זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

גדיל שלילי של ליקו, נגיפי RNA. הגנום של נגיפי שפעת ארוז בצורה של קומפלקסים של חלבון גרעיני צלעות ויראליות, או VR nps שבו הגנום החד-גדילי עטוף על ידי החלבון הגרעיני וקשור לקומפלקס הפולימראז הכורכום המורכב מיחידות המשנה PA PB 1 ו-PB שתי לטיהור קומפלקסים שלמים מתאי יונקים נגועים. תאי הלה מודגרים עם נגיף שפעת מתויג סטרפט רקומביננטי.

ברגע שהנגיף נכנס לתאים, ה-RNA הנגיפי מסונתז בגרעינים לאחר ההדבקה, התאים משקרים לשימוש בחומר ניקוי ומחולקים לשברי גרעין וכרומטין ציטופלזמיים באמצעות פרוטוקול שבר כרומטין מבוסס צנטריפוגה ותקיפה. לבסוף, ה-VRPs המתויגים בסטרפט מטוהרים מכל שבר ניתוח של הרכב החלבון וה-RNA של VR NPS מטוהר על ידי צביעת כסף מדגים כי באמצעות פרוטוקול זה אפילו הדוק, ניתן לבודד VRPs קשורים לכרומטין ללא פגע. אז אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול שלנו בהשוואה לשיטות סטנדרטיות לטיהור זיקה של קומפלקסים של חלבון גרעיני צלעות של נגיף השפעת הוא שעל ידי שימוש בשיטה שלנו, ניתן לטהר VR NPS מהכרומטין של תאים נגועים, הידוע כאתר של סינתזת mRNA של נגיף השפעת.

כך שניתן להשתמש בשיטה שלנו כדי לענות על שאלות הנוגעות לוויסות שכפול ושעתוק ויראלי, כגון, למשל, אילו גורמים ויראליים או תאיים, אך גם אילו שינויים לאחר התרגום נדרשים, למשל, סינתזת mRNA ויראלית או גם סינתזת RNA גנומית ויראלית. לכן חוקרים חדשים בשיטה זו עשויים להיתקל בקושי מסוים מכיוון שפיצול תת-גרעיני רגיש מאוד לתנאים ביוכימיים והוא יכול גם להשתנות מאוד בין קווי תאים שונים. התחל את הפרוטוקול הזה עם ריפוי התאים שלנו שנדבקו בנגיף השפעת, RWSN PB שני סטרפטוק, שיש לו תג סטרפטוקוס מאוחה גנטית לקצה C של תת-היחידה PB 2 בריבוי הדבקה של שלוש.

שוטפים את התאים פעם אחת עם PBS קר, ואז מוסיפים 12 מיליליטר PBS קר ומוציאים אותם מהצלחת. בעזרת מגרד גומי. העבירו את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וגלו אותם באמצעות צנטריפוגה.

ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא פרוטוקול פיצול התאים. גרעיני התאים רגישים מאוד להומוגניזציה ולהליכי ערבוב, ואם זה מבוצע בצורה לא נכונה, זה יכול בקלות להרוס תמצית כרומטין. לכן חשוב מאוד לעקוב לא רק אחר טכניקות ההומוגניזציה, אלא גם הטיפול הכללי בליזטים כפי שאנו מראים כאן.

לאחר שאיבת הספין, ה-PBS וה-Resus, משהים את כדור התא ב-10 מיליליטר של מאגר סוכרוז קר. חבר קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר לפיפטה מפלסטיק של 10 מיליליטר והעביר את התאים דרכו כדי לפרק גושי תאים. דגרו את המתלה על קרח למשך 10 דקות.

מעת לעת הופכים את התאים בעדינות כדי להשעות אותם מחדש. לאחר מכן, הוסף שאינו IET P 40 לריכוז סופי של 0.5% ומערבולת במהירות גבוהה למשך 15 שניות מיד צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-3, 500 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחנית. לאחר הסיבוב, הסר את הסופינט והעביר אותו לצינור של 15 מיליליטר לצינור חרוטי.

אחסן את השכיבה בארבע מעלות צלזיוס. זהו שבר ציטופלזמי. הגלולה צריכה להיות קטנה ולבנה יותר מכדורית התא המקורית כפי שמוצג כאן.

אם הפרוטוקול יושלם במועד מאוחר יותר, אחסן את כדור התא בארבע מעלות צלזיוס. אחרת, המשך בשטיפת הגלולה בחמישה מיליליטר סוכרוז קר, חיץ וצנטריפוגה כמו קודם. לאחר השלמת הסיבוב, השליכו את הסופינט והשעו מחדש את הגלולה, המכילה את הגרעינים ב-1.5 מיליליטר של מאגר מיצוי פלזמי גרעיני קר.

העבירו את הגלולה המרחפת להומוגניזטור ריקוד צונן של ארבעה מיליליטר עם עלי הדוק והומוגניזציה של הגרעינים ב -20 פעימות. הימנעות מקצף, ההתנגדות צריכה לעלות לאחר כ -10 פעימות. כדי לאשר הומוגניזציה יעילה, בדוק את הדגימה במיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

הגרעינים כבר לא צריכים להיות עגולים, אלא בעלי צורות לא סדירות ולהיראות כאילו הם התפוצצו. לאחר שהגרעינים הומוגניים, העבירו אותם לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. דגרו את ההומוגנאט על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

ואז צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G במיקרו צנטריפוגה למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב העבירו את הספינאט, שהוא השבר הפלזמי הגרעיני לצינור של 1.5 מיליליטר, ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס. ואז ריס משהה את הגלולה בעיכול של 1.5 מיליליטר, חוצץ מראש ל -37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן דגרו את השבר למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו 42 מיקרוליטר של נתרן כלורי מולארי כדי להביא את הריכוז הסופי של נתרן כלורי ל-150 מילימולר ואז דגרו למשך 20 דקות על קרח. צנטריפוגה פי 16, 000, G במיקרו צנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר הסיבוב, הסר את הסופינטה ואחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. זהו CH אחד 50 חלק. ריסים מכופפים את הכדור ב-1.5 מיליליטר של מאגר מלח גבוה וקר ודוגרים במשך 20 דקות על קרח.

צנטריפוגה פי 16, 000, G במיקרו צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הסיבוב, הסר את הסופ נטנט ואחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. זהו שבר CH 500.

הוציאו את השברים שנשמרו במהלך פרוטוקול הפיצול והניחו אותם על קרח. ואז לשבר הציטופלזמי, הוסף 300 מיקרוליטר של חמישה נתרן כלורי מולארי. לאחר מכן העבירו 100 מיקרוליטר של סטרפטוקוס T ארוז בחרוזי Sphero לכל שבר לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

הוסף 10 נפחים של מאגר שטיפת סטרפטוקוקוס לחרוזים. הפוך את הצינור לערבוב וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב 1000 פעמים. G בצנטריפוגה שולחנית, השליכו את ה- sna.

חזור על שטיפת החיץ פעמיים, ולאחר מכן ריס מכופף את הגלולה בנפח שווה של מאגר שטיפת סטרפטוק, הוסף 200 מיקרוליטר של סטרפטוקוס שטוף פעל בתמיסת חרוזים לכל שבר. סובב את הצינורות למשך שעה בחום של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן צנטריפוגה של הצינורות למשך דקה אחת ב 1000 כפול G של ארבע מעלות צלזיוס, השליכו את הסופינאט.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לחרוזים לחרוזים המודגרים עם השבר הציטופלזמי בצינור של 15 מיליליטר. הוסף את מאגר הכביסה והעביר את החרוזים לצינור של 1.5 מיליליטר. שוטפים את החרוזים למשך דקה אחת, ואז צנטריפוגה את הצינורות למשך דקה אחת ב 1000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.

חזור על הפעולה פעמיים לאחר שלב הכביסה האחרון. הסר את כל עקבות מאגר הכביסה באמצעות קצה פיפטה שטוח. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של מאגר אלוציאני ומערבבים בעדינות ומניחים את הצינורות על קרח למשך 15 דקות.

במהלך הדגירה, מערבבים מדי פעם את החרוזים על ידי הקשה עדינה על תחתית הצינורות. לאחר שחלפו 15 דקות צנטריפוגה לבחור למשך דקה אחת ב 1000 כפול G בארבע מעלות צלזיוס. אסוף את הסנה המכילה את הסטרפטוקוס המתויג VRPs.

התאים שלנו היו נגועים בזן נגיף השפעת, WSN במשך תשע שעות, והליזטים המפוצלים נותחו על ידי פריחה מערבית כפי שמוצג כאן. בידוד גרעיני עדין מחלץ ביעילות חלבונים ציטופלזמיים כגון טובולין תוך הימנעות משחרור חלבונים גרעיניים בשפע. שימו לב שחלק הכרומטין המופק במלח נמוך מועשר בחלבונים החשובים לשעתוק.

בעוד שחלק המלח הגבוה מכיל בעיקר נוקלאוזומים לקביעת הרכב החלבון של השבר הציטופלזמי המנומק, V NPS מתאי R הנגועים במשך תשע שעות בנגיף לא מתויג, RWSN או RWSN PB שני סטרפטוקוקוס נותחו על ידי צביעת כסף כפי שמוצג עבור פליטה ציטופלזמית. כאן יש יחס גבוה של NP ל-PA PB אחד, PB 2 כפי שמעידה הרצועה העיקרית מעל 55 קילודלטון בהשוואה לרצועות שבין 95 ל-100 קילודלטון, מה שמצביע על כך שרוב הסטרפטוקוס PB 2 מטוהר כחלק מ-VRNP שנוצר במלואו, או במילים אחרות, מעט פולימראז מסיס נלכד כדי להשוות את היבול היחסי. VR NPS מטוהר לאחר תשע שעות של זיהום ב-RWSN PB שני סטרפטוקוס או RWSN או כסף מוכתמים כפי שמוצג בג'ל כתם כסף זה ניתן לטהר מכל ארבעת השברים התאיים לאחר תשע שעות של הדבקה.

הריכוז הגבוה ביותר של v RMPs נמצא בפלזמה הגרעינית, אם כי ניתן לטהר חלקים ניכרים גם מהציטופלזמה והכרומטין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר תשואות גבוהות של קומפלקסים שלמים של ריבונוקלאופרוטאין של נגיף השפעת מגרעין התאים הנגועים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במאגרים נקיים ולהימנע מחשיפת הדגימות שלא לצורך לטמפרטורת החדר מכיוון שכך תוכלו להימנע מפירוק RNA וחלבון, כמו גם מפירוק קומפלקס חלבון.

ואל תשכח שעבודה עם נגיף שפעת זיהומי עלולה להיות מסוכנת. יש לבצע את כל השלבים תחת שולחן עבודה ברמת בטיחות ביולוגית שנייה עד להוספת NP 40 לליזטים.