דגם האדם החצוצרה לחקירות

Chlamydia trachomatis הוא חיידק גרם-שלילי מחייב תוך-תאי. ידועים סרווارهای שונים של חלאמידיה הגורמים לזיהומים בעין או בדרכי השתן והמין. זיהומים בדרכי השתן והמין על ידי Chlamydia trachomatis הם המחלה המועברת מינית השכיחה ביותר בעולם.

הן נמצאות בשכיחות של כמעט 3 מיליון זיהומים מדווחים באיחוד האירופי בין השנים 1990 ל-2009. בשנת 2009 דווחו כמעט 400,000 מקרים. למרות שבריאות הציבור והחינוך המיני משתפרים ללא הרף, זוהתה עלייה בשיעור הזיהומים הגניטליים החדשים של חламиדיה, מ-70,000 מקרים בשנת 1990 ל-400,000 מקרים בשנת 2009.

75% מכל ההדבקות החדשות מדווחות בקרב צעירים בגילאי 15 עד 24 שנים. השליכות הקליניות אמורות להתרחש עקב פינוי לא יעיל של הפתוגנים, מה שעלול להוביל להדבקות עולות מהמסכת הגניטלית התחתונה לעליונה, ובעקבות זאת לגרום לנזק דלקתי כרוני לרקמה המודבקת. 10 עד 30% מהנשים המודבקות ב-chlamydia tracheitis מפתחות מחלה דלקתית של האגן (PID), ועד 50% ממקרי ה-PID מיוחסים להדבקות ב-chlamydia tracheitis.

כתוצאה מכך, ב-50% מהמטופלות עם אי-פריון חסימתי של החצוצרות וב-40% מהמטופלות עם הריון חוץ-רחמי, נמצא כי chlamydia היא הפתוגן הגורם למצב זה. באישה בריאה שאינה מזוהמת, הביצית המופרית נודדת דרך החצוצרה אל הרחם, שם היא מתפתחת עד ללידה. במטופלות מזוהמות, chlamydia עשויה לעלות מהדרכים הגניטליות התחתונות אל החצוצרה ולעורר תהליכי דלקת כרוניים.

נזק לתאי אפיתל הנגרם על ידי פתוגנים ואובדן תפקודים מרכזיים של תאי האפיתל אמורים לגרום בסופו של דבר לחסימה של החסון, מה שמוביל להפחתה או לביטול מוחלט של הובלת הביצים מהשחלות אל הרחם. למטרה זו, נאספים ונשמרים חסונות אנושיים מנשים העוברות היסטרקטומיה. החסונות מנותחים ונפתחים בזהירות.

בהתאם למערך הניסיוני, הם נחתכים לדגימות קטנות ומודבקים בגופי תאי ראשוניים (elementary bodies) זיהומיים של chlamydia tracheitis למשך 24 עד 48 שעות בנקודות זמן רלוונטיות. הדגימות מקובעות בקיבוע של Monty למשך שלושה ימים לפחות עד להכנה נוספת. יש לאסוף חצוצרות אנושיות (HFT) מנשים העוברות היסטרקטומיה מיד לאחר הניתוח.

במדיום RPMI המכיל 5% FCS ללא אנטיביוטיקה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד להכנה. יש לבצע דיסקציה של חשסון הביץ (Fallopian tube) אנושי בצלחת פטרי המכילה RPMI עם 5% FCS ללא אנטיביוטיקה לאורך כל תהליך העיבוד. יש להשקיע את החשסון במדיום כדי למנוע התייבשות, ולגזור ולהסיר רקמה חיבורית ורקמה שניזוקה במהלך הניתוח.

לאחר הניתוח, פתחו בזהירות את ה-HFT באמצעות סקלפל קטן. הימנעו מפגיעה ברקמה עקב טיפול לא זהיר עם פינצטה וסקלפל. הכינו פיסות רקמה קטנות בגודל של five by five millimeters לצורך הדבקה; שמרו את דגימת ה-HFT ב-1 mL של RPMI המכיל 5% FCS ללא אנטיביוטיקה והוסיפו C track.

דגימות HFT של גופי Elementary של OMAS מדגירות למשך עד 48 שעות ב-37 degrees Celsius, 5%CO2 ו-20%O2 בתוך אינקובטור רגיל או בסביבה דלה בחמצן, פחות מ-5%O2 בתא היפוקסיה. לאחר נקודות הזמן של הדגירה הרלוונטיות, הדגימות נאספות ונשמרות ב-Monty's Fixative למשך שלושה ימים לפחות ב-four degrees Celsius עד להכנה ל-SEM או TEM עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת. הרקמה המקובעת נחתכת לחתיכות קטנות, נשטפת ומודגרת עם 1%osse ו-tetroxide למשך לילה.

לאחר מספר שלבי שטיפה וייבוש, הדגימות המיובשות מועברות ל-aite שהוכן טרי ועוברות פולימריזציה למשך 48 שעות ב-60 °C. לאחר קיצוץ, נחתכים חתכים חצי-דקים וחתכים דקים מאוד המועברים לזכוכיות או לרשתות, בהתאמה. לאחר צביעה, ניתן לבחון את החתכים החצי-דקים באמצעות מיקרוסקופ אור לפני ביצוע מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת.

הוצא את הדגימה מהמקבע של Monty וחתוך אותה לחתיכות בגודל של עד 2x2x5 מילימטרים. לאחר שטיפה, אינקובציה בבופר דילציה של sodium CCO, שטיפה ב-osmium tetroxide, דהידרטציה ובריכוזים עולים של ethanol, העבר את הדגימה לתערובת של 50% propylene oxide ו-aite למשך הלילה. למחרת, העבר ל-aite שהוכן טרי למשך שעה אחת לפחות.

לאחר מכן, העבירו לתבניות שטוחות, מלאו בשרף והניחו לפולימריזציה למשך 48 שעות בטמפרטורה של 60 °C. לאחר קיצוץ של הדגימה הטמיעה, חתכו חתכים חצי-דקים בעובי של כ-700 nanometers או חתכים דקים מאוד בעובי של 70 nanometers באמצעות אולטרה-מיקרוטום המצויד בסכין זכוכית או רצוי בסכין יהלום. נתחו את הדגימה מהחתכים החצי-דקים והדקים מאוד באמצעות מיקרוסקופיה של אור ומיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת (TEM). עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM).

את הדגימות מקבעים באמצעות סיכות על לוחות שטיח, כאשר האפיתל פונה כלפי מעלה, שוטפים ומייבשים אותן באמצעות ריכוזים עולים של אצטון. לאחר ייבוש במייבש נקודת קריטית, מעבירים את הדגימות לתושבת דגימות עבור SEM ומצפים אותן בפלטינה, זהב או פלדיום באמצעות מכשיר sputter coder. לאחר מכן הן מוכנות לניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים סורק לצורך ביצוע מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת.

הוצא את הדגימה ממקבע של מונטי (Monty's fixative) והנח את פיסת הרקמה כך שהאפיתל פונה כלפי מעלה על גבי לוח שעם, וקבע אותה במקומה באמצעות סיכות לחרקים. לאחר שטיפה בבופר Sodium caco dilate וטיפול באצטון, ייבש את הדגימה במייבש נקודה קריטית (critical point dryer). לאחר העברת הדגימה מהשעם למעמד דגימות עבור SEM, הכן ציפוי מוליך של פלטינה, זהב או פלדיום על הדגימה באמצעות מכשיר sputter coater, והעבר את הדגימה המצופה למיקרוסקופ אלקטרונים סורק (scanning electron microscope) לצורך ניתוח נוסף.

השכיחות הגבוהה והבלתי משתנה של זיהומי הלומס בנשים וההשלכות הקליניות העמוקות של זיהומים עולים הן הרציונל להגברת המחקר הבסיסי והטרנסלציונלי בתחום זה. השתמשנו במודל רקמה exvivo של חצוצרה אנושית, שפותח בעבר על ידי הקבוצה של St.Perus, כדי לאפיין מורפולוגית נזק תאי המושרה על ידי chlamydia בחצוצרה. באמצעות שיטה זו, נצפתה היווצרות של הכללות תוך-תאיות בשלבי התפתחות שונים, המראות הן זיהומים משתכפלים והן זיהומים עמידים.

עם זאת, עדיין חסרות ראיות ניסיוניות לנוכחות של קלמידיה עמידה (persistent chlamydia) ברקמת חצוצרה אנושית, ונדרש ניתוח נוסף של קלמידיה, צאצאיה והעלייה בביטוי (upregulation) של גני עמידות. אחת המגבלות העיקריות של מודל זה היא היעדרה של תאי דלקת, דבר המקשה על ניתוח השפעות משניות הנובעות מהזיהום הגלאומטוזי הראשוני ב-KLA. למרות זאת, נראה כי מודל זה מתאים לניתוח תנאים סביבתיים, כגון תכולת חמצן, בהקשר של נזק לתאי אפיתל של החצוצרה, ולניתוח תגובת החיסון הראשונית של המאכסן כנגד זיהום גלאומטוזי חריף.

אחת המטרות העתידיות היא לבסס מודל מורכב יותר לבדיקת MIC של CTUs במודל של רקמת חצוצרה אנושית ב-pH רלוונטי, ולהשתמש במודל זה כדי להגדיר באופן מדויק את שלבי הפיתוח השונים של CLIs מבחינה מטבולית, תוך שימוש בטכניקת מיקרוסקופיית סריקה לייזר דו-פוטונית.