Name: אינדוקציה של אותות הדבקה תלויי שימוש בעוצמה נמוכה אולטראסאונד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: חקור את מנגנוני האותות התאיים של אולטראסאונד בעוצמה נמוכה בפיברובלסטים תרבותיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח של היווצרות הידבקות מוקדית והפעלת Rac1 לשיפור טיפולים בפצעים כרוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Wellcome Trust מענק 088,419 ל MDB וחסות של Smith &amp; Nephew באנגליה בע&quot;מ

1. ציפוי משטחים עם ליגנד מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אולטראסאונד יחולו על תאים בגודל 3.5 ס&quot;מ וולס, כמו גם מנות בודדות או צלחת 6 היטב. מבחני ביוכימיים, מעיל ליגנד ישירות על גבי פלסטיק. עבור immunofluorescence, זכוכית לרתיחה coverslips שלוש פעמים במים MilliQ ומקום 4 coverslips אל קרקעית הבאר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטחי זכוכית חייב להיות derivatized כדי להבטיח ציפוי ליגנד יעיל. ממיסים sulpho-M-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide אסתר ב PBS על 1 מ&quot;מ. הוסף 2 מ&quot;ל זה טוב דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המשטחים derivatized 3 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל או זכוכית או פלסטיק derivatized מטופל עם ליגנד integrin. החל 2 מ&quot;ל של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל integrin ligand9, מומס PBS המכילה Ca 2 + ו - Mg 2 + זה טוב דגירה לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן monoparticulate BSA על ידי חימום BSA 1%, מומסים PBS, עד 85 מעלות צלזיוס במשך 13 דקות. להתירלהתקרר ואז לעבור דרך מסנן 0.45-מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ליגנד מצופים משטחים 3 פעמים עם PBS ולחסום עם BSA monoparticulate במשך 30 דקות. </li></ol> 2. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלוט על סביבת מטריקס במהלך הניסוי, סינתזת החלבון צריך להיות חסום על ידי תוספת של cycloheximide מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​25-80% fibroblasts confluent למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף cycloheximide שטופלו בתאים עם PBS ולנתק מהבקבוק התרבות באמצעות 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​טריפסין / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים משפחתיים שנכתבו על ידי צנטריפוגה ב 500X גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב DMEM/25 HEPES מ&quot;מ, 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​cycloheximide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת צפיפות התאים של השעיה באמצעות haemocytometer ו לדלל עד 105 מ&quot;ל-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להתאושש integrin פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את ליגנד מצופה, BSA, חסומים בארות 3 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 זרעים מ&quot;ל של תרחיף תאים לתוך היטב כל אחד מהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Alloתאים W כדי להתפשט עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 3. אולטראסאונד גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם פולט אולטרסאונד מערך ג&#39;ל צימוד ל 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בועה אפונה בגודל של צימוד ג&#39;ל כדי פולט כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק כי כל אחד פולט הוא פונקציונלי באמצעות אינדיקטור אולטרסאונד גלאי דיודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבארות על מערך פולט. להחזיר מערך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאפשר הטמפרטורה כדי לאזן במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את האות אולטרסאונד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האות אולטרסאונד יהיה לבטל אחרי 20 דקות, מחקה את המשטר הטיפולי. אם פעמים גירוי קצר נדרשים, צלחות יש להסיר מערך בתזמון הנכון נקודות. בכל המקרים להשתמש unstimulated צלחות כביקורת שלילית. </li></ol> 4. הדבקה ניתוח מיקוד ידי immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של יצירת מוקדי הידבקות, החל את האות 20 דקות אולטרסאונדולאחר מכן אפשר לפתח עבור מבנים של 40 דקות נוספות על ידי שמירה על תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate התקשורת לתקן את התאים על ידי הפעלת 2 paraformaldehyde מ&quot;ל 4% ב PBS. דגירה במשך 14 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate paraformaldehyde ולשטוף שלוש פעמים עם PBS, החלת PBS בעדינות את קצה גם כדי למנוע דור של כוחות גזירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל coverslip מן 3.5 ס&quot;מ גם לצלחת 24 גם עבור מכתים immunofluorescent שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות paraformaldehyde שיורי על ידי יישום 0.5 מ&quot;ל 0.1 מ &#39;גליצין ב PBS לכל אחד 24 בארות. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate גליצין ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilise תאים על ידי יישום 0.5 מ&quot;ל 0.5% טריטון X-100 (w / v) ב PBS. דגירה במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate טריטון X-100 ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום על ידי יישום 0.5 מ&quot;ל 3% (w / v) BSA ב PBS. דגירה בין לילה ב 4 &amp; Dלמשל, ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם vinculin המכילים הידבקות עם מוקד הנוגדן-1 hVIN מדולל 1:400 בבלוק BSA. דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל fluorophore (DyLight 488), מצומדות נוגדנים משני (מדולל 1:200) ו אקטין עם כתם TRITC-מצומדות phalloidin (דילול 1:200) בבלוק BSA. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS, ופעם עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בשקופית כוס בעמדה הפוכה באמצעות להאריך mountant זהב. </li></ol> 5. כימות הפעלת Rac1 ידי assay הנפתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניתוח של הפעלת Rac1, החל את האות 20 דקות אולטרסאונד לתאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. כאשר הערכת זמני תגובה ארוכים יותר מ -20 דקות, החל את האות אולטרסאונד במשך 20 דקות ולשמור על תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור הזמן שנותר כדי לאפשר תגובה לפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate התקשורת המקום היטבים על הקרח. יש לשטוף את הבארות עם 2 מ&quot;ל PBS קר ו aspirate. ודא PBS כל שיורי מוסר על ידי השארת בארות מוטה לרגע 1 ואחריו השאיפה יסודית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים על הקרח עם חיץ 35 תמוגה μl (גליצרול 10%, 20 Hepes mM pH 7.4, 140 מ&quot;מ NaCl, 1% NP40, Deoxycholate נתרן 0.5%, 4 מ&quot;מ EGTA, 4 mM EDTA, 1 × מעכב פרוטאז מלאה) לכל טוב. בדוגמה זו, 6 בארות משמשים בכל נקודת זמן כדי לייצר 210 μl של lysate התא. בארות יותר או פחות יכול לשמש אך נפח lysate סך צריך להסתכם ~ 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים שריטות היטב מגרד התא כדי להבטיח תמוגה התא המלא ולהשאיר בארות מוטה לרגע 1 כדי לאפשר lysate לבריכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת lysate כדי צינור קר כקרח microfuge 1.5 מ&quot;ל (lysates מתאגדים ממשטר טיפול זהה) ואת הספין ב 21000 × גרם ל -2 דקות 4 ° C עד פסולת הסלולר גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 180 μl של lysate לקור קרח 1.5-מ&quot;ל microfuge צינורות המכילים 130 μl של חיץ תמוגה ו 25 μl PAK-שפעathione agarose חרוזים 10. שמור lysate גולמי הנותרים ב -20 מעלות צלזיוס להפרדת ג&#39;ל לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת Rac1 פעיל החרוזים PAK-גלוטתיון agarose ידי סיבוב צינורות במשך 40 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר agarose חרוז conjugates ידי צנטריפוגה ב 2000 × גרם לדקה 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוז conjugates שלוש פעמים עם מאגר 500 תמוגה μl, קציר חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 2000x G ו השלכת supernatant לאחר כל שטיפה. בזהירות להסיר כל חיץ הנותרים לשטוף תמוגה עם פיפטה 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute כל דגימה על ידי הוספת 35 μl חיץ SDS-PAGE ההעמסה דגירה על 85 מעלות צלזיוס על גוש חום רועד במשך 5 דקות. הסר חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 21000 × גרם לדקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתור eluate חרוז על ידי SDS-PAGE, להעביר nitrocellulose ו בדיקה עבור Rac1. </li></ol> 6. נציג תוצאות בפרוטוקול זה אנו מתארים גיוס של vinculin-כתםאד מוקד הידבקויות ו Rac1 פעילות לפי אולטרסאונד. לצורך ניסוי הדבקה מוקד, העמדה הבסיסית היא כי fibroblasts הפזורים על ליגנד של 5 β α 1-integrin לא יוצרים vinculin המכילים הידבקויות (איור 3 א) אלא אם הקולטן fibronectin 2, syndecan-4, עוסקת על ידי תוספת של ליגנד מסיס (איור 3 ב) 3,4. עם זאת, גירוי עם אולטרסאונד גורם להיווצרות מוקדי הידבקות באותה מידה כמו מעורבות של syndecan-4 (איור 3 ג), המציין כי גירוי אולטרסאונד יכול להחליף רכיבים מסוימים של מסלול fibronectin תלוי איתות 5. המשוכה מפתח עם פרוטוקול זה הוא ביטול הקמת מוקד הדבקה בהעדר ממריץ. עיכוב בלתי שלמה של סינתזת החלבון על ידי cycloheximide יאפשר בתצהיר מטריקס כי היא מספקת את התאים אוטומטית לעורר. צפיפות יתר של תאים יכול גם להוביל formatio ברמה נמוכה הידבקות מיקודn ו תגובה גרועה אולטרסאונד כמו crosstalk בין תאים תאים ותא סיכות קשר יסבך הניסוי אשר נועד לבודד גירוי אחד. התפתחות של assay הבסיסית שאנו מציגים אותו ניסוי, חזר עם fibroblasts חסרי syndecan-4 (איור 4). Fibroblasts אלה עדיין להגיב אולטרסאונד (איור 4C), אך אינם מגיבים ליגנד syndecan-4 (איור 4B). הניסוי באמצעות Sdc4 - / - fibroblasts אולטרסאונד מדגים כי אכן יכול לעקוף את הצורך fibronectin קולטנים מסוימים, מדגים כיצד פרוטוקול פשוט ניתן לפתח כדי לקבל מידע נוסף על מסלול איתות. לצורך ניסוי ביוכימי אנחנו מדגימים אולטרסאונד שיכול לגרום הפעלת Rac1, באמצעות assay הנפתח כי הוא עיבוד של השיטה המתוארת על ידי דל פוסו et al. 10. משקעים של פעיל Rac1 0, 10, 30 ו -60 דקות לאחר initiation של גירוי אולטרסאונד מגלה כי Rac1 פסגות פעילות 10-30 דקות, לפני החזרה לקו הבסיס (איור 5). סופג lysates הגולמי של vinculin מבטיח הטעינה שווה בין נקודות זמן. התוצאה דומה הפעלת Rac1 על ידי מעורבות של syndecan 3-4, אבל הוא מעט ממושך יותר מאשר הפעלה באמצעות fibronectin. לכן 8-10 חזרות נדרשים בדרך כלל כדי להשיג נתונים משמעותיים. הפעלת Rac1 אחראי המחויבות של תאים להיווצרות מוקדי הידבקות, ועל הידבקויות מוקד המתהווה מתחיל להיווצר על 10-30 דקות, בד בבד עם הפעלת Rac1. יזם ברגע, הידבקויות אלו ימשיכו להבשיל לתוך הפלאק הדבקה גדולים המוצגים דמויות 3 ו -4. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> באיור 1. טופס גל אולטרסאונד. אולטראסאונד מהווה אות לסירוגין 1.5 MHz כי בשל משרעת נמוכה (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, ממוצע מרחבית, הממוצע הזמני) אין כל השפעה חימום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג סכמטי של עבודה להכנת וגירוי של תאים עם אולטרסאונד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> איור 3. אינדוקציה אולטראסאונד של היווצרות מוקדי הידבקות ב fibroblasts. Fibroblasts פוזרו על שבר integrin מחייב של fibronectin (א &#39;) לפני גירוי עם שבר syndecan-4-מחייב של fibronectin (ב) או אולטרסאונד (C). בעקבות גירוי 60 דקות, התאים היו קבועות, מוכתם עבור vinculin ו אקטין, וצילמו ידי epifluorescence. בר = 10 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> איור 4. אינדוקציה אולטראסאונד של היווצרות מוקדי הידבקות ב fibroblasts חסרי syndecan-4. <em&gt; Sdc4 - / - fibroblasts פוזרו על שבר integrin מחייב של fibronectin (א &#39;) לפני גירוי עם שבר syndecan-4-מחייב של fibronectin (ב) או אולטרסאונד (C). בעקבות גירוי 60 דקות, התאים היו קבועות, מוכתם עבור vinculin ו אקטין, וצילמו ידי epifluorescence. למרות Sdc4 - / - fibroblasts היו fibronectin, חסר רגישות, אולטרסאונד המושרה עדיין היווצרות הידבקות מרחק, מה שמצביע אולטרסאונד עוקף מעורבות הקולטן מטריקס. בר = 10 מיקרומטר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> איור 5. הפעלת Rac1 באולטרסאונד. התאים היו מגורה דקות 0, 10, 30 ו 60 עם 6 בארות המשמשים לכל נקודת זמן. כמות ה-Rac1 GTP בדגימות מן כמובן Rac1 הנפתח זמן assay היה דמיינו ידי הדגירה עם נוגדנים נגד Rac1 על כתם המערבי (תמונה למעלה). כימות עוצמת הלהקה (ממוצע של 8-10 משכפל) מגלה גדל Rac1ctivity כתוצאה האות אולטרסאונד ב 10 ו 30 דקות, לפני חזרתם של רמת הבסיס ב 60 דקות (גרף). ברים שגיאה מייצגים SEM

<ol><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li>
<li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li>
<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li>
<li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li>
<li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li>
<li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li>
<li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive%2C+low-intensity+pulsed+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li>
<li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific%2C+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter%2C+prospective%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li>
<li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li>
<li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII%2FIIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li>
</ol>

אנדרו האריסון הוא עובד של Smith &amp; Nephew בבריטניה מוגבלת.

בפרוטוקול זה אנו מתארים את שיטת הטיפול שחל בדרך כלל בבני אדם ניתן להשתמש בתא מבוססי ניסויים. המטרה הסופית היא להבין את המנגנון המולקולרי של פעולת אולטרסאונד, כך הטיפול יכול להיות מעודן. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) כמערכת מודל התא, אך אולטרסאונד כבר גם נמצא כיעיל העיקריים fibroblasts העורלה האדם 5, בתאי גזע mesenchymal, osteoblasts ו chondrocytes 6. אנו משתמשים Rac1 ההפעלה כמו assay למשל ביוכימי, אך השיטה יכולה לשמש באותה מידה לבחון רגולציה של זירחון חלבונים או היווצרות של קומפלקסים חלבונים על ידי immunoprecipitation. לדוגמה immunofluorescent אנחנו מדגימים אולטרסאונד משפיעים על היווצרות מוקדי הידבקות, אך חלוקה מחדש של מולקולת כל יכול להיבחן. לדוגמה, אפשר לבחון גיוס של גורמים cytosolic קרום פלזמה, colocalisation של proteתוספות ב שלפוחית ​​סחר או לבחון את ההשפעה של אולטרסאונד על הארגון ציר mitotic. עד כה יש לנו את עצמנו מוגבלים לבדיקת fibronectin תלויי המסלולים, על ידי ההשפעה של אולטרסאונד על תאים על קולגן, או בנוכחות גורמי גדילה יכול להיבדק על מנת לבנות תמונה של איך אולטרסאונד משפיע על התנהגות התא בסביבה מורכבת יותר דומה למצב in vivo. אתגר גדול יותר יהיה לבחון את ההשפעה של אולטרסאונד באמצעות זמן לשגות הדמיה, שם הנוכחות של פולט חוסם את נתיב האור תנודות מן המכשולים אולטרסאונד הנוכחי טכניים נוספים. עם זאת, העובדה כי יישום טיפולי דורש רק 20 דקות של גירוי ליום עולה כי ניתוח של התנהגות התא לאחר פרץ של גירוי עשויים להיות יעילים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> sulpho-M-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide אסתר </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 מניות מ&quot;מ המומסים במים ניתן לאחסן ב -20 ° C </td></tr><tr><td> 6 גם תרביות רקמה צלחת </td><td> קורנינג </td><td> 3516 </td><td> פלסטיק של חברות אחרות יכול המעיל גרוע </td></tr><tr><td> 13 מ&quot;מ זכוכית coverslip </td><td> מדעיים וציוד מעבדה Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> כוס של חברות אחרות יכול המעיל גרוע </td></tr><tr><td> PBS </td><td> סיגמא </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + Mg 2 + </td><td> סיגמא </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K integrin ליגנד (שבר fibronectin) </td><td> לבנות תיאור מראשparation ב 9, 11 </td><td></td><td> חלופיות ligands מטריקס יכול לשמש כדי לחקור מסלולים אחרים </td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> סיגמא </td><td> C7698 </td><td> ניתן לאחסן מלאי 10mg/ml במים </td></tr><tr><td> DMEM/25 HEPES מ&quot;מ </td><td> סיגמא </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exogen 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צימוד אולטראסאונד ג&#39;ל </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS אינדיקטור </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> סיגמא </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-מצומדות נגד העכבר </td><td> Stratech מדעי </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC שכותרתו phalloidin &lt;/ Td&gt; <td> סיגמא </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך מגיב antifade זהב </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> מעכב פרוטאז מלא (EDTA חינם) </td><td> רוש </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × המניות מורכב מ Tablet המאוחסן ב -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK-גלוטתיון agarose חרוזים </td><td> לבנות תיאור והכנת ב 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> אפולו מדעי </td><td> BI8181 </td><td> הפוך את המניות pH 1M ו 7.4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> דיג </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> סיגמא </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן Deoxycholate </td><td> סיגמא </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> סיגמא </td><td> E4378 </td><tד&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של אותות הדבקה תלויי שימוש בעוצמה נמוכה אולטראסאונד

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

באורגניזמים תאיים, התנהגות התא מוכתב על ידי אינטראקציות עם תאי המטריצה. התוצאות של מטריקס מגוון, מעורבות של רגולציה של נדידת תאים ו ההפצה, על הפרשה ואף בידול. את האותות שבבסיס כל אלה תהליכים מורכבים נובעים אינטראקציות מולקולריות של קולטני תאי מטריקס על פני השטח של התא. Integrins הם קולטנים prototypic ולספק קישור מכני בין תאי מטריקס ו cytoskeleton, כמו גם ליזום כמה הידבקות תלויי מפלי איתות. עם זאת, זה הופך להיות ברור יותר ויותר כי הקולטנים הטרנסממברני נוספים לתפקד לצד integrins את להסדיר הן את עצמו integrin אותות במורד הזרם. האלגנטי ביותר של דוגמאות אלה היא proteoglycan הטרנסממברני, syndecan-4, אשר משתפת פעולה עם β 5 α 1-integrin במהלך הדבקה על fibronectin. במודלים ב vivo demonstrאכלו את החשיבות של syndecan-4 איתות, כמו syndecan-4-בנוקאאוט עכברים להפגין פיגור ריפוי עקב 1,2 פיברובלסטים יעיל ההגירה. ב wild-type בעלי חיים, נדידת fibroblasts כלפי הפצע מופעלת על ידי הופעתו של fibronectin כי ההדלפות נימים פגומים מופקד על ידי מקרופאגים ברקמה הפגועה. לכן יש עניין רב לגלות אסטרטגיות המשפרות fibronectin תלויי איתות יכול להאיץ את תהליכי התיקון. הרכיבים integrin בתיווך syndecan ו-4-בתיווך של fibronectin תלויי איתות יכול להיות מופרדים על ידי תאים מגרה עם שברי fibronectin רקומביננטי. למרות מעורבות integrin חיוני הידבקות התא, fibronectin מסוימים תלויי אותות מוסדרים syndecan-4. Syndecan-4 מפעיל את האות Rac1 ובולטות 3, גורם integrin חלוקה מחדש 1, מפעילה גיוס של מולקולות cytoskeletal, כגון vinculin, אל מוקדהידבקויות 4, ובכך גורם 3 כיווני ההגירה. בחנו את אסטרטגיות חלופיות עבור הפעלת אותות כאלה ומצא כי בעוצמה נמוכה אולטרסאונד פעמו (LIPUS) יכולים לחקות את ההשפעות של מעורבות-4 syndecan 5. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השיטה שבאמצעותה 30 mW / cm 2, 1.5 אולטרסאונד MHz, פעמו ב kHz 1 (איור 1) ניתן ליישם fibroblasts בתרבות (איור 2) לגרום Rac1 הפעלה היווצרות מוקדי הידבקות. גירוי אולטראסאונד מוחל לכל היותר 20 דקות, כי זה שילוב של פרמטרים כבר נמצא להיות יעיל ביותר עבור האצת תיקון שבר קליני 6. השיטה משתמשת שברי fibronectin רקומביננטי לעסוק α β 5 1-integrin, ללא מעורבות של syndecan-4, והוא דורש עיכוב של סינתזת החלבון על ידי cycloheximide לחסום בתצהיר של מטריקס נוספת של fibroblasts ועוד, השפעה חיובית Oאולטרסאונד אישה על מנגנוני התיקון מתועדת היטב 7,8, ועל ידי הבנת ההשפעה המולקולרי של אולטרסאונד בתרבות אנחנו צריכים להיות מסוגלים לשפר את הטכניקה הטיפולית כדי לשפר את התוצאות הקליניות.

פרוטוקול זה מתאר את הגירוי של fibroblasts בתרבית עם אולטרה סאונד בעוצמה נמוכה פעמו, המניע ליצירת מוקדי הידבקות ו Rac1 ההפעלה על ידי חיקוי האירוסין של הקולטן הטרנסממברני מטריקס, syndecan-4. גישה זו מאפשרת חקירה של טכניקה קליני מוצלח ברמה התאית, ובכך לספק הזדמנויות עידון של טיפול.

באורגניזמים רב-תאיים, התנהגות התא נקבעת על ידי אינטראקציות עם המטריקס החוץ-תאי. ההשלכות של המעורבות במטריקס נעות בין...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להבין את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם אולטרסאונד פועם בעוצמה נמוכה או ליפו משפיעים על נדידת תאים ובכך מאיצים את תיקון הרקמה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי טיפול בתאים עם cyclo heximide למשך שעתיים כדי למנוע ביטוי חלבון de novo ובכך למנוע עיבור עצמי של התאים. השלב השני של הפרוצדורה הוא פריסת תאים מנותקים למשך שעתיים על משטחים שצופו בליגנד מטריקס שהוגדר בקפידה.השלב השלישי הוא גירוי התאים באמצעות אולטרסאונד, על ידי חיבור פלטות תרביות התאים לפולטי האולטרסאונד באמצעות ג'ל. התוצאות עשויות להראות שינויים בהיווצרות הדבקות מוקדיות (focal adhesion) כתוצאה מגירוי האולטרסאונד, באמצעות צביעת התאים עבור cullin ואקטין, וכן שינויים זמניתים בהפעלה של RAC1 באמצעות בדיגות pull-down של RAC1 פעיל ו-western blotting לאחר מכן. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השליחויות של ההדבקה, כגון האם מניפולציה פיזית של תאים יכולה להחליף גירויים כימיים כגון גורמי גדילה או fibrin actin?וכיצד מניפולציה פיזית זו מעוררת נדידה של תאים? המשמעויות של טכניקה זו נשתרעות עד לטיפול בפצעים כרוניים, מכיוון שעל ידי הבנת האופן שבו אולטרסאונד עשוי להשפיע על התנהגות התאים, עשויים להיות מסוגלים לדייק טיפולים להאצת סגירת פצעים באנשים עם פגמים בריפוי פצעים, כגון חולים קשישים או חולי סוכרת. עבור בדיקות ביוכימיות, כסו ישירות את הבארים של פלטות פלסטיק בנפח 3.5 centimeter בליגנד של אינטגרין.עבור אימונופלואורסצנציה, הרתיחו כיסויות זכוכית שלוש פעמים במים מזוקקים (milli Q). לאחר מכן, מקמו ארבע כיסויות בכל פלטה של 3.5 סנטימטר. כדי להבטיח ציפוי ליגנד יעיל, בצעו דריבטיזציה של כיסויות הזכוכית על ידי הוספת 2 mL של 1 mM sulfa MBS לכל באר; המתינו 30 דקות למהלך התגובה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו את המשטחים שעברו דריבטיזציה שלוש פעמים עם PBS. כעת, צפו את הזכוכית שעברה דריבטיזציה ב-2 mL של ליגנד אינטגרין.הוסיפו את הליגנד לכל באר והדגירו את הפלטות למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, הכינו BSA מונו-חלקיקי על ידי חימום של 1% BSA, המומס ב-PBS, לטמפרטורה של 85°C למשך 13 דקות. המתינו לקירור ולאחר מכן סננו דרך מסנן של 0.45 micron. ראשית, שטפו את המשטחים המצופים בליגנד שלוש פעמים באמצעות PBS, ושנית, חסמו את המשטחים עם ה-BSA המונו-חלקיקי שהוכן למשך 30 דקות.על מנת לשלוט בסביבת המטריקס לאורך הניסוי, יש לחסום את סינתזת החלבון על ידי הוספת 25 micrograms per milliliter cyclo heximide לפיברובלסטים בהסמיכות של 80% למשך שעתיים. שטפו את התאים שעובדו ב-cyclo heximide בעזרת PBS, תלו את התאים ומרקזו אותם למשקע. השעיקו מחדש את התאים בתמיסת A-D-M-E-M בריכוז סופי של 10,000 cells per milliliter בעזרת hemo cytometer.כעת הדגרימו את התאים שהושחלו מחדש בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את הפלטות שלוש פעמים עם PBS לפני זריעת 2 mL של תרחיף התאים לכל באר. אפשרו לתאים להתפשט למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2. התחילו בחימום של מערך פולטי האולטרסאונד ושל ג'ל הצימוד.לאחר החממה, מרחו כמות קטנה (בגודל גרגר אפונה) של ג'ל צימוד על כל פולט כדי לבדוק שכל פולט תקין. בעזרת גלאי דיודה למחווה אולטרסאונדית, אפשרו לג'ל לצמד את הפולט לגלאי. אם הפולט תקין, ה-DDE יידלק.למכשיר יש הגדרות קבועות והוא יספק אולטרסאונד בתדר של 1.5 megahertz בפולס של one kilohertz, בעוצמה של 30 milliwatts לסנטימטר רבוע. המכשיר יכבה באופן אוטומטי לאחר 20 דקות. הניחו את הבארות על מערך הפולט, החזירו את המערך לאינקובטור, והמתינו 10 דקות עד להשגת שיווי משקל בטמפרטורה; הפעילו את אות האולטרסאונד בספק הכוח.אות האולטרסאונד יופסק לאחר 20 דקות. ניתן לדמות את המשטר הטיפולי במידה ונדרשים זמני גרייה קצרים יותר. ניתן להוציא את הפלטות מהמערך במועד המתאים.עבור זמני גרייה ממושכים יותר, יש להשאיר את הפלטות על המערך ולאפשר להן להתפתח. ניתן להפעיל מחדש את הפולט, אך לא ראינו תועלת נוספת כשעשינו זאת. בכל המקרים, יש להשתמש בפלטות שלא עברו גרייה כביקורת שלילית.לניתוח של היווצרות הידבקותים מוקדיים (focal adhesions), החיל אות Ultrasound למשך 20 דקות על זכוכית כיסוי מצופה S, ולאחר מכן הדגרה אותם למשך 40 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 °C. שלב זה מאפשר להידבקותים המוקדיים להתפתח. לאחר מכן, שאבו את המצע החוץ-תאי.הוסף שני milliliters של חומר מקבע והמתכן 14 דקות. הסר את חומר הקיבוע באמצעות שאיבה ושטוף בזהירות את התאים שלוש פעמים ב-PBS. החל את ה-PBS לאורך קצה הבאר והנח לפתרון להתפשט בעדינות.לאחר ששטפו אותן עד לניקיון, העבירו כל כיסוי זכוכית מהבאר בעלת ה-3.5 סנטימטר לפלטת 24 בארות לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית בהמשך. לאחר תקופת הגירוי הרצויה, שאבו את המצע ושטפו את התאים עם PBS על קרח, ואז lysed את התאים בבופר הליזה המתאים לבדיקה הביוכימית המועדפת עליכם. אנו מנתחים בדרך כלל הפעלה אחת באמצעות בדיקת effector pull down.בפרט, ניתן להשתמש בשיטה זו לצורך ניתוח ביוכימי של כל מסלול איתות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההשראה של vinky ושל focal adhesions צבועים ושל פעילות RAC one באמצעות אולטרסאונד עבור ניסויי ה-focal adhesion. מצב הבסיס הוא שפיברובלסטים הפרוסים על ליגנד של alpha five beta one integrin אינם יוצרים adhesion המכילים finkel, אלא אם כן קולטן מקשר פיברואיני שני, syndicate four, מופעל על ידי הוספת ליגנד מסיס.עם זאת, גירוי באמצעות אולטראסאונד משרה יצירת הדבקות מוקדיות (focal adhesions) במידה דומה למעוררות של syncom four, מה שמעיד כי גירוי באולטראסאונד יכול להחליף רכיבים מסוימים של נתיב השיגנלינג של fibrin neck independence. כפיתוח של הבדיקה הבסיסית, אנו מציגים את אותו הניסוי חוזר עם פיברובלסטים חסרי INDICUM four. פיברובלסטים אלו עדיין מגיבים לאולטראסאונד, אך אינם מגיבים לליגנד של INDICUM four.דבר זה מוכיח כי אולטרסאונד אכן יכול לעקוף את הצורך ברספטורים מסוימים של פיברין. בניסוי הביוכימי, אנו מדגימים כי אולטרסאונד יכול להשרות הפעלה של RAC1 באמצעות בדיקת pull down; שיקיעה של RAC1 פעיל ב-0, 10, 30 ו-60 דקות לאחר תחילת הגירוי באולטרסאונד מגלה כי פעילות RAC1 מגיעה לשיאה ב-10 עד 30 דקות לפני שהיא חוזרת לקו הבסיס. שימוש בליסאטים גולמיים של cullin מבטיח טעינה שקולה בין נקודות הזמן השונות.התוצאה דומה להפעלה של RAC one על ידי מעורבות של syndicate four, אך היא ממושכת מעט יותר מאשר הפעלה על ידי fibronectin. לכן, נדרשים בדרך כלל שמונה עד 10 חזרות כדי להשיג נתונים משמעותיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבטל גירויים נוספים על ידי חסימה מלאה של סינתזת חלבונים עם cyclo heide, הימנעות מזיהום של מצעי תרבית בניסוי ומניעת צפיפות יתר של תאים הגורמת למגעים בין תאים בעקבות הליך זה.ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון בדיקות פצע (scratch wound assays), כדי לבחון שאלות נוספות, למשל, כיצד אולטרסאונד מעורר נדידת תאים?

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Insonation של microbubbles היא אסטרטגיה מבטיח אבלציה הגידול במועד, בממוצע סמכויות מופחת אקוסטי, כמו גם עבור משלוח ממוקד של הרפוי. מטרת המחקר הנוכחי היא לפתח נמוך מחזור אולטרסאונד אסטרטגיות פועם nanocarriers על מנת למקסם את אי - אבלציה תרמית כלי הדם ואספקת מטען אל תת עורית C6 gliomas.

אולטראסאונד ניגודיות ממוקד טיפול gliomas של עכברים באמצעות אספקת סמים נושאות Nanoparticle ו אבלציה כלי הדם

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

ניתן להשיג נזק סלקטיבי לתאי לוקמיה אנושיים באמצעות גישה חדשה של יישום אולטרסאונד בתדר נמוך עם ובלי טיפול מקדים כימותרפי בתאים לוקמיים ותאים המטופויאטיים נורמליים.

דור וניתוח כמותי של תדר נמוך פעמו אולטראסאונד כדי לקבוע את הרגישות של סוניק שלא טופלו ותאים שטופלו neoplastic

פרוטוקול זה מדגים את התגרענות לשליטה של קוויטציה ב פנטומים ג'ל, באמצעות חשיפה סימולטני-סגול אור פעמו לייזר והן בעוצמה גבוהה, ממוקדת אולטרסאונד (HIFU). הפעילות קוויטציה יכול לשמש לאחר מכן לשיפור השימושים HIFU הדמיה ו/או טיפולית.

התגרענות לשליטה של קוויטציה מן Plasmonic חלקיקי זהב לשיפור בעוצמה גבוהה ממוקד יישומים אולטרסאונד

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

בעוצמה נמוכה פעמו אולטרסאונד גירוי (LIPUS) הוא מודאליות עבור גירוי מכני לא פולשנית של תאים אנדוגני או מהונדסים עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאמר זה מתאר כיצד ליישם את LIPUS כדי במיקרוסקופ epi-זריחה וכיצד למזער את אי התאמה של עכבה אקוסטיים לאורך השביל אולטרסאונד כדי למנוע חפצי מכני לא רצויים.

ריבוב ממוקד אולטרסאונד גירוי עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

ניתן להשתמש בפרוטוקול הניסיוני המוצג לביצוע מדידות בזמן אמת של פעילות cavitation במכשיר תרבות תאים במטרה לאפשר חקירה של התנאים הנדרשים לאספקת תרופות מוצלחת ו/או ביו-אפקטים אחרים.

לימוד טיפול משופר Cavitation

טכניקה מהירה ואמינה מוצעת לשליטה בתנודות הצורה של בועה אקוסטית אחת לכודה המבוססת על טכניקת התלכדות בין שתי בועות. תנודות צורת הבועה במצב יציב ומבוקרות סימטריה מאפשרות ניתוח של זרימת הנוזל הנוצרת בקרבת ממשק הבועות.

השראת מיקרו-סטרימינג על ידי תנודות בועות לא כדוריות במערכת ריחוף אקוסטית

מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

הפרעה במחסום הדם-חוט השדרה (BSCB) יכולה להיות מושגת בהצלחה עם מתן תוך ורידי של מיקרו-בועות ויישום אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU). פרוטוקול זה מפרט את פתיחת ה- BSCB באמצעות LIFU במודל מכרסמים, כולל הגדרת ציוד, הזרקת מיקרו-בועות, לוקליזציה של מטרות והדמיית הפרעה של BSCB.

הפרעה במחסום הדם-חוט השדרה באמצעות אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה במודל חולדה

פרוטוקול זה מתאר מערכת קיבוע מתמר אולטרסאונד שתוכננה במיוחד לגירוי אולטרסאונד של חוט השדרה בעכברים ערים. השיטה משתמשת במערכת קיבוע כדי להבטיח מיקום מדויק של מתמר האולטרסאונד ובמקביל מאפשרת לנבדקים לנוע בחופשיות מבלי לפגוע בדיוק הגירוי.

קיבוע מתמרי אולטרסאונד לנוירומודולציה של חוט השדרה בעכברים

חקור את מנגנוני האותות התאיים של אולטראסאונד בעוצמה נמוכה בפיברובלסטים תרבותיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח של היווצרות הידבקות מוקדית והפעלת Rac1 לשיפור טיפולים בפצעים כרוניים.

אינדוקציה של אותות הדבקה תלויי שימוש בעוצמה נמוכה אולטראסאונד

גלה סרטונים נוספים