בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אנדותל אנושיים באיכות גבוהה ולהשתמש בהם כדי לבחון את המנגנונים המווסתים את הנדידה הטרנסג'נדרית של נויטרופילים, תנאי תת-זרימה. זה מושג על ידי בידוד וציפוי תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי. השלב השני הוא פיצול התאים לתאי IBD.

לאחר מכן, נויטרופילים אנושיים מבודדים טריים נמצאים בשפע על פני תאי אנדותל פעילים, וכתוצאה מכך הידבקות וגלגול נויטרופילים. השלב האחרון הוא לכמת הגירה באמצעות מיקרוסקופ וידאו. בסופו של דבר ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובהיר כדי להעריך את גלגול הנויטרופילים על פני תאי אנדותל פעילים.

קל לתאר בידוד תאי אנדותל, אך קשה ללמוד אותו בחלקו מכיוון ששלבים מרכזיים דורשים הדמיה של חבל הטבור. מסיבה זו, הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שיטה זו תעזור לנו להבין שאלות מפתח בתחום הדלקת, כגון כיצד גיוס לויקוציטים מתרחש בתנאי זרימה, וכיצד תאי אנדותל מתנהגים בתנאי זרימה יהיה טוב יותר. הבנתי.

אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי גיוס נויטרופילים במהלך דלקת. ניתן ליישם אותו גם על אוכלוסייה נדירה של לויקוציטים כגון תאי הרג טבעיים ואאוזינופילים. מי שמדגים את ההליך הזה יחד עם ריטו שארמה הוא הונג ג'אנג, טכנאי במעבדה שלי לפחות שעה לפני ההליך, ולאחר מכן מדגר בקבוק T 75 עם ג'לטין ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן התחל את הליך בידוד תאי האנדותל במכסה הזרימה הלמינרי באמצעות מספריים כדי לחתוך חבל טבור מהשליה. לאחר החלפתו לכפפות סטריליות, בדקו היטב את חבל הטבור והשליכו את כל החלקים המכילים קרישי דם או פגומים כתוצאה מהידוק חבל הטבור במהלך הלידה. לאחר מכן זהה את שני העורקים ואת הווריד היחיד הקיים בכבל.

לאחר מכן, הכנס בעדינות צינורית עם זין עצירה דו-כיווני המחובר אליה לקצה אחד של הווריד, ולאחר מכן הנח מהדק סביב הצינורית כדי להחזיק אותה היטב במקומה. אחד החלקים המסובכים ביותר בהליך הוא החדרת חבל הטבור. כדי להבטיח שזה נעשה בהצלחה, החדירו את הכבל עם מאגר עודף וצפו בזרימה עד שהוא מתבהר.

חדרו את הווריד עם מאגר חוט עד שהזרימה דרכו ברורה ולאחר מכן הדקו את קצה הכבל. מדי פעם במהלך הזלוף מתגלה חור קטן מכיוון שהרופאים הוציאו דם טבורי מחבל הטבור. במצבים אלה, ניתן להשתמש בהמוסטטים כדי לחסום את החור והזלוף יכול להימשך תוך בידוד תאי אנדותל.

חשוב מאוד לתזמן במדויק את הטיפול בקולגנאז. מעט מדי זמן ולא מספיק תאי אנדותל ייקצרו זמן רב מדי ועלולים להתרחש זיהום תאי שריר חלק או נזק לתאי האנדותל. לאחר מכן מחדירים את הווריד בקולגנאז חם טרי שהוכן מראש.

סגור את זין העצירה ודגר את הכבל בכוס המכילה מאגר כבל חם. לאחר 10 דקות, הסר ולאחר מכן עסה בעדינות את חבל הטבור כדי לשחרר את תאי האנדותל מלומן הווריד. רוקנו את התמיסה לתוך צינור המכיל חמישה מיליליטר של מדיה תאי אנדותל או ECM, שטפו את הכבל עם מאגר חבל הטבור פעמיים כדי להסיר את התאים שנותרו.

כעת סובבו את התאים למשך 10 דקות בשלוש פעמים 50 G.At טמפרטורת החדר, הסירו את הסופרנטנט ואז השעו מחדש את הגלולה. ב-10 מיליליטר של מדיה של תאי אנדותל, העבירו את התאים לבקבוק T 75 המצופה בג'לטין ולתרבית, תאי האנדותל למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. למחרת, נער בעדינות את הבקבוק כדי לעקור כדוריות דם אדומות.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט ושטוף את תרבית תאי האנדותל עם HBSS חם. לאחר הסרת ה- HBSS הזינו את התאים ב -10 מיליליטר של ECM חם. לאחר מכן בחנו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שתאי הדם האדומים הוסרו ולהעריך את מידת המפגש והמורפולוגיה של תאי האנדותל.

המשיכו להחליף את המדיה כל שלושה ימים עד שהתאים מגיעים לשטף שוטף. בשלב זה, פצלו את התאים באמצעות תמיסת טריפסין ו-EDTA. לאחר מכן קצרו את התאים המנותקים והשעו אותם מחדש ב-ECM.

לבסוף, מצפים כל באר של תא IBD בג'לטין. הסר את עודפי הג'לטין ולאחר מכן הוסף 1.5 כפול 10 לשש למיליליטר של תרחיף תאי האנדותל לכל באר בתא. התחל בהשראת ויסות יתר של ביטוי פני התא של מולקולת הידבקות והפעלה על ידי דגירה של תאי האנדותל עם ממריץ מתאים בזמן שתאי האנדותל מופעלים.

בודד נויטרופילים מהדם ההיקפי של מתנדבים אנושיים בריאים על ידי צנטריפוגה בצפיפות כפי שפורסם בעבר, ולאחר מכן השהה את התאים בריכוז של 1 כפול 10 עד 6 למיליליטר ב-HBSS בתוספת אלבומין אנושי. לאחר הגדרת המיקרוסקופ, חבר את תא IBD המכיל את תאי האנדותל המגורים לצינור המיקרוסקופ. בחר את יעד הניגודיות של 10 x פאזה, ולאחר מכן הגדר את משאבת המזרק לסגת ולהתחיל בזרימת HBSS במתח הגזירה הרצוי.

עצור לזמן קצר את הזרימה על ידי סיבוב זין העצירה התלת-כיווני בצד היציאה למצב כבוי והחלפת קו הכניסה מ-HBSS לנויטרופילים מבודדים. התחל את הזרימה שוב על ידי סיבוב זין העצירה בחזרה למצב מופעל. לאחר מכן התחל להקליט באמצעות מצלמת CCD המחוברת למקליט DVD.

הפעל את הטיימר. כאשר נויטרופילים נכנסים לתא לאחר ארבע דקות, חזרו ל-HBSS כדי למנוע היצמדות של נויטרופילים חדשים. אם רוצים נתונים עבור אינטראקציות כוללות גלגול והדבקה יציבה, השתמש בניגוד פאזה של פי 10.

המטרה היא לדמות שישה שדות אקראיים למשך 10 שניות כל אחד בין הדקה הרביעית לחמש. לבסוף עבור למטרה של פי 40 ורשום שדה ראייה יחיד בזמן העניין. לאחר זלוף הנויטרופילים לאחר 10 דקות, אסוף בין חמישה ל -10 שדות ראייה אקראיים.

תאי אנדותל לא מגורים אינם תומכים בגיוס נויטרופילים. לכן, האיורים הבאים מראים נויטרופילים מקיימים אינטראקציה עם תאי אנדותל מגורים TNF אלפא. שימו לב לנויטרופיל הדבק כפי שמצוין על ידי ראש החץ הצהוב ולנויטרופיל הנודד הטרנס כפי שמסומן על ידי ראש החץ הלבן.

גלגול נויטרופילים יכול להתרחש בצמתים של תאים או דרך תאי האנדותל עצמם. כדי להבדיל בין שני המצבים הללו, תאי אנדותל סומנו בנוגדנים קוהרנטיים נגד VE. כפי שניתן לראות כאן בגלגול אדום מדורג כמתרחש פרה-תאי או טרנס-תאי.

במודל זה, כמעט כל הגלגול הוא פרה-תאי כפי שמודגם באיור זה המציג את שכבת העל של שני האיורים הקודמים. בגרף הראשון מבין שלושת הגרפים נבדקו ונמדדו אינטראקציות נויטרופילים באמצעות תוכנת imageJ. שימו לב שהרבה יותר אינטראקציות של תאי אנדותל נויטרופילים התרחשו בין נויטרופילים לתאי אנדותל המופעלים על ידי TNF אלפא מאשר עם תאי אנדותל לא מגורים בביקורת.

סך כל התאים המקיימים אינטראקציה אופיינו עוד יותר כמתגלגלים או נצמדים היטב או נודדים כמו קודם. באופן משמעותי יותר התרחשה גלגול נויטרופילים בבארות המכילות תאי אנדותל פעילים לאחר בידוד תאי האנדותל. ניתן לבצע את השיטות האחרות כמו Western Blotting PCR בזמן אמת ועמידות אנדותל על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות לביולוגיה של תאי אנדותל לאחר הפיתוח.

שיטה זו תסייע לחוקרים בתחום הדלקת וביולוגיה של כלי הדם להבין כיצד גיוס לויקוציטים מתרחש בתנאי זרימה במערכת מודל אנושי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי ולהשתמש בהם כדי לחקור גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה באמצעות תא איטי.