דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג תרבית הומוגנית של תאי אנדותל של המוח שהושרתם למצב של אלמוות (immortalized). דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד המוחות מעכברים ניאונטליים והשגת תרחיף של תאים בודדים. השלב השני הוא השראת התאים למצב של אלמוות באמצעות polyoma middle T antigen.

בשלב הבא, התאים גדלים במשך כארבעה שבועות עד להיווצרות שכבה אנדותללית חד-שכבתית (monolayer) הומוגנית. השלב הסופי הוא אפיון של שורת התאים החדשה באמצעות טכניקות כגון צביעה אימונוהיסטוכימית, Western blot ו-Q-Q-P-C-R. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות מוחיות נוירו-דלקתיות או איסכמיות, מכיוון שבאמצעותה ניתן לבצע הערכה פרה-קלינית של טיפולים ולהפיק תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה.

את הפרוצדורה תדגים ד"ר איליין סלבדור, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. לאחר הוצאת המוח מעכבר ניאונטלי בן שלושה עד חמישה ימים שהועבר לצלקת פטרי המכילה buffer A, נדרשים מוחות של חמישה עד 10 עכברים עבור כל הכנה, תוך עבודה במנדף זרימה למינרית. הסיר מכל מוח את המוחון, גזע המוח, הקרומים ושרידי נימים.

לאחר מכן, העבירו את המוחות הגדולים לצחנת פטרי שנייה המכילה buffer A. השתמשו בסכין מנתח סטרילית כדי לחתוך את המוחות הגדולים לחתיכות קטנות, ולאחר מכן השתמשו בפיפט של 10 milliliter כדי לשאוב ולהזרים את הרקמה ואת הבאפר עד שלא ייראו גושים. בשלב זה, העבירו את התוך תלייה למבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter לאחר סבוב של רקמת המוח ב-250 times G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והמיסו את המשקע ב-4.5 milliliters של buffer A עם 1.5 milliliters של 0.75% weight per volume.

הוסף קולגנאז. דגירה של הרקמה ותמיסת הקולגנאז למשך 45 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C עם ערבוב מדי פעם. בינתיים, הכן את צלחות תרבית הרקמה על ידי ציפוי של ארבע בארות בצלחת של 12 בארות בתמיסה סטרילית בריכוז של 0.1 mg/mL.

קולגן וחומצה אצטית בריכוז 50 millimolar מאפשרים לקולגן להיצמד לבארות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר תום תקופת האינקובציה של 45 דקות, עצור את עיכול רקמת המוח על ידי הוספת 15 milliliters של באפר A וסבב מחדש את המשקע ביסודיות בתמיסה זו. לאחר מכן, צנטריפוג ב-250 ×g למשך 10 דקות והסר את הנוזל העליון.

כדי להסיר מילין מהדגימה, הוסף לרקמה 10 milliliters של תמיס B, s, A ו-PBS סטרילי בריכוז 25% weight per volume, וסבב בצנטריפוגה במהירות של 1000 times G למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השלך בזהירות את עליית הנוזל (supernatant), המס את המשקע ב-15 milliliters של באפר A והעבר לשפופרת צנטריפוגה נקייה של 50 milliliter; סבב שוב בצנטריפוגה במהירות של 250 times G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. במקביל, שטוף את הפלטה המצופה בקולגן 4 פעמיים בעזרת PBS.

לאחר השטיפה השנייה, השאירו שתי בארות ריקות והוסיפו שני מיליליטרים של מצע גידול לשתי הבארות האחרות. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השביו את משקע התאים, המורכב בעיקר מתאי אנדותל, בארבעה מיליליטרים של מצע גידול המכיל ארבעה מיקרוגרם למיליליטר puramycin, ופזרו שני מיליליטרים של תגסוס התאים לתוך כל אחת משתי הבארות הריקות המצופות בקולגן. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות כדי להרוג תאים שאינם תאי אנדותל הנצמדים במהירות. לאחר מכן, שאבו את מצע הגידול משתי הבארות שאינן מכילות תאים והשליכו אותן.

לאחר מכן, העבירו את המצע המכיל תאים שאינם דבקים, הכולל את פראקציית התאים האנדותליאליים, לשני הבארים הללו. מלאו מחדש את הבארים הקודמים בשני מיליליטרים של מצע טרי. בארים אלו מכילים סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים ואסטרוציטים, וניתן לגדלם במקביל ולהשתמש בהם להשוואות מורפולוגיות.

דגרו את התאים למשך לילה באינקובטור לתרביות רקמה. למחרת, החליפו למדיום טרי וגדלו את הפיברובלסטים GPE neo, המפרישים נגיף חסר יכולת רפליקציה עם אונקוגן polyoma middle T, בבקבוקים מצופים ג'לטין המכילים GPE neomed. טרנספקציית ה-Polyoma medial T oncogene גורמת ליתרון גדילה של תאי אנדותל על פני תאים שאינם תאי אנדותל, מה שמוביל לשכבה אחת הומוגנית של תאים בעלי מורפולוגיה אנדותליאלית. לאחר ארבעה עד שישה שבועות של תרבית, תאי GPE neo אינם זמינים מסחרית וניתן להשיגם כחומר ציבורי משותף.

לאחר גידול של GPE Neo Fiberblast למשך 24 שעות, הוצאו 10 milliliters של המצע והוסיפו תמיסת poly brain סטרילית עד לריכוז סופי של שמונה micrograms per milliliter. העבירו את תערובת העל (supernatant) דרך מסנן של 0.45 micron כדי להסיר שרידים תאיים. כעת, שאבו את המצע מתרביות התאים האנדותלליים והוסיפו שני milliliters של תערובת ה-poly brain מהעל לבארות לאחר דגירה למשך לילה.

חזור על הליך זה למחרת עם מנה טרייה של תערובת ה-supernatant poly brain. הסר את תערובת ה-supernatant poly brain. שטוף את התאים פעמיים עם PBS ולאחר מכן הוסף מצע גידול טרי.

המשיכו להחליף את מצע הגידול בכל שלושה ימים. כאשר התאים מגיעים למצב של התלכדות (confluence), העבירו את התאים פעם אחת או פעמיים לצלחות מצופות collagen IV. קווי תאי אנדותל מוחיים יציבים מתקבלים בדרך כלל לאחר ארבעה עד חמישה שבועות של תרבית רצופה.

כאשר שכבה אנדותלconversationית הומוגנית ממלאת את כל הבאר. לאחר קבלת שורות תאים יציבות, העבירו את התאים לבקבוקי תרבית רקמות מצופים ב-collagen four; בצעו פסיז' לא יותר מפעם בשבוע באמצעות טריפסין, עם 3 mL של trypsin EDTA ודגירה ב-37 °C למשך 5 עד 15 דקות עד לפיזור שכבת התאים. לאחר הוספת 5 mL של מצע, זרעו את הבקבוקים החדשים והימנעו מיחס פיצול הגבוה מ-1:4.

ברגע שיש מספיק תאים כדי להגיע למצב של התרבות מלאה (confluent) בבקבוק T 75, ניתן להכין מנות הקפאה (cryo quats) של תאים לשימוש עתידי. לשם כך, קצרו את התאים באמצעות טריפסין כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן סבבו את תגלי התאים בצנטריפוגה במהירות של 250 ×g למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, השביו את משקע התאים ב-6 milliliters של מדיום הקפאה, ולאחר מכן העבירו בפיפטה 1.5 milliliters של תגלי התאים לארבעה מבחנות הקפאה (cryo vials).

העבירו את מבחנות הקריו למכל הקפאה של Nalgene מלא באיזופרופנול ושמרו אותן למשך יום אחד בטמפרטורה של 80°C- . לבסוף, אחסנו את מבחנות הקריו בחנקן נוזלי. הפשירו את מבחנת הקריו עם התאים במקלחת מים, ולאחר מכן העבירו אותם למבחנת צנטריפוגה של 15 milliliter המכילה 10 milliliter של מצע גידול.

יש לחמם מראש את המצע ל-37 °C ולסבב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 250 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שאיבת המצע, יש לתוחב את המשקע בנפח מתאים של מצע גידול. העבר את תרחיף התאים לבקבוק תרבית תאים T 25 מצופה בקולגן IV עם מצע גידול שחומם מראש.

צפיפות התאים לזריעה צריכה להיות לפחות 1×10⁴ תאים למיליליטר. החליפו את המצע למחרת והמשיכו להעביר את התאים כפי שנעשה קודם לכן; כאשר התאים יגיעו לקונפלואנציה (confluence), בערך כחמישה ימים מאוחר יותר, ויהיו מוכנים, זרעו את התאים בצפיפות הרצויה עבור הניסויים הבאים. תאי ה-C end אופיינו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של סממנים אנדותליאליים וסממנים של מחסום המוח-דם.

תמונה זו מציגה את המורפולוגיה של תאי C and שצבעו אימונוהיסטוכימית עבור clain five. לתאי C and מורפולוגיה דומה לזו של תרביות ראשוניות של תאי ECS במוח, עם שכבות חד-שכבתיות של תאים מוארכים ודחוסים שהפגינו עיכוב בצמיחה. בהגעה למשכיות (confluence), התאים ביטאו רמות ניתנות לזיהוי של clain.

כאן תאי C CN נצבעו אימונו-היסטוכימית באמצעות נוגדן ל-occludin. כאן אנו רואים את הביטוי של חלבוני VE cadherin, הממוקמים בצומת בין התאים, שוב, כפי שמוצג בצביעת אימונו-פלואורסצנציה. התנגדות חשמלית טרנס-אנדותליית נמדדה באמצעות מערך המכיל אלקטרודות להעברת זרם ומדידת מתח.

ניתן לראות מדמות זו כי ההתנגדות החשמלית התאי-אנדותליאלית של תאי C end עולה עם הזמן בתרבית לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לחקור הפרעות בכלי הדם המוחיים במודל של עכבר.