הקלטה אופטית של פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק

המטרה הכוללת של ניסוי FollowMe היא לתעד פעילות עצבית ממספר רב של נוירונים. זה מושג על ידי התבוננות בעלייה בריכוז הסידן התוך תאי בסומה של נוירון הקשורה לכל פוטנציאל פעולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב הראשון. עירור שני פוטונים ועקרון סריקה בגישה אקראית משמשים להקלטת אותות פלואורסצנטיים של סידן מסומאטו 40 נוירונים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

בשלב השני, תזמוני הספייק המדויקים מופקים מהאותות הפלואורסצנטיים באמצעות אלגוריתם דה-קונבולוציה. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לתעד פעילות זינוק מעשרות נוירונים. לאחר מכן ניתן להשתמש בנתוני הזינוק כדי למדוד מידע הדדי, התפשטות אותות בין אוכלוסיות עצביות או מתאמים עצביים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הקלטות מיקרו-אלקטרודות, הוא שניתן לתעד פעילות של זינוק נוירונים ממספר רב של נוירונים מאוכלוסייה מקומית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תפקוד קליפת המוח ברמת הרשתות המקומיות של נוירונים, כגון החשיבות של מתאמים לחיפוש מידע ושינויים בדינמיקת רשתות עם פלסטיות קורטיקו עבור עירור שני פוטונים, נעשה שימוש במערכת לייזר דופק אינפרא אדום עם פולסים פמטו-שניות. נדרש הספק פלט לייזר גבוה כדי לקזז את ההפסדים הגדולים שמכניסים הרכיבים האופטיים של המערכת.

מטיף לכל מערכת המורכבת משתי מנסרות מעניק פיזור מהירות קבוצתי שלילי על פולסי הלייזר לפני הסיטים האופטיים של הקוסטו כדי לפצות על הפיזור הזמני שהוצג על ידי ה-AODs שני AODs עם פתחים גדולים מסיטים את קרן הלייזר בשני ממדים. דירוג עקיפה רפלקטיבי עם 100 חריצים למילימטר ממוקם 13 סנטימטרים מאחורי ה-AODs כדי לפצות על הפיזור המרחבי שהוצגו על ידי ה-AODs. בעת שימוש בפולסי לייזר קצרים, קרן הלייזר מכוונת באמצעות שני טלסקופי ממסר ליציאת המצלמה של מיקרוסקופ זקוף.

קשתית ממוקמת במרווחי זמן קבועים ליישור הרכיבים האופטיים. מפצל אלומה דיכרואי מול המטרה מעביר את אור העירור האינפרא אדום לדגימה ומחזיר את אור הקרינה מהדגימה לגלאי. גלאי Epi וטרנס פלואורסצנטיים אוספים אות פלואורסצנטי דרך המטרה ומסנני הזכוכית בצבע המעבה ממוקמים מול הגלאים כדי למנוע מאור עירור להגיע לגלאים.

זוויות הסטייה של A OD נשלטות על ידי מחשב המצויד בלוח ממיר אנלוגי דיגיטלי, אשר בתורו מניע מתנדים מבוקרי מתח. האות ממכפילי הצילום מועבר דרך מסנן באטרוורת' במעבר נמוך עם תדר ניתוק של 100 קילו-הרץ ועובר דיגיטציה על ידי ממיר דיגיטלי אנלוגי בקצב שעון של 156.25 קילו-הרץ לפני שהוא מאוחסן במחשב לצורך ניתוח, יישור ורעש חשמלי נבדקים על ידי רישום התפלגות אותות פלורסנט עם ובלי אור לייזר ברווח נמוך וגבוה של מכפילי הצילום, כמו גם עם ובלי מחוון, סריקת גישה אקראית מסתמכת על זיהוי עליות תוך תאיות בסידן. השלב הראשון בפרוטוקול הוא לצבוע מספר רב של נוירונים בצורת אסתר של אינדיקטור סידן על ידי הזרקת בולוס.

לאחר מכן, רשמו את פעילות הסומה בכל תא עצב בארבעה מיקומים למשך 6.4 מיקרו-שניות בכל מיקום. כדי לבחור את הנוירונים המעניינים, רכשו מסגרת מלאה המורכבת מ-256 על 256 פיקסלים. לאחר מכן בחר ידנית את מרכזי הנוירונים שיוקלטו בתוך תמונה זו.

שלוש נקודות במרחק של שני מיקרון סביב כל מרכז מתווספות אוטומטית על ידי תוכנת הבקרה בכל מחזור. אות פלואורסצנטי נרשם מארבעת המיקומים בכל 40 תאי העצב. הקלטה מכל הנוירונים במחזור אחד דורשת 1.536 אלפיות השנייה.

חזור על הרישום הרציף הזה של כל 40 תאי העצב למשך חמש שניות. זיהוי ספייק מאותות סידן סומטיים פלואורסצנטיים מסתמך על יחס אות לרעש גבוה. ניתן להשיג יחס אות לרעש גבוה על ידי הגדלת עוצמת העירור.

עם זאת, ניתן להגדיל את עוצמת העירור רק לגבול מסוים בגלל נזק לצילום. יש רק חלון קטן מאוד של עוצמת עירור שבו נזק הצילום נמוך ויחס האות לרעש מספיק כדי לזהות קוצים בודדים על מנת להבטיח שהאותות המוקלטים נמצאים בחלון של זיהוי ספייק גבוה. במהלך הניסוי נעשה שימוש במספר תוכנות ניתוח מקוונות שפותחו על ידי המעבדה שלנו.

לאחר מכן, חשב את קצב הפוטונים המשוער לנוירון מחלון זמן קצר של רעש בסיסי של כ-100 עד 200 אלפיות השנייה. מספר הפוטונים וקצב הפוטונים מחושבים מערכי הקרינה על ידי התאמת התפלגות שינויי הקרינה היחסית במשוואה זו, ולאחר מכן מחשבים את הקרינה הבסיסית מאותו חלון זמן ומתווים אותה כפונקציה של זמן או ניסיונות. שמור על הירידה הממוצעת של קו הבסיס מתחת ל-0.0002 לשנייה על ידי התאמת עוצמת הלייזר.

מכיוון שזיהוי ספייק יורד במהירות כאשר חורגים ממגבלה זו. לאחר מכן, ודא את המיקומים הסומטיים של הנוירונים כל 10 עד 20 דקות על ידי רכישת תמונת מסגרת מלאה. התאם את מיקומי ההקלטה במידת הצורך.

האותות הפלואורסצנטיים הנובעים מפעילות עצבית אכלו לעתים קרובות בזמן בגלל הדעיכה הארוכה של הסידן החולף. בהליך זה, נעשה שימוש בשיטת דה-קונבולוציה כדי להגביר את התזמונים מהאותות הפלואורסצנטיים. כאן אנו משתמשים באלגוריתם גנטי כדי לקבוע את מודל רכבת הספייק הסביר ביותר המתאים לאות הפלואורסצנטי המוקלט.

עם כל איטרציה של האלגוריתם, הסבירות המקסימלית מתקרבת באופן אסימפטוטי למקסימום הניתן על ידי הרעש של הקלטות הקרינה. באוכלוסיות הומוגניות של נוירונים, אות הסידן שמעורר הספייק יכול להשתנות בין נוירונים. לניתוח לא מפוקח של מערכי נתונים גדולים, עיצבנו אלגוריתם שלוקח בחשבון את השונות של אות הסידן שעורר הספייק מתא עצב לנוירון כדי למנוע מספר רב של גילויים חיוביים כוזבים.

ההתפלגות המשותפת של המשרעת וקבוע זמן הדעיכה של חולף סידן מעורר ספייק יחיד נרשמים בקבוצה נפרדת של ניסויים מאותו סוג של נוירונים באותם תנאי ניסוי. כדי להסביר שינויים איטיים בבסיס וכדי להפחית את עלויות החישוב של דקון, הקלטות ארוכות יותר מחולקות למספר עקבות קצרים יותר של שנייה עד חמש שניות עבור כל נוירון בכל הקלטה, אלגוריתם הדה-קונבולוציה עשוי לבדוק מספר רב של מודלים עד מיליון מודלים שונים או יותר כדי להאיץ את הדה-קונבולוציה ניסוי אחד מפותל בעד 10 מחשבים שונים. במקביל.

לאחר דה-קונבולוציה, נתוני הספייק מנותחים ונבדקים. הסתברות ספייק ההיסטוגרמה של זמן הגירוי וקצב ירי הנוירונים מחושבים באופן אוטומטי. להלן הדוגמאות לאות פלואורסצנטי שהוקלט בקצב עירור נמוך מאוד והשני בקצב עירור גבוה מאוד בתוך חלון הזיהוי.

שימו לב שכל דוגמה מציגה את התגובה לעלייה אחת. מוצג כאן מיקרוגרף צילום של פרוסת מוח חריפה ושתי פיפטות גירוי המונחות באותו עמוד קליפת המוח. בשכבה הרביעית, אלה מראים תגובות עצביות לגירויים החוזרים על עצמם, והגרף הזה מציג את המידע ההדדי של שאנון המאותת על ידי אוכלוסיית הנוירונים המתועדת

להלן מדידת ההתפשטות של פעילות סף העל בין אוכלוסיות שונות של נוירונים בקליפת המוח. אלו הם הקוצים שזוהו בנוירונים בקליפת המוח, תגובה לגירוי חשמלי של סיבי קליפת המוח. בעת הקלטת פעילות עצבית באמצעות סריקת גישה אקראית, חשוב מאוד להקליט בחלון הזיהוי.

אחרת, קל מאוד למצוא את עצמך עם מערכי נתונים בלתי שמישים. זיהוי ספייק אופטי עדיין בחיתוליו. יש הרבה מקום לשיפור.

עם כמה שיפורים, אנו מקליטים אפילו יותר נוירונים. עם שיפורים אחרים, נוכל אפילו להקליט בבעלי חיים ערים ומתנהגים.