הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור נדידת נוירובלסטים בפרוסות חריפות של מוח ארבעת העכברים הבוגרים. זה מושג על ידי תיוג ראשוני של קודמני העצבים באזור התת-חדרי הבוגר חמישה עד שמונה ימים לאחר תיוג נוירובלסטים, הכינו פרוסות חדות של העכבר למוח. לאחר מכן, מבוצעת הדמיית זמן-lapse של נדידת נוירובלסטים.

בסופו של דבר נעשה שימוש במיקרוסקופיה בזמן אמת של שדה רחב כדי להראות את הדינמיקה של נדידת נוירובלסטים בפרוסות חדות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום ההתפתחות העצבית על ידי חקר תפקידם של רמזים מולקולריים שונים ומנגנון תאי הכרוך בנדידת התאים. כעת שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תהליכים פיזיולוגיים המווסתים את ההגירה העצבית אצל מבוגר למוח, אך ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון חקר הגירה עצבית במוח איסכמי ובמהלך התפתחות עוברית.

התחל בהליך זה על ידי הכנת נוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי על בסיס סוכרוז לחיתוך הפרוסות ו-CSF מבוסס נתרן כלורי 32 מעלות צלזיוס לשמירה על הפרוסות עד להדמיה ואז חמצן את התמיסות על ידי בעבוע רציף עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הרדימו את העכבר עם הנוירובלסט המסומן פלואורסצנטי באמצעות קטמין קסילזין באופן פנימי. לאחר מכן הכינו במהירות את תמיסת החיתוך הקר כקרח במראה דמוי ג'לי באמצעות חנקן נוזלי.

לאחר מכן, קח 15 עד 20 מיליליטר של תמיסת חיתוך קר קרח עם מזרק 20 סמ"ק והחדיר את העכבר בתוך קארדי. אם יש צורך לסמן את כלי הדם במקום לחלחל עם תמיסת החיתוך, הזריק 200 מיקרוליטר של דקסטרן טקסס אדום בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר, העביר את קארדי לחדר השמאלי של הלב, והמתן שתיים עד שלוש דקות לפני עריפת ראשו של העכבר לאחר זלוף טרנס-קרדיאל, ערוף את ראשו של העכבר במהירות, טבל את הראש בתמיסת החיתוך הקרה כקרח והעביר אותו לוויברטו. חותכים את הגולגולת במספריים לאורך התפר הסגיטלי מהמוח הקטן לנורת הריח.

לאחר מכן, הסר בעדינות את דשי הגולגולת באמצעות זוג מלקחיים לאחר מכן, כרת את החלק המטופף של המוח באמצעות אזמל. לאחר מכן בצע שני חתכים סגיטליים בחלק הצדדי ביותר של כל המיספרה, וחתוך את המוח לאורך הסדק התוך-חצי כדורי. לאחר מכן הסר בעדינות את המוח באמצעות מרית והניח אותו בקרח תמיסת חיתוך קר

הנח את שתי ההמיספרות בנפרד על גוש אגר של 4% כשהצד הגבי נוגע באגר. לאחר מכן, הדביקו את הבלוק עם הצד החתוך לרוחב של שתי ההמיספרות לפלטפורמה של ויבראם כשהצד המדיאלי פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הנח את הפלטפורמה בתא הוויברם.

מלאו אותו בתמיסת החיתוך. לאחר מכן שמור את התמיסה מחומצנת לאורך כל הכנת הפרוסה על ידי בעבוע עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני. כעת הכינו את החלקים בעובי 250 מיקרון בעזרת הויברטור.

יש להשתמש במהירות חיתוך נמוכה וברטט להב בתדירות גבוהה כדי להשיג חלקים באיכות גבוהה. ברגע שפרוסה משתחררת מהלהב, הסר אותה בעדינות מתמיסת החיתוך והנח אותה בתא דגירה מלא ב-CSF מחומצן הנשמר ב-32 מעלות צלזיוס באמבט מים. בהליך זה, הניחו בזהירות את הפרוסה בתא ההדמיה של המיקרוסקופ כדי למנוע סחיפה של הפרוסה במהלך ההדמיה.

ייצב אותו על ידי הנחת רשת ניילון בזהירות מעל. ודא שהפרוסה מוחדרת באופן רציף ל- CSF. לאחר מכן, השתמש במטרה של פי 10 כדי למצוא תחום עניין.

פתח את תוכנת המטמורף וודא שרשת הניילון אינה חוסמת את שדה ההדמיה. לאחר מכן הפעל את המטרה של 40x והתאם את המיקוד. ודא שיש מספיק פתרון בין המטרה לפרוסה.

באמצעות תוכנת המטמורף הגדר את פרמטרי רכישת הזמן-lapse, כגון משך העירור, מספר מישורי Z, המרחק בין כל קטע Z, מרווח הזמן ומשך ההקלטה. לאחר מכן התחל את רכישת ה-time lapse. הנתונים נשמרים אוטומטית על ידי Metamorph כקובץ tiff כאשר כל קובץ מתאים לנקודת זמן אחת של סרטון ה-time lapse שנרכש כדי לפתוח את הסרט ב-Mrs.Load

את התמונות שנרכשו על ידי גרירה ושחרור של תמונת נקודת הזמן הראשונה של הסרטון בסמל התוכנית. לאחר טעינת הסרט, כוונן את הבהירות והניגודיות של האות בחלון כוונון התצוגה. הגדר את הפרמטרים של הסרטון הנרכש, כגון גודל הווקסל ומרווח הזמן במאפייני התמונה, והגדר חלונות נקודות זמן במרחקים שווים.

לאחר ציון גודל הווקסל, ניתן לראות את המסגרת בתלת מימד כמו גם את הזמן וקנה המידה של הסרטון כדי לעקוב אוטומטית אחר התאים המוקלטים. צור נקודה לכל תא בשדה בחלון המעבר על ידי בחירת פונקציית הנקודות, מדוד את קוטר התא שיש לעקוב אחריו בחלון הפרוסה. הגדר את הפרמטרים למעקב והמשיך.

בדוק את מהימנות האובייקטים שזוהו לאורך זמן. אם כל התאים הנודדים אינם מזוהים באופן אוטומטי, שנה את סף הזיהוי וודא שכל התאים נבחרו עם כתמים בכל נקודות הזמן. יש לציין את המרחק המקסימלי וגודל הפער המרבי בין שתי נקודות המייצגות נקודות זמן שכנות של אותו מסלול, כדי שהתוכנה תוכל לחבר את נקודות הזמן.

לאחר ביצוע הרצועות, ניתן לסנן אותן ולהסיר את הרצועות הלא רלוונטיות פשוט על ידי מחיקתן. ניתן לתקן מסלולים על ידי חיבור וניתוק מסלולים שונים ונקודות זמן שונות של אותה מסילה ברגע שכל התיקונים בוצעו. הסתכל אחרון על הרצועות וייצא את הנתונים, כולל תזוזה של תא לנקודת זמן, אורך מעקב, אורך תזוזה ומשך מסלול לקובץ Excel.

סרטון זה מציג את הדמיית ה-time lapse של נדידת הנוירובלסטים הירוקים לאורך כלי הדם המסומנים באדום של דקסטרן, טקסס. שימו לב שהנוירובלסט הנודד מראה התנהגות מלוחה כאשר שלבי הנדידה נקטעים בתקופות נייחות. והסרטון הזה מראה את המעקב אחר נדידת נוירובלסטים על ידי תוכנת imas.

הכדורים והקווים מציינים את גופי התאים ומסלולי הנדידה של תאים בודדים בהתאמה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיש להשיג פרוסות חיים אקוטיות באיכות טובה של המוח הקדמי של עכבר בוגר. בנוסף, יש לייצב היטב את הפרוסות בתא ההדמיה על ידי הנחת רשת ניילון בזהירות כדי למנוע סחיפה של הפרוסה במהלך ההדמיה.

כל שינוי בקצב הזלוף של A CSF, זלוף לא סדיר או שינוי דרסטי בטמפרטורה עלולים לגרום להיסחפות ולשינויים במישור המוקד במהלך ההדמיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להקליט ולנתח נדידת נוירובלסטים בפרוסות הבוגרות החריפה. אנו ממליצים להשתמש במרווח רופא קצר בסדר גודל של 15 עד 30 שניות כדי לזהות באופן מהימן את ההתחלה והסוף של שלבי הנדידה והנייחים.