בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה
8 באוגוסט 2012
מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי אנדותל אנושיים באיכות גבוהה ולהשתמש בהם כדי לבחון את המנגנונים המווסתים נדידה של נטרופילים (transmigration) בתנאי זרימה נמוכה (underflow). דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד וזריעה של תאי אנדותל מווריד הטבור האנושי. השלב השני הוא פיצול התאים לתאי IBD.
בשלב הבא, נויטרופילים אנושיים שבודדו זה עתה מפוזרים מעל תאים אנדותליאליים מופעלים, מה שמוביל לגלילה של הנויטרופילים, להיצמדות חזקה ולמעבר (טרנסמיגרציה). השלב הסופי הוא כימות המעבר באמצעות מיקרוסקופיה של וידאו. לבסוף, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובמיקרוסקופיה בשדה בהיר כדי להעריך את מעבר הנויטרופילים דרך תאים אנדותליאליים מופעלים.
בידוד תאי אנדותל הוא תהליך שקל לתאר, אך קשה ללמוד, בין היתר משום ששלבים מרכזיים דורשים ויזואליזציה של חבל הטבור. מסיבה זו, הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שיטה זו תסייע לנו להבין שאלות מפתח בתחום הדלקת, כגון כיצד מתבצע גיוס לוקוציטים בתנאי זרימה, ותאפשר הבנה טובה יותר של התנהגות תאי אנדותל בתנאי זרימה.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גיוס נויטרופילים במהלך דלקת, ניתן להחילה אותה גם על אוכלוסיות נדירות של לוקוציטים, כגון תאי NK (natural killer cells) ואאוזינופילים. את הפרוצדורה מדגימה יחד עם Ritu Sharma השם Hong Jang, טכנאית במעבדתי. לפחות שעה לפני הפרוצדורה, יש לחמם ובסביבתו של תרמוסטט בקבקון T 75 עם ג'לטין בטמפרטורה של 37 °C.
לאחר מכן, התחילו את הליך בידוד התאים האנדותליאליים תחת מ 빠르게 flow laminar, באמצעות מספריים לחיתוך חבל טבילה משילשייה. לאחר החלפה לכפפות סטריליות, בחנו מקרוב את חבל הטבילה והשליכו כל חלק המכיל קרישי דם או פגוע כתוצאה מהידוק החבל במהלך הלידה. לאחר מכן, זהו את שני העורקים ואת הווריד היחיד הנמצאים בחבל.
בשלב הבא, הכניסו בעדינות קנולה עם ברז מעצור דו-כיווני המחובר אליה לאחד מקצות הווריד, ולאחר מכן מקמו תסמיך (clamp) סביב הקנולה כדי להחזיקה במיקום יציב. אחד החלקים המורכבים ביותר בפרוצדורה הוא הפרפוזיה של חבל הטבור. כדי להבטיח שהדבר יבוצע בהצלחה, בצעו פרפוזיה לחבל הטבור עם עודף של תמיסת בופר ועקבו אחר הזרימה עד שזו תהיה שקופה.
בצעו פרפוזיה לווריד באמצעות בופר חבל טבילה עד שהזרימה תהיה צלולה, ולאחר מכן סגרו את קצה החבל בעזרת תסביך. לעיתים במהלך הפרפוזיה נחשף חור קטן שנוצר עקב הוצאת דם מחבל הטבילה על ידי רופאים. במצבים אלו, ניתן להשתמש בתסביכי דם (hemostats) כדי לחסום את החור ולהמשיך בפרפוזיה תוך כדי בידוד תאי אנדותל.
חשוב מאוד לתזמן במדויק את הטיפול בקולגנאז. זמן קצר מדי לא יאפשר קצירה של מספיק תאי אנדותל, וזמן ארוך מדי עלול להוביל לזיהום בתאי שריר חלק או לנזק לתאי האנדותל. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לווריד באמצעות קולגנאז חם שהוכן טרי.
סגרו את ברז העצירה והדרימו את השכר בתוך כלי כימי המכיל בופר שכר (cord buffer) חם. לאחר 10 דקות, הוציאו את השכר ועסו אותו בעדינות כדי לשחרר את התאי האנדותל מהלומן של הווריד. נקזו את התמיסה לתוך מבחנה המכילה חמישה מיליליטר של מדיום תאי אנדותל או ECM, תוך שטיפת השכר פעמיים בבופר שכר כדי להסיר תאים שנותרו.
כעת סבבו את התאים למשך 10 דקות ב-three 50 times G. בטמפרטורת החדר, הסירו את העליליות ולאחר מכן השעיקו מחדש את המשקע. ב-10 milliliters של מצע גידול לתאי אנדותל, העבירו את התאים לבקבוק T 75 מצופה ג'לטין וגדלו את תאי האנדותל למשך הלילה ב-37 degrees Celsius ו-5%CO2. למחרת, נערה בעדינות את הבקבוק כדי להסיר תאי דם אדומים שנדבקו.
לאחר מכן, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את תרבית תאי האנדותל באמצעות HBSS חם. לאחר הסרת ה-HBSS, העבירו לתאים 10 milliliters של ECM חם. לאחר מכן, בחנו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שתאי הדם האדומים הוסרו, וכדי להעריך את דרגת ההתמזגות (confluence) ואת המורפולוגיה של תאי האנדותל.
המשיכו להחליף את המצע בכל שלושה ימים עד שהתאים יגיעו למצב של התמזגות מלאה (confluency). בנקודה זו, פצלו את התאים באמצעות תמיסת trypsin ו-EDTA. לאחר מכן, אספו את התאים שהסתרו וסספנדו אותם מחדש ב-ECM.
לבסוף, השכיר ג'לטין בכל באר של תא IBD. הסר את עודפי הג'לטין ולאחר מכן הוסף לכל באר בתא 1.5 × 10⁶ תאים למילליטר מת сусפנסיית התאים האנדותליאליים. התחל בהשראה של ויסות-יתר (upregulation) של ביטוי מולקולות הדבקה והפעלה על פני השטח של התא, על ידי דגירה של התאים האנדותליאליים עם מע극ר מתאים בזמן שהתאים האנדותליאליים מופעלים.
בודד נויטרופילים מהדם ההיקפי של מתנדבים אנושיים בריאים באמצעות סנטריפוגציה לפי צפיפות כפי שפורסם בעבר, ולאחר מכן השהה את התאים בריכוז של 1 × 10⁶ למילליטר ב-HBSS בתוספת אלבומין אנושי. לאחר הגדרת המיקרוסקופ, חבר את תא ה-IBD המכיל את התאים האנדותליאליים המגורה לצנרת המיקרוסקופ. בחר בעדשה אובייקטיבית של 10x בניגוד פאזה (phase contrast), ולאחר מכן הגדר את משאבת המזרק לשאיבה והתחל את זרימת ה-HBSS במאמץ גזירה הרצוי.
עצרו את הזרימה לזמן קצר על ידי סיבוב ברז המעבר התלת-כיווני בצד היציאה למצב כבוי (off) והחלפת קו הכניסה מ-HBSS לנייטרופילים מבודדים. התניעו שוב את הזרימה על ידי סיבוב ברז המעבר חזרה למצב פתוח (on). לאחר מכן, התחילו בהקלטה באמצעות מצלמת CCD המחוברת למקליט DVD.
הפעילו את הטיימר. כאשר הנויטרופילים נכנסים לתא לאחר ארבע דקות, חזרו לשימוש ב-HBSS כדי למנוע היצמדות של נויטרופילים חדשים. אם נדרשים נתונים עבור סך האינטראקציות של גלגול (rolling) והיצמדות חזקה (firm adhesion), השתמשו בעדשה של 10x בניגודיות פאזה (phase contrast).
השתמש בעדשה אובייקטיבית כדי לצלם שישה שדות ראייה אקראיים למשך 10 שניות כל אחד בין הדקה הרביעית לחמישית. לבסוף, עבור לעדשה אובייקטיבית של 40x והקלט שדה ראייה בודד בנקודת הזמן הרלוונטית. לאחר הזרמת הנויטרופילים בדקה ה-10, אסוף בין חמישה ל-10 שדות ראייה אקראיים.
תאים אנדותליאליים שאינם מעוררים אינם תומכים בגיוס נויטרופילים. לכן, הדמויות הבאות מראות נויטרופילים המקיימים אינטראקציה עם תאים אנדותליאליים שעוררו באמצעות TNF alpha. שימו לב לנויטרופיל הדבוק, כפי שמוצג על ידי חץ הצהוב, ולנויטרופיל העובר טרנסמיגראציה, כפי שמסומן על ידי חץ לבן.
נדידה של נויטרופילים יכולה להתרחש בצמתים בין-תאיים או דרך התאים האנדותלליים עצמם. כדי להבדיל בין שני תנאים אלו, תאי אנדותל סומנו באמצעות נוגדן anti VE coherent. כפי שניתן לראות כאן בצבע אדום, הנדידה מדורגת ככזו המתרחשת באופן פרא-צלולרי (paracellular) או באופן טראנס-צלולרי (trans cellularly).
במודל זה, כמעט כל התהליך של הטרנסמיגרציה הוא פארא-צלולרי (paracellular), כפי שמוצג באיור זה המראה את חפיפתם של שני האיורים הקודמים. בגרף הראשון מבין השלושה, נבחנו ונמדדו אינטראקציות של נויטרופילים באמצעות תוכנת Image J. שימו לב כי התרחשו משמעותית יותר אינטראקציות בין נויטרופילים לתאי אנדותל שהופעלו על ידי TNF alpha מאשר עם תאי אנדותל של ביקורת שלא הופעלו.
התאים המגיבים הכוללים אופיינו בהמשך כתאים במצב גלגול (rolling), היצמדות חזקה (firmly adherent) או נדידה חוצה-אנדותל (transmigrating) כפי שבוצע קודם לכן. נדידה משמעותית יותר של נויטרופילים התרחשה בבארים שהכילו תאי אנדותל מופעלים לאחר בידוד תאי האנדותל. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Western blotting, real-time PCR ומדידת התנגדות אנדותליאלית, כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לביולוגיה של תאי אנדותל לאחר הפיתוח.
שיטה זו תסייע לחוקרים בתחומי הדלקת והביולוגיה של כלי הדם להבין כיצד מתרחש גיוס לוקוציטים בתנאי זרימה במערכת מודל אנושית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן בידוד תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי ושימוש בהם למחקר של נדידת נויטרופילים בתנאי זרימה באמצעות תא ity.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה לבידוד תאי אנדותל אנושיים באיכות גבוהה מוורידי טבור ושימוש בהם לבחינת נדידה (transmigration) של נויטרופילים תחת תנאי זרימה. השיטה מאפשרת דימוי פלואורסצנטי של תאים חיים באוכלוסיות תאים נדירות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של כלי דם
רקע
- תאי אנדותל של וריד טביליות אנושי (HUVECs) הם חשובים לחקר תפקודי כלי דם.
- נדידה של נויטרופילים היא תהליך מפתח בתגובה החיסונית.
- הבנת תהליך זה יכולה לספק תובנות לגבי מחלות דלקתיות.
- טכניקות של דימיון תאים חיים משפרות את חקר האינטראקציות בין תאים.
מטרת המחקר
- בידוד תאי אנדותל אנושיים באיכות גבוהה.
- חקירת המנגנונים המסדירים את נדירת הנויטרופילים (transmigration).
- שימוש בטכניקות דימות מתקדמות לניתוח בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד וזריעה של תאי אנדותל מווריד טבורי אנושי.
- שימוש בתאי IBD לצורך פיצול תאים.
- פרפוזיה של נויטרופילים אנושיים שבודדו טרי על פני תאי אנדותל מופעלים.
- כימות של תהליך הטרנסמיגרציה באמצעות מיקרוסקופיית וידאו.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי אנדותל המתאימים לניסויים.
- צפייה בגלגול של נויטרופילים, היצמדות חזקה ומעבר דרך דופן כלי הדם (transmigration).
- שימוש יעיל במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובמיקרוסקופיה בשדה בהיר לצורך הערכה.
- תובנות לגבי הדינמיקה של אינטראקציות בין נויטרופילים לאנדותל.
מסקנות
- הפרוצדורה מאפשרת מחקר מפורט של התנהגות נויטרופילים בתנאי זרימה.
- הממצאים תורמים להבנת התגובה הדלקתית.
- טכניקות של דימיון תאים חיים הן בעלות ערך למחקר של אוכלוסיות תאים נדירות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
בידוד של תאי אנדותל ראשוניים מווריד טבורי אנושי (HUVECs) ושימוש בהם במבחני טרנסמיגרציה מבוססי זרימה מספקים פלטפורמה רלוונטית פיזיולוגית לבחינת אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל. מערכת זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של נתיבי גיוס דלקתיים ותומכת בביטחון חיזוי באישור יעדים בשלבים מוקדמים עבור פורטפוליו של מחקרים בכלי דם ובאימונולוגיה. גישה זו מגשרת בין ביולוגיה של גילוי לפיתוח מבחנים תרגומיים, ומספקת מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של אינטראקציות בין נויטרופילים לאנדותל תחת תנאי זרימה מבוקרים.
- תומך בהסרה מכנית של סיכונים במסלולי הדבקה ומעבר (transmigration) הרלוונטיים לדלקת.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות מולקולריות המעורבות בגיוס לוקוציטים.
- מספק מערכת רלוונטית לבני אדם לבחינת השערות ולהבהרת מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקימה פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכה כמותית של היצמדות תאים ומעבר דרך דפנות (transmigration).
- תומכת בסטנדרטיזציה של בדיקות מבוססות זרימה לסריקת תרכובות או נוגדנים.
- מאפשרת פלטי דימוי בעלי תוכן גבוה לקבלת תוצאות פנוטיפיות חסונות.
- מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה של סריקה בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים in vitro לביולוגיה וסקולרית ולמנגנונים דלקתיים הרלוונטיים למחלה.
- תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות נוגדות דלקת.
- מספקת תובנות על סממנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות הדמיה בזמן אמת של אירועי נדידה (transmigration).
- מאפשרת קבלת החלטות מותאמות סיכון להעמדת מולקולות מועמדות המכוונות לתנועת לוקוציטים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-היפותזה של מנגנוני גיוס לוקוציטים, ותמיכה בפיתוח בדיקות לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערת אפס של השפעת זרימה פיזיולוגית על הפעלה אנדותליאלית ומעבר נויטרופילים.
- סריקה: מספקת תוצרי כמות שניתנים לשחזור לצורך השוואת השפעות של תרכובות על היצמדות ותנועה של תאים.
- אנליטיקה: מספקת דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) וניתוח סטטיסטי של אירועי מעבר לצורך פרשנות נתונים אמינה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים in vitro למודלים של דלקת כלי דם רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת בדיקה הניתנת לשימוש חוזר וניתן להתאמה לאוכלוסיות אחרות של לוקוציטים וליעדים וסקולריים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקלביליות של בדיקות מבוססות זרימה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את היעילות ההונית על ידי הפחתת סיכונים בביולוגיה בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות אנטי-דלקתיות וכליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאים ראשוניים ובהקמת בדיקות מבוססות זרימה.
- נדרשת גישה למערכות דימוי מתקדמות ולתאי זרימה בעלי תאימות אופטית.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הפעלת תאים ודימוי.
- ניתן להתאים לסוגי לוקוציטים אחרים באמצעות שינויים בפרוטוקול, כפי שנתמך במקור.
- המגבלות כוללות שונות טכנית בבידוד תאים ראשוניים ובהקמת מערכת הזרימה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Isolation and Maintenance of Human Vascular Endothelial Cells
4:54
Neutrophil Recruitment and Transmigration
6:36
Results: Fluorescent and Cell Migration Analysis of Neutrophil Transmigration Across Endothelial Cells in an Ibidi Chamber
8:03
Conclusion
![פיתוח ואפיון של במבחנה כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca 2 +] i וייצור Nitric Oxide](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
