בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה
8 באוגוסט 2012
מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי אנדותל אנושיים באיכות גבוהה ולהשתמש בהם כדי לבחון את המנגנוסים המווסתים נדידה של נויטרופילים (trans migration) בתנאי זרימה. זאת מושג תחילה על ידי בידוד והזרקה של תאי אנדותל מווריד השמירה האנושי (human umbilical vein endothelial cells). השלב השני הוא פיצול התאים לתאי IBD.
בשלב הבא, נויטרופילים אנושיים שבודדו זה עתה מופזרים על פני תאים אנדותליאליים מופעלים, דבר שמוביל להתגלגלות, היצמדות חזקה ומעבר (transmigration) של הנויטרופילים. השלב הסופי הוא כימות המעבר באמצעות מיקרוסקופיית וידאו. לבסוף, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובמיקרוסקופיית שדה בהיר כדי להעריך את מעבר הנויטרופילים דרך תאים אנדותליאליים מופעלים.
בידוד תאי אנדותל הוא תהליך שקל לתאר, אך קשה ללמידה, בין היתר משום ששלבים מרכזיים דורשים ויזואליזציה של חבל הטבור. מסיבה זו, הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שיטה זו תסייע לנו להבין שאלות מרכזיות בתחום הדלקת, כגון כיצד מתבצע גיוס לוקוציטים בתנאי זרימה, ותספק הבנה טובה יותר לגבי התנהגות תאי אנדותל בתנאי זרימה.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי גיוס נויטרופילים במהלך דלקת, ניתן ליישמה גם עבור אוכלוסיות נדירות של לוקוציטים, כגון תאי NK (natural killer cells) ואאוזינופילים. את ההליך הזה מדגימה יחד עם Ritu Sharma השם Hong Jang, טכנאית במעבדה שלי. לפחות שעה אחת לפני הפרוצדורה, יש להכין את ה-preco, ולאחר מכן להדגיר בקבוק T 75 עם ג'לטין בטמפרטורה של 37 °C.
לאחר מכן, התחילו את הליך בידוד התאים האנדותליאליים תחת מנדף זרימה למינרית, באמצעות מספריים לחיתוך חבל טבורי מפלצנטה. לאחר החלפה לכפפות סטריליות, בחנו את החבל מקרוב והשליכו כל חלק המכיל קרישי דם או פגוע כתוצאה מהידוק החבל במהלך הלידה. לאחר מכן, זהו את שני העורקים ואת הווריד היחיד הנמצאים בחבל.
בשלב הבא, הכניסו בעדינות קנולה עם ברז בידומי (stop cock) דו-כיווני המחובר אליה לאחד מקצות הווריד, ולאחר מכן הניחו תסמיך (clamp) סביב הקנולה כדי לקבע אותה במיקומה. אחד החלקים המאתגרים ביותר בפרוצדורה הוא ביצוע הפרפוזיה לחבל הטבור. כדי להבטיח שהדבר יבוצע בהצלחה, בצעו הפרפוזיה לחבל הטבור עם כמות עודפת של בופר ועקבו אחר הזרימה עד שתהיה שקופה.
בצעו פרפוזיה לווריד עם בופר שרוך עד שהזרימה תהיה צלולה, ואז סגרו את קצה השרוך באמצעות קלמפ. לעיתים במהלך הפרפוזיה נחשף חור קטן שנוצר עקב שאיבת דם שרוך מהשרוך הטבילי על ידי רופאים. במצבים אלו, ניתן להשתמש בהמוסטאטים כדי לחסום את החור ולהמשיך בפרפוזיה תוך כדי בידוד תאי אנדותל.
חשוב ביותר לתזמן במדויק את הטיפול בקולגנז. זמן קצר מדי לא יאפשר קציר של מספיק תאי אנדותל, וזמן ארוך מדי עלול להוביל לזיהום על ידי תאי שריר חלק או לנזק לתאי האנדותל. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לווריד עם קולגנז חם שהוכן acabado.
סגרו את הברז (stop cock) והדגירו את השפופרת בביーカー המכיל בופר שפופרת (cord buffer) חם. לאחר 10 דקות, הוציאו את השפופרת ועסו אותה בעדינות כדי לשחרר את התאי האנדותל מהלומן של הווריד. רוקנו את התמיסה למבחנה המכילה 5 mL של מצע תאי אנדותל או ECM, תוך שטיפת השפופרת בבופר שפופרת פעמיים כדי להסיר תאים שנותרו.
כעת סובבו את התאים למטה למשך 10 דקות ב-3 × 50 g. בטמפרטורת החדר, הסירו את העלייה (supernatant) ולאחר מכן השעיו מחדש את המשקע (pellet). העבירו את התאים לתוך בקבוק T75 מצופה ג'לטין ב-10 milliliters של מצע גידול לתאי אנדותל, וגדלו את תאי האנדותל למשך לילה ב-37 °C ו-5% CO2. למחרת, נערו בעדינות את הבקבוק כדי להסיר תאי דם אדומים שנדבקו.
לאחר מכן, הסירו את הנוזל העליון ושטפו את תרבית התאי האנדותליים ב-HBSS חמים. לאחר הסרת ה-HBSS, הגבישו את התאים עם 10 milliliters של ECM חמים. לאחר מכן, בחנו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שכדוריות הדם האדומות הוסרו וכדי להעריך את דרגת ההיתוך (confluence) ואת המורפולוגיה של התאים האנדותליים.
המשיכו להחליף את המצע כל שלושה ימים עד שהתאים יגיעו למצב של התמזגות מלאה (confluency). בנקודה זו, פצלו את התאים באמצעות תמיסת trypsin ו-EDTA. לאחר מכן, אספו את התאים שהשתחררו ותלו אותם מחדש ב-ECM.
לבסוף, ציפו כל באער של תא IBD בג'לטין. הסירו את עודפי הג'לטין ולאחר מכן הוסיפו 1.5 × 10⁶ פר מ"ל של תרחיף תאי אנדותל לכל באער בתא.
בודדו נויטרופילים מדם פריפריאלי של מתנדבים אנושיים בריאים באמצעות סנטריפוגת גרדיאנט צפיפות כפי שפורסם בעבר, ולאחר מכן השעו את התאים בריכוז של 10⁶ למילליטר ב-HBSS בתוספת אלבומין אנושי. לאחר הגדרת המיקרוסקופ, חברו את תא ה-IBD המכיל את התאים האנדותלליים המגורים לצינורות של המיקרוסקופ. בחרו בעדשה אובייקטיבית של 10x בניגודיות פאזה, ולאחר מכן הגדירו את משאבת המזרק לשאיבה והתחילו את זרימת ה-HBSS במאמץ גזירה הרצוי.
עצרו את הזרימה לזמן קצר על ידי סיבוב הברז התלת-דרכי בצד היציאה למצב כבוי (off) והעברת קו הכניסה מ-HBSS לנויטרופילים מבודדים. הפעילו שוב את הזרימה על ידי סיבוב הברז חזרה למצב פעיל (on). לאחר מכן, התחילו בהקלטה באמצעות מצלמת CCD המחוברת למקליט DVD.
הפעל את הטיימר. כאשר נויטרופילים נכנסים לתא לאחר ארבע דקות, החלף חזרה ל-HBSS כדי למנוע היצמדות של נויטרופילים חדשים. במידה ומבוקשים נתונים על סך האינטראקציות של גלגול והיצמדות חזקה, השתמש בעדשה של 10x בניגודי פאזה (phase contrast).
יש לדגום ששה שדות ראייה אקראיים למשך 10 שניות כל אחד בין הדקות הרביעית והחמישית. לבסוף, יש לעבור לעדשה עם הגדלה של 40x ולהקליט שדה ראייה בודד בנקודת הזמן הרלוונטית. לאחר פוזיה של נויטרופילים בדקה ה-10, יש לאסוף בין חמישה ל-10 שדות ראייה אקראיים.
תאי אנדותל שאינם מעוררים אינם תומכים בגיוס נויטרופילים. לפיכך, הדמויות הבאות מציגות נויטרופילים המקיימים אינטראקציה עם תאי אנדותל שעוררו באמצעות TNF alpha. שימו לב לנויטרופיל הנצמד, כפי שמוצג על ידי חץ הצהוב, ולנויטרופיל העובר תהליך של נדירה (transmigration), כפי שמוצג על ידי החץ הלבן.
נדידה של נויטרופילים יכולה להתרחש בצומת התאים או דרך התאים האנדותליאליים עצמם. כדי להבדיל בין שני תנאים אלה, התאים האנדותליאליים סומנו באמצעות נוגדן anti VE coherent. כפי שניתן לראות כאן באדום, הנדידה מדורגת כמתרחשת באופן פארא-צלולרי (paracellular) או טראנס-צלולרי (transcellular).
במודל זה, כמעט כל התעבורה (transmigration) היא פארא-צלולרית (paracellular), כפי שמוצג באיור זה המציג את השכבה המאוחדת של שני האיורים הקודמים. בגרף הראשון מבין שלושה, נבחנו ונמדדו אינטראקציות של נויטרופילים באמצעות תוכנת image J. שימו לב כי התרחשו משמעותית יותר אינטראקציות בין נויטרופילים לתאי אנדותל שהופעלו על ידי TNF alpha מאשר עם תאי אנדותל של ביקורת שלא הופעלו.
התאים המקשרים הכוללים אופיינו בהמשך כתאים במצב גלגול (rolling), היצמדות חזקה (firmly adherent) או נדידה דרך הדופן (trans migrating), כפי שבוצע בעבר. נצפתה נדירה מוגברת באופן משמעותי של נויטרופילים בבארים שהכילו תאי אנדותל מופעלים לאחר בידוד תאי האנדותל. ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון western blotting, real time PCR ומדידת התנגדות אנדותליאלית, על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות לביולוגיה של תאי אנדותל לאחר הפיתוח.
שיטה זו תסייע לחוקרים בתחום הדלקות והביולוגיה של כלי הדם להבין כיצד מתרחש גיוס לוקוציטים בתנאי זרימה במודל אנושי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן בידוד תאי אנדותל מווריד טבילי אנושי ושימוש בהם לחקר הגירה של נויטרופילים בתנאי זרימה באמצעות תא ity.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה לבידוד תאי אנדותל אנושיים באיכות גבוהה מוורידי טבור ושימוש בהם לבחינת נדידה (transmigration) של נויטרופילים תחת תנאי זרימה. השיטה מאפשרת דימוי פלואורסצנטי של תאים חיים באוכלוסיות תאים נדירות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של כלי דם
רקע
- תאי אנדותל של וריד טביליות אנושי (HUVECs) הם חשובים לחקר תפקודי כלי דם.
- נדידה של נויטרופילים היא תהליך מפתח בתגובה החיסונית.
- הבנת תהליך זה יכולה לספק תובנות לגבי מחלות דלקתיות.
- טכניקות של דימיון תאים חיים משפרות את חקר האינטראקציות בין תאים.
מטרת המחקר
- בידוד תאי אנדותל אנושיים באיכות גבוהה.
- חקירת המנגנונים המסדירים את נדירת הנויטרופילים (transmigration).
- שימוש בטכניקות דימות מתקדמות לניתוח בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד וזריעה של תאי אנדותל מווריד טבורי אנושי.
- שימוש בתאי IBD לצורך פיצול תאים.
- פרפוזיה של נויטרופילים אנושיים שבודדו טרי על פני תאי אנדותל מופעלים.
- כימות של תהליך הטרנסמיגרציה באמצעות מיקרוסקופיית וידאו.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי אנדותל המתאימים לניסויים.
- צפייה בגלגול של נויטרופילים, היצמדות חזקה ומעבר דרך דופן כלי הדם (transmigration).
- שימוש יעיל במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובמיקרוסקופיה בשדה בהיר לצורך הערכה.
- תובנות לגבי הדינמיקה של אינטראקציות בין נויטרופילים לאנדותל.
מסקנות
- הפרוצדורה מאפשרת מחקר מפורט של התנהגות נויטרופילים בתנאי זרימה.
- הממצאים תורמים להבנת התגובה הדלקתית.
- טכניקות של דימיון תאים חיים הן בעלות ערך למחקר של אוכלוסיות תאים נדירות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
בידוד של תאי אנדותל ראשוניים מווריד טבורי אנושי (HUVECs) ושימוש בהם במבחני טרנסמיגרציה מבוססי זרימה מספקים פלטפורמה רלוונטית פיזיולוגית לבחינת אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל. מערכת זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של נתיבי גיוס דלקתיים ותומכת בביטחון חיזוי באישור יעדים בשלבים מוקדמים עבור פורטפוליו של מחקרים בכלי דם ובאימונולוגיה. גישה זו מגשרת בין ביולוגיה של גילוי לפיתוח מבחנים תרגומיים, ומספקת מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של אינטראקציות בין נויטרופילים לאנדותל תחת תנאי זרימה מבוקרים.
- תומך בהסרה מכנית של סיכונים במסלולי הדבקה ומעבר (transmigration) הרלוונטיים לדלקת.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות מולקולריות המעורבות בגיוס לוקוציטים.
- מספק מערכת רלוונטית לבני אדם לבחינת השערות ולהבהרת מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקימה פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכה כמותית של היצמדות תאים ומעבר דרך דפנות (transmigration).
- תומכת בסטנדרטיזציה של בדיקות מבוססות זרימה לסריקת תרכובות או נוגדנים.
- מאפשרת פלטי דימוי בעלי תוכן גבוה לקבלת תוצאות פנוטיפיות חסונות.
- מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה של סריקה בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים in vitro לביולוגיה וסקולרית ולמנגנונים דלקתיים הרלוונטיים למחלה.
- תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות נוגדות דלקת.
- מספקת תובנות על סממנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות הדמיה בזמן אמת של אירועי נדידה (transmigration).
- מאפשרת קבלת החלטות מותאמות סיכון להעמדת מולקולות מועמדות המכוונות לתנועת לוקוציטים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-היפותזה של מנגנוני גיוס לוקוציטים, ותמיכה בפיתוח בדיקות לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערת אפס של השפעת זרימה פיזיולוגית על הפעלה אנדותליאלית ומעבר נויטרופילים.
- סריקה: מספקת תוצרי כמות שניתנים לשחזור לצורך השוואת השפעות של תרכובות על היצמדות ותנועה של תאים.
- אנליטיקה: מספקת דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) וניתוח סטטיסטי של אירועי מעבר לצורך פרשנות נתונים אמינה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים in vitro למודלים של דלקת כלי דם רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת בדיקה הניתנת לשימוש חוזר וניתן להתאמה לאוכלוסיות אחרות של לוקוציטים וליעדים וסקולריים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקלביליות של בדיקות מבוססות זרימה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את היעילות ההונית על ידי הפחתת סיכונים בביולוגיה בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות אנטי-דלקתיות וכליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאים ראשוניים ובהקמת בדיקות מבוססות זרימה.
- נדרשת גישה למערכות דימוי מתקדמות ולתאי זרימה בעלי תאימות אופטית.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הפעלת תאים ודימוי.
- ניתן להתאים לסוגי לוקוציטים אחרים באמצעות שינויים בפרוטוקול, כפי שנתמך במקור.
- המגבלות כוללות שונות טכנית בבידוד תאים ראשוניים ובהקמת מערכת הזרימה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Isolation and Maintenance of Human Vascular Endothelial Cells
4:54
Neutrophil Recruitment and Transmigration
6:36
Results: Fluorescent and Cell Migration Analysis of Neutrophil Transmigration Across Endothelial Cells in an Ibidi Chamber
8:03
Conclusion
![פיתוח ואפיון של במבחנה כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca 2 +] i וייצור Nitric Oxide](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
