin, claudin-5 וVE-cadherin בהאנדותל כלי דם במוח 4,7,9. טיפול GC הוביל לעלייה בביטוי של חלבונים אלו, והארגון מחדש של VE-cadherin לcytoskeleton. הרגולציה הישירה GC בתיווך של חלבונים ההדוקים הצומת occludin וclaudin-5 מופיעה דרך אלמנטי תגובה GC באזורי אמרגן 4,7,19. בנוסף, claudin-5 זוהו כמטרת אסטרוגן רומן ב10 האנדותל בכלי דם. בבסיס תפקוד האנדותל מחלות רבות ושונות. אנו תרבית cEND תחת חמצן / חסך (OGD) תנאי גלוקוז. OGD הוביל לשיבוש תפקוד BBB, שניתן לשחזר לאחר טיפול משולב עם GC והמעכב 12 לקייד הפרוטאזום. תנאי OGD הביאו לעלייה חזקה בספיגת הגלוקוז ובביטוי של transpor גלוקוזters בcerebEND, אשר יכול להיות מוחלש על ידי התוספת של MK801, מעכב הלא תחרותי של NMDA קולטן 13. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> איור 1. מורפולוגיה של תאי מוח כלי דם (אנדותל cEND) בשבוע אחד אחרי בידוד. תמונות מיקרוסקופ אור נלקחה תחת (ב) הגדלת 6x () ו15x. מושבות האי נוצרו-של תאי האנדותל גלויות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> איור 2. מורפולוגיה של תאי אנדותל כלי דם במוח (cEND) חודש לאחר בידוד והנצחה. תמונות מיקרוסקופ אור נלקח תחת גדלת 15x. Monolayer מחובר, הומוגנית אנדותל תא ניתן לצפות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> איור 3. microvascul המוח הונצחתאי האנדותל ar מפורש claudin-5, occludin וVE-cadherin. תאי CEND גדלו על coverslips קולגן IV המצופה ומוכתמים בנוגדנים נגד claudin-5 (א), occludin (B) וVE-cadherin (C). התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Axioscop2 Zeiss מתחת לעדשות 40X. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> איור 4. מדידת ההתנגדות חשמלית transendothelial (TEER) של monolayer cEND. CEND גדלה על מסנני transwell IV מצופים קולגן (0.4 מיקרומטר גודל נקבובי). לאחר שהגיע למפגש, התאים נשמרו במדיום המכיל 2% FCS. TEER נמדד לאחר 7, 14 ו 21 ימים באמצעות הרכבה המכילה אלקטרודות נוכחי גניבה ומתח המדידה.

<ol><li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113(2011).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937(2008).</li>
<li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872(2005).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475(2005).</li>
<li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37(2006).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413(2006).</li>
<li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19(2009).</li>
<li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937(2007).</li>
<li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139(2008).</li>
<li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298(2010).</li>
<li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293(2010).</li>
<li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081(2011).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen%2Fglucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44(2012).</li>
<li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279(2005).</li>
<li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203(2002).</li>
<li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+of+the+blood-brain+barrier%3A+incomplete+presentation+of+protein+%28auto-%29antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757(1990).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5(2005).</li>
<li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+CNS+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107(2011).</li>
<li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39(2008).</li>
<li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125(1994).</li>
<li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100(1994).</li>
<li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327(2001).</li>
<li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521(1990).</li>
<li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101(1994).</li>
<li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435(1990).</li>
<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315(2010).</li>
<li>Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkaper%2C+SD+%22Methods+in+Neurosciences%22">Methods in Neurosciences</a>. Conn, M. 2, 1303(1990).</li>
<li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin%2C+an+endothelial+anticoagulant+protein%2C+is+absent+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362(1986).</li>
<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ההליך המתואר יכול לשמש לבידוד של כלי הדם ECS מזנים שונים של עכברים, כמו גם מזנים שונים עקום החוצה עכברים כדי ללמוד את השינויים הספציפיים בתפקוד האנדותל בכלי דם. כדרך להנצחה הייתי שינוי עם oncoprotein של polyomavirus העכברי, אנטיגן T Polyoma האמצע. זה הופך את תאי האנדותל בשלה במהירות in vivo ו במבחנה 20,21,22. שיטות אחרות להנצחה של ECs תוארו בספרות כוללות למשל הנצחה עם האנטיגן SV40 גדול T של וירוס Vacuolating קופי 40 23, גן ​​מוצר אדנווירוס 24 E1A או ביטוי יתר של המקטע הקטליטית של telomerase האנושי 3. ההנצחה עם PymT היא ספציפית לECs הבוסר העכברי, המאפשר קבלת תרבות EC הומוגנית מעכברים ילודים בזמן קצר. הנצחה משנה את התכונות של התאים והתוצאות שהושגו עם דואר שורות תאים הנציחו יש להשוות גם עם תאים ראשוניים או בניסויי in vivo בעכברים. PymT EC הונצח תואר להביע רמות גבוהות של פעילות fibrinolytic הנובעות מייצור מוגבר של urokinase סוג plasminogen activator וירידה בייצור של plasminogen activator 25 מעכבים. השוואה ישירה של PymT הונצחה קו bEND5 תא עם ECS הראשונית עלה, כי הן במודלים חוץ גופיית BBB מתאימים גם ללימודי הידבקות תא T 26. שורות התאים הוקמו בהתאם לנוהל שתואר ניתן להשתמש במספר מעבר נמוך כדי לשמור על נכסי מכשול על ידי ביטוי גבוה של חלבוני junctional BBB ו-EC, כמו תאים מאבדים מאפיינים אלה במהלך ההזדקנות. לכן לאחר אובדן נכסי מכשול, ההכנה של שורת תאים חדשה צריכה להיחשב. צפיפות תאי ציפוי צריכה להיות גבוהה לECs, כמו זו היא קריטית לשגשוג תאים. זה יש לבחון במהלך הליך הבידוד, כמו גם תחזוקה של ECs הונצח. כל שורת תאים חדשה צריכה להיבדק על נכסי המכשול ולמזהמים אפשריים עם סוגי תאים אחרים. monolayers EC ניתן מוכתם בחומץ חלבון אנטי galactocerebroside, אנטי גליה fibrillary ואנטי חלק אנטיגן שרירים כמו נוגדנים ראשוניים שלא לכלול את הזיהום עם oligodendrocytes, האסטרוציטים וpericytes 4,27. כדי לשלול זיהום על ידי מערכת כלי דם meningal, הביטוי של thrombomodulin ניתן לבדוק, שבא לידי ביטוי בכל ערוצי כלי הדם, למעט המוח 28. מעניין, את הקווים הנציחו כלי דם אנדותל התאים שאזורי מוח שונים נבדלים בתכונות וגם ברגישות שלהם לגירויי המכשול פרו דלקתיים. כדוגמה, שורות תאי המוח והמוח קטן cEND cerebEND ניתן לציין 4,5. CerebEND הראה, בהשוואהלcEND, רמות ביטוי נמוכות יותר של רכיבי צומת ההדוקים העיקריים claudin-1 וoccludin. עם זאת, ברמות של claudin-3 ו -12 היו גבוהות יותר בcerebEND. תפקוד המחסום של תאי cerebEND סבל הרבה יותר תחת טיפול עם המתווך הדלקתי, TNFα ממאפייני המכשול של תאי cEND עשו 5. פגיעות מוח קטנות יותר לגירויים דלקתיים, ניתן להבחין בחי בחולי טרשת נפוצה ובניסיוני מודל החיה שלה אוטואימונית Encephalomyelitis 29. ממצאים מעניינים אלה עולים הצורך ביצירה ואפיון פרטני במודלים חוץ גופייה לאזורים שונים של מוח, על מנת לשפר את תרופת עתיד מיקוד לתוך המוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שור אלבומין (BSA) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A7906 </td><td> טוהר&gt; 98% </td></tr><tr><td> קולגן IV </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C5533 </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בחומצה אצטית 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> רוש </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> המדיום של Dulbecco העדכון של הנשר (DMEM) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום (FCS) </td><td> מעבדות Paa </td><td> A15110-1333 </td><td> ריכוז סופי של 10%, חום מומת (30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) </td></tr&gt; <tr><td> L-גלוטמין </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-פירובט </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> נאומיצין (G418) </td><td> מעבדות Paa </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> חומצות האמין שאינם חיוניות (רח&quot;ל) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / סטרפטומיצין </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine רומיד) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 107689 </td><td> 0.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS, אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0.05%, 0.02% EDTA ב PBS </td></tr></tbody></table>

דור של קו הונצח murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

תאי אפיתל ואנדותל (EC) בונים מחסומי paracellular אשר להגן על הרקמות מהסביבה החיצונית והפנימית. מחסום דם המוח (BBB) ​​בהיקף של EC, בסוף הרגליים, pericytes astrocyte וקרום הבסיס הוא אחראי להגנה והאיזון של parenchyma המוח. במודלים חוץ גופיית BBB הם כלים משותפים ללימוד המבנה והתפקוד של BBB ברמה התאית. מספר לא מבוטל של דגמים שונים במבחנת BBB הוקם במשך מחקר במעבדות שונות עד היום. בדרך כלל, את התאים מתקבלים ממקור הבקר, חזיר, עכברוש רקמת מוח או עכבר (נדון בהרחבה בביקורת על ידי וילהלם et al. 1). דגימות רקמה אנושיות הן זמינות רק במספר מצומצם של מעבדות או חברות 2,3. בעוד הכנות ראשוניות של תא הן זמן רבים ותרבויות EC יכולות להיות שונות מיצווה כדי תצווה, ההקמה הונצחה EC ליןes הוא מוקד העניין מדעי. כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת קו הונצח מוח כלי דם EC ממוח עכבר ילוד. אנו מתארים את רישום צעד אחר צעד הליך ריאגנטים ופתרונות בשימוש. השיטה שהוקמה על ידי המעבדה שלנו מאפשרת בידוד של קו הומוגני הונצח אנדותל תא בתוך ארבעה עד חמישה שבועות. שורות תאי אנדותל כלי הדם במוח המכונות cEND 4 (מקליפת מוח) וcerebEND 5 (מקליפת המוח הקטנה), היינו מבודדים על פי נוהל זה במעבדת פורסטר ויש יעילות בשימוש להסבר של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים בב&quot;ב. שימוש cEND וcerebEND אנו מראים כי תאים אלה מגיבים לglucocorticoid-4,6-9 ואסטרוגן טיפול 10, כמו גם למתווכים פרו infammatory, כגון TNFalpha 5,8. יתר על כן, יש לנו למדנו את הפתולוגיה של מרובה sc11 lerosis והיפוקסיה 12,13 ב EC ברמה. CEND וקווי cerebEND יכולים להיחשב ככלי טוב ללימוד המבנה והתפקוד של BBB תגובות, הסלולריות של ECs לגירויים או באינטראקציה שונים של EC עם ימפוציטים או תאים סרטניים.

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

תאים אפיתליאליים ותאים אנדותליאליים (EC) בונים מחסומים פארא-צלולריים המגנים על הרקמה מהסביבה החיצונית והפנימית. ה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג תרבית הומוגנית של תאי אנדותל של המוח שהושרתם למצב של אלמוות (immortalized). דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד המוחות מעכברים ניאונטליים והשגת תרחיף של תאים בודדים. השלב השני הוא השראת התאים למצב של אלמוות באמצעות polyoma middle T antigen.בשלב הבא, התאים גדלים במשך כארבעה שבועות עד להיווצרות שכבה אנדותללית חד-שכבתית (monolayer) הומוגנית. השלב הסופי הוא אפיון של שורת התאים החדשה באמצעות טכניקות כגון צביעה אימונוהיסטוכימית, Western blot ו-Q-Q-P-C-R. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות מוחיות נוירו-דלקתיות או איסכמיות, מכיוון שבאמצעותה ניתן לבצע הערכה פרה-קלינית של טיפולים ולהפיק תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה.את הפרוצדורה תדגים ד"ר איליין סלבדור, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. לאחר הוצאת המוח מעכבר ניאונטלי בן שלושה עד חמישה ימים שהועבר לצלקת פטרי המכילה buffer A, נדרשים מוחות של חמישה עד 10 עכברים עבור כל הכנה, תוך עבודה במנדף זרימה למינרית. הסיר מכל מוח את המוחון, גזע המוח, הקרומים ושרידי נימים.לאחר מכן, העבירו את המוחות הגדולים לצחנת פטרי שנייה המכילה buffer A. השתמשו בסכין מנתח סטרילית כדי לחתוך את המוחות הגדולים לחתיכות קטנות, ולאחר מכן השתמשו בפיפט של 10 milliliter כדי לשאוב ולהזרים את הרקמה ואת הבאפר עד שלא ייראו גושים. בשלב זה, העבירו את התוך תלייה למבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter לאחר סבוב של רקמת המוח ב-250 times G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והמיסו את המשקע ב-4.5 milliliters של buffer A עם 1.5 milliliters של 0.75% weight per volume.הוסף קולגנאז. דגירה של הרקמה ותמיסת הקולגנאז למשך 45 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C עם ערבוב מדי פעם. בינתיים, הכן את צלחות תרבית הרקמה על ידי ציפוי של ארבע בארות בצלחת של 12 בארות בתמיסה סטרילית בריכוז של 0.1 mg/mL.קולגן וחומצה אצטית בריכוז 50 millimolar מאפשרים לקולגן להיצמד לבארות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר תום תקופת האינקובציה של 45 דקות, עצור את עיכול רקמת המוח על ידי הוספת 15 milliliters של באפר A וסבב מחדש את המשקע ביסודיות בתמיסה זו. לאחר מכן, צנטריפוג ב-250 ×g למשך 10 דקות והסר את הנוזל העליון.כדי להסיר מילין מהדגימה, הוסף לרקמה 10 milliliters של תמיס B, s, A ו-PBS סטרילי בריכוז 25% weight per volume, וסבב בצנטריפוגה במהירות של 1000 times G למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השלך בזהירות את עליית הנוזל (supernatant), המס את המשקע ב-15 milliliters של באפר A והעבר לשפופרת צנטריפוגה נקייה של 50 milliliter; סבב שוב בצנטריפוגה במהירות של 250 times G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. במקביל, שטוף את הפלטה המצופה בקולגן 4 פעמיים בעזרת PBS.לאחר השטיפה השנייה, השאירו שתי בארות ריקות והוסיפו שני מיליליטרים של מצע גידול לשתי הבארות האחרות. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השביו את משקע התאים, המורכב בעיקר מתאי אנדותל, בארבעה מיליליטרים של מצע גידול המכיל ארבעה מיקרוגרם למיליליטר puramycin, ופזרו שני מיליליטרים של תגסוס התאים לתוך כל אחת משתי הבארות הריקות המצופות בקולגן. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות כדי להרוג תאים שאינם תאי אנדותל הנצמדים במהירות. לאחר מכן, שאבו את מצע הגידול משתי הבארות שאינן מכילות תאים והשליכו אותן.לאחר מכן, העבירו את המצע המכיל תאים שאינם דבקים, הכולל את פראקציית התאים האנדותליאליים, לשני הבארים הללו. מלאו מחדש את הבארים הקודמים בשני מיליליטרים של מצע טרי. בארים אלו מכילים סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים ואסטרוציטים, וניתן לגדלם במקביל ולהשתמש בהם להשוואות מורפולוגיות.דגרו את התאים למשך לילה באינקובטור לתרביות רקמה. למחרת, החליפו למדיום טרי וגדלו את הפיברובלסטים GPE neo, המפרישים נגיף חסר יכולת רפליקציה עם אונקוגן polyoma middle T, בבקבוקים מצופים ג'לטין המכילים GPE neomed. טרנספקציית ה-Polyoma medial T oncogene גורמת ליתרון גדילה של תאי אנדותל על פני תאים שאינם תאי אנדותל, מה שמוביל לשכבה אחת הומוגנית של תאים בעלי מורפולוגיה אנדותליאלית. לאחר ארבעה עד שישה שבועות של תרבית, תאי GPE neo אינם זמינים מסחרית וניתן להשיגם כחומר ציבורי משותף.לאחר גידול של GPE Neo Fiberblast למשך 24 שעות, הוצאו 10 milliliters של המצע והוסיפו תמיסת poly brain סטרילית עד לריכוז סופי של שמונה micrograms per milliliter. העבירו את תערובת העל (supernatant) דרך מסנן של 0.45 micron כדי להסיר שרידים תאיים. כעת, שאבו את המצע מתרביות התאים האנדותלליים והוסיפו שני milliliters של תערובת ה-poly brain מהעל לבארות לאחר דגירה למשך לילה.חזור על הליך זה למחרת עם מנה טרייה של תערובת ה-supernatant poly brain. הסר את תערובת ה-supernatant poly brain. שטוף את התאים פעמיים עם PBS ולאחר מכן הוסף מצע גידול טרי.המשיכו להחליף את מצע הגידול בכל שלושה ימים. כאשר התאים מגיעים למצב של התלכדות (confluence), העבירו את התאים פעם אחת או פעמיים לצלחות מצופות collagen IV. קווי תאי אנדותל מוחיים יציבים מתקבלים בדרך כלל לאחר ארבעה עד חמישה שבועות של תרבית רצופה.כאשר שכבה אנדותלconversationית הומוגנית ממלאת את כל הבאר. לאחר קבלת שורות תאים יציבות, העבירו את התאים לבקבוקי תרבית רקמות מצופים ב-collagen four; בצעו פסיז' לא יותר מפעם בשבוע באמצעות טריפסין, עם 3 mL של trypsin EDTA ודגירה ב-37 °C למשך 5 עד 15 דקות עד לפיזור שכבת התאים. לאחר הוספת 5 mL של מצע, זרעו את הבקבוקים החדשים והימנעו מיחס פיצול הגבוה מ-1:4.ברגע שיש מספיק תאים כדי להגיע למצב של התרבות מלאה (confluent) בבקבוק T 75, ניתן להכין מנות הקפאה (cryo quats) של תאים לשימוש עתידי. לשם כך, קצרו את התאים באמצעות טריפסין כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן סבבו את תגלי התאים בצנטריפוגה במהירות של 250 ×g למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, השביו את משקע התאים ב-6 milliliters של מדיום הקפאה, ולאחר מכן העבירו בפיפטה 1.5 milliliters של תגלי התאים לארבעה מבחנות הקפאה (cryo vials).העבירו את מבחנות הקריו למכל הקפאה של Nalgene מלא באיזופרופנול ושמרו אותן למשך יום אחד בטמפרטורה של 80°C- . לבסוף, אחסנו את מבחנות הקריו בחנקן נוזלי. הפשירו את מבחנת הקריו עם התאים במקלחת מים, ולאחר מכן העבירו אותם למבחנת צנטריפוגה של 15 milliliter המכילה 10 milliliter של מצע גידול.יש לחמם מראש את המצע ל-37 °C ולסבב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 250 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שאיבת המצע, יש לתוחב את המשקע בנפח מתאים של מצע גידול. העבר את תרחיף התאים לבקבוק תרבית תאים T 25 מצופה בקולגן IV עם מצע גידול שחומם מראש.צפיפות התאים לזריעה צריכה להיות לפחות 1×10⁴ תאים למיליליטר. החליפו את המצע למחרת והמשיכו להעביר את התאים כפי שנעשה קודם לכן; כאשר התאים יגיעו לקונפלואנציה (confluence), בערך כחמישה ימים מאוחר יותר, ויהיו מוכנים, זרעו את התאים בצפיפות הרצויה עבור הניסויים הבאים. תאי ה-C end אופיינו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של סממנים אנדותליאליים וסממנים של מחסום המוח-דם.תמונה זו מציגה את המורפולוגיה של תאי C and שצבעו אימונוהיסטוכימית עבור clain five. לתאי C and מורפולוגיה דומה לזו של תרביות ראשוניות של תאי ECS במוח, עם שכבות חד-שכבתיות של תאים מוארכים ודחוסים שהפגינו עיכוב בצמיחה. בהגעה למשכיות (confluence), התאים ביטאו רמות ניתנות לזיהוי של clain.כאן תאי C CN נצבעו אימונו-היסטוכימית באמצעות נוגדן ל-occludin. כאן אנו רואים את הביטוי של חלבוני VE cadherin, הממוקמים בצומת בין התאים, שוב, כפי שמוצג בצביעת אימונו-פלואורסצנציה. התנגדות חשמלית טרנס-אנדותליית נמדדה באמצעות מערך המכיל אלקטרודות להעברת זרם ומדידת מתח.ניתן לראות מדמות זו כי ההתנגדות החשמלית התאי-אנדותליאלית של תאי C end עולה עם הזמן בתרבית לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לחקור הפרעות בכלי הדם המוחיים במודל של עכבר.

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

מחסום הדם-מוח האנושי באופן סלקטיבי מונע חדירה של מולקולות הידרופילית ופתוגנים לתוך המוח. מספר פתווגיות, כולל דלקת קרום המוח והזיות פוסט-אופרטיביות, קשורות לחדירות מוגברות של מחסום הדם-מוחי. כאן, אנו מתארים מודל של התרבות התא האנדותל כדי לבדוק את חדירות המכשול על ידי החציית מחיידקים.

ניתוח חדירות של מכשול המוח-הדם על ידי חציית מיקרודם באמצעות תאי מיקרו-כלי

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

פרוטוקול זה מפרט שיטה מותאמת להפקה, הרחבה והקפאה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המתקבלים על ידי הבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם, ולחקור תכונות מחסום מוח בדם במודל אקס ויוו.

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

הוצג פרוטוקול לבידוד ותרבות ראשונית של תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח (BMECs) מרקמת מוח של עכברים יילודים, במטרה ליצור מודל עמיד במבחנה לחקר תפקוד מחסומי דם-מוח בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

בידוד ותרבות של תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח העכבר

למדו לבודד ולהנציח תאי אנדותל מיקרו-כלי דם ממוח עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר מחסום דם-מוח ומחלות נוירואינפלמטוריות במודל מבחנה אמין ויציב.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ

גלה סרטונים נוספים