Name: הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: למד הדמיית זמן של הגירת נוירובלסטים בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמיקת ההגירה והמנגנונים התאיים המעורבים בפיתוח עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכון קנדי ​​לבריאות מחקר (CIHR) המענק לASJK מומן בהחלק על ידי מלגת אוול אוניברסיטה. AS הוא הנמען של קנדה מחקר קתדרת neurogenesis לאחר הלידה.

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Kaneko, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
<li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+neuronal+migration+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li>
<li>Snapyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
<li>Lledo, P. M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+new+neurons+into+the+adult+olfactory+bulb%3A+joining+the+network%2C+life-death+decisions%2C+and+the+effects+of+sensory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience.</a> Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).</li>
<li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+release+and+uptake+regulate+neuronal+precursor+migration+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li>
<li>Martini, F. J., Valdeolmillos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+contraction+at+the+cell+rear+drives+nuclear+translocation+in+migrating+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).</li>
<li>Murase, S., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Bovetti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+scaffold+for+neuroblast+migration+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

המיקוד הנכון של מבשרי נוירונים לאזורי המוח המתאימים הוא תהליך יסוד של ההרכבה והתפקוד התקין של מעגלים עצביים. הרוב המכריע של תאים נודדים במהלך התפתחות עוברית ובמוח לאחר הלידה רק בכמה אזורים, כגון gyrus OB, המשונן ומוח הקטן, התזוזה עצבית עדיין מתרחשת. המנגנונים מנצחים נדידת תאים במוח לאחר הלידה יישארו, לעומת זאת, הבינו היטב. ידע של המנגנונים מולקולריים המעורבים ובשבילים המנחים נדידת תאים ברקמות עצבים בוגרות יהיה לשפר את ההבנה של מיקוד עצבי במוח לאחר הלידה ועשוי להיות רלוונטי קלינית ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> סיגמא </td><td> S9378 </td></tr><tr><td> גלוקוז (ACSF) </td><td> EMD </td><td> DX0145-3 </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> סיגמא </td><td> S9625 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> סיגמא </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> MgCI 2 x6H 2 O </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Nah 2 PO 4 xh 2 O </td><td> EMD </td><td> SX0710-1 </td></tr><tr><td> CaCI 2 x2H 2 O </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C3881 </td></tr><tr><td> Dextran TexasRed </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Dextran CascadeBlue </td><td> Invitrogen </td><td> D1976 </td></tr><tr><td> גלוקוז (פתרון 40X) </td><td> סיגמא </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> pyruvat נתרן </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> D-5025 </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> בינוני Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> EMD </td><td> 2930 </td></tr><tr><td> עט / דלקת </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> קטמין / Xylazine </td><td> CDMV </td><td> 5230 </td></tr><tr><td> פסטר פיפטה </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td></tr><tr><td> צינור 15 מ&quot;ל חרוטים </td><tד&gt; Sarstedt </td><td> 62.553.205 </td></tr><tr><td> צינור 50 מ&quot;ל חרוטים </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.205 </td></tr><tr><td> זכוכית נימים (הזרקת stereotaxic) </td><td> WPI </td><td> 4878 </td></tr><tr><td> שמן פרפין </td><td> EMD </td><td> PX0045-3 </td></tr><tr><td> Proviodine </td><td> Rougier </td><td> 65655-1370 </td></tr><tr><td> תפר </td><td> Stoelting </td><td> 50487 </td></tr><tr><td> Anafen </td><td> CDMV </td><td> 11508 </td></tr><tr><td> מזרק 20 סמ&quot;ק </td><td> VWR </td><td> SS-20L2 </td></tr><tr><td> צלחת פטרי </td><td> VWR </td><td> 25384-094 </td></tr><tr><td> אגר </td><td> Laboratoire Mat </td><td> AP-0108 </td></tr><tr><td> דבק </td><td> Permabond </td><td> 910 </td></tr><tr><td> 95% O 2/5% CO 2 </td><td> לינדה </td><td> 24068835 </td></tr><tr><td> להב &lt;/ Td&gt; <td> WPI </td><td> 501901 </td></tr><tr><td> רשת ניילון </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0198 </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> אפנדורף </td><td> 5702 000.019 </td></tr><tr><td> פיפטה חולץ </td><td> מכשיר סאטר </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Nanoliter מזרק </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td></tr><tr><td> מנגנון ההזרקה Stereotaxic </td><td> WPI </td><td> 502900 </td></tr><tr><td> מערכת מייקרו תרגיל </td><td> WPI </td><td> 501819 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Thermo Scientific </td><td> 920110 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב </td><td> אולימפוס </td><td> BX61WIF </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> Photometrics </td><td> CS-HQ2-D </td></tr><tr><td> קאמרי הדמית אולטרה שקטה </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 64-1487 </td></tr><tr><td> PH-1פלטפורמת תנור סדרה 20 </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 64-0284 </td></tr><tr><td> מערכת חימום </td><td> וורנר מכשירים </td><td> TC-344B </td></tr><tr><td> מטרת טבילה במי 40X </td><td> אולימפוס </td><td> 1-UM587 </td></tr><tr><td> מטרת טבילה במי 10X </td><td> אולימפוס </td><td> 1-UM583 </td></tr><tr><td> מבדה DG-4 </td><td> סאטר מכשירים </td><td> DG-4/OF </td></tr><tr><td> MetaMorph תוכנה </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> 40000 </td></tr><tr><td> Imaris תוכנה </td><td> Bitplane </td><td> BPI-IM70-F1 </td></tr></tbody></table>

הדמית זמן לשגות הגירת neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

יש גוף משמעותי של ראיות מצביעות על כך שתאי עצב חדשים נוצרים באופן פונקציונלי constitutively מברכת אנדוגני בתאי גזע עצביים באזורים מוגבלים של המוח של יונקי הבוגרים. neuroblasts יילוד מאזור subventricular (SVZ) נודד לאורך הנחל הנודד המקורי (RMS) ליעד הסופי שלהם בנורת חוש הריח (OB) 1. בRMS, neuroblasts להעביר באופן כלשהו ברשתות ensheathed ידי תהליכי astrocytic 2,3 באמצעות כלי דם כתמיכה מבנית ומקור לגורמים מולקולריים הנדרשים להגירת 4,5. בOB, neuroblasts להתנתק מהכבלים ולהעביר רדיאלית לשכבות השונות המוח המאורך שבו הם להתמיין לinterneurons ולהשתלב ברשת הקיימת 1, 6. בכתב יד זה יתאר את ההליך לנדידת תאי ניטור בפרוסות חריפות של המוח המכרסם. השימוש בפרוסות חריפות מאפשר assessmאף אוזן גרון של נדידת תאים בmicroenvironment שדומה מאוד לתנאי vivo ובאזורים במוח שקשה לגשת לדימות vivo. בנוסף, זה ימנע מצב culturing ארוך כמו במקרה של תרבויות organotypic ותא שסופו של דבר עשוי לשנות את מאפייני הנדידה של התאים. מבשרי נוירונים בפרוסות חריפות ניתן דמיינו באמצעות אופטיקה DIC או חלבוני ניאון. תיוג הנגיפי של מבשרי נוירונים בSVZ, השתלת neuroblasts מעכברי כתב לתוך SVZ של עכברי סוג פראי, ושימוש בעכברים מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בneuroblasts כל השיטות המתאימות להמחשת neuroblasts ולאחר הגירתם. שיטה האחרת, לעומת זאת, אינה מאפשרת לתאים בודדים להיות במעקב במשך תקופות זמן ארוכים, בגלל הצפיפות הגבוהה של תאים שכותרתו. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ זקוף ניאון שדה רחב מצויד במצלמת CCD להשיג מרווח רכישה מהירה יחסית (1 image כל 15 או 30 שניות) באופן מהימן לזהות הנייח ושלבים נודדים. זיהוי מדויק של משך השלבים הנייחים ונדידה הוא חיוני לפרשנות חד המשמעית של תוצאות. גם בצענו רכישות מרובות z שלב כדי לפקח הגירת neuroblasts ב-3D. הדמית ניאון שדה רחב כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש נדידה עצבית 7-10. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתיוג neuroblasts, ביצוע וידאו בזמן אמת הדמיה של הגירת neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי העכבר המבוגר, וניתוח נדידת תאים. בעוד הפרוטוקול המתואר הודגם ההגירה של neuroblasts במבוגר RMS, זה יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר נדידת תאים במוח לאחר לידה עוברי ומוקדם.

אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

קיים גוף ראיות משמעותי המצביע על כך שנוירונים תפקודיים חדשים נוצרים באופן קבוע ממאגר אנדוגני של תאי גזע עצביים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור נדידת נוירובלסטים (Neuroblasts) בחתכים חדים של מוח עכבר בוגר. הדבר משיג תחילה על ידי סימון של תאי קדם עצביים באזור התת-וונטריקולרי (subventricular zone) במוח עכבר בוגר, חמישה עד שמונה ימים לאחר סימון הנוירובלסטים, והכנת חתכים חדים של המוח. לאחר מכן, מבוצע דימות במרווחי זמן (time lapse imaging) של נדידת הנוירובלסטים.בסופו של דבר, מיקרוסקופיה בזמן אמת בשדה רחב (widefield realtime microscopy) משמשת להצגת הדינמיקה של נדידת נוירובלסטים בחתכים אקוטיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית על ידי חקר תפקידם של רמזים מולקולריים שונים ומנגנונים תאיים המעורבים בנדידת התאים. כעת, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תהליכים פיזיולוגיים המווסתים נדידה עצבית במוח של בוגר, אך ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון חקר נדידה עצבית במוח איסכמי ובמהלך ההתפתחות העוברית.התחילו את ההליך על ידי הכנת נוזל חבירה מלאכותי (CSF) מבוסס סוכרוז לחיתוך הפרוסות, ו-A CSF מבוסס נתרן כלוריד בטמפרטורה של 32 °C לשמירה על הפרוסות עד לצילום; לאחר מכן, חמצננו את התמיסות על ידי בעבוע רציף של 95% oxygen ו-5% carbon dioxide. לאחר מכן, הרדימו את העכבר בעל הנוירובלסטים המסומנים פלואורסצנטית באמצעות הזרקה פנימית של ketamine xylazine. לבסוף, הכינו במהירות את תמיסת החיתוך הקרה במיוחד, בעלת מראה ג'לטיני, באמצעות חנקן נוזלי.לאחר מכן, שאבו 15 עד 20 מיליליטר של תמיסת חיתוך קרה בקרח באמצעות מזרק של 20 cc ובצעו פרפוזיה תוך-לבבית לעכבר. אם יש צורך בסימון של כלי הדם במקום פרפוזיה עם תמיסת החיתוך, הזריקו 200 מיקרוליטר של dextran Texas red בריכוז של 10 מיליגרם למילילטר, באופן trans Cardi לתוך החדר השמאלי של הלב, והמתינו שתיים עד שלוש דקות לפני עריפת ראשו של העכבר. לאחר ביצוע הפרפוזיה התוך-לבבית, ערפו את ראשו של העכבר במהירות, טבלו את הראש בתמיסת החיתוך הקרה בקרח והעבירו אותו לוibratome. גזרו את הגולגולת באמצעות מספריים לאורך התפר הסגיטלי מהמוחון ועד לפלוגה הריחנית.בשלב הבא, הסירו בעדינות את תשוליות הגולגולת באמצעות פינצטה. לאחר מכן, הסִירו את חלקו הקדמי של המוח באמצעות סכיץ. לאחר מכן, בצעו שני חתכים שגיתליים בחלק הלטרלי ביותר של כל המיספרה, וחתכו את המוח לאורך הסדרה הבין-המיספרלית. לבסוף, הסירו בעדינות את המוח באמצעות שפכטל והניחו אותו בתמיסת חיתוך קרה בקרח.הניחו את שני ההמיספרים (hemispheres) בנפרד על גוש אגר (agar) בריכוז 4%, כאשר הצד הדורסלי נוגע באגר. לאחר מכן, הדביקו את הגוש, יחד עם הצד החתוך לטרלית של שני ההמיספרים, לפלטפורמה של מכשיר ה-Vibram, כאשר הצד המדיאלי פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הכניסו את הפלטפורמה לתא ה-Vibram.מלאו אותו בתמיסת החיתוך. לאחר מכן, שמרו על רמת חמצון של התמיסי במהלך הכנת הפרוסות על ידי הזרמת בועות של 95% oxygen, 5% carbon dioxide. כעת הכינו חתכים בעובי 250 micron באמצעות הוibrator.יש להשתמש במהירות חיתוך נמוכה ובתדר רטט גבוה של הלהב כדי לקבל חתכים באיכות גבוהה. ברגע שפרוסה משתחררת מהלהב, הוצא אותה בעדינות מתמיסת החיתוך והנח אותה בתא דגירה מלא ב-A CSF מחומצן המוחזק בטמפרטורה של 32 degrees Celsius במקלח מים. בהליך זה, הנח בזהירות את הפרוסה בתא ההדמיה של המיקרוסקופ כדי למנוע סחיפה של הפרוסה במהלך ההדמיה.ייצבו את הפרוסה על ידי הנחה זהירה של רשת ניילון מעליה. ודאו שהפרוסה עוברת פרפוזיה רציפה של A CSF. לאחר מכן, השתמשו בעדישה פי 10 כדי למצוא שדה עניין.פתחו את תוכנת metamorph וודאו שרשת הנילון אינה חוסמת את שדה הדמיה. לאחר מכן, השתמשו בעדשה פי 40 וכוונו את הפוקוס. וודאו שקיים מספיק תמיסה בין העדשה לבין הפרוסה.באמצעות תוכנת Metamorph, הגדירו את פרמטרי רכישת ה-time-lapse, כגון משך העירור (excitation), מספר מישורי ה-Z, המרחק בין כל חתך Z, מרווח הזמן ומשך ההקלטה. לאחר מכן, הפעילו את רכישת ה-time-lapse. הנתונים נשמרים באופן אוטומטי על ידי Metamorph כקובץ tiff, כאשר כל קובץ תואם לנקודת זמן אחת של סרטון ה-time-lapse שנרכש. כדי לפתוח את הסרטון ב-Mrs.טענו את התמונות שנרכשו על ידי גרירה והשלכה של תמונת נקודת הזמן הראשונה של הסרטון אל סמל התוכנית. לאחר טעינת הסרטון, התאימו את הבהירות והניגודיות של האות בחלון כיוון התצוגה. הגדירו את הפרמטרים של הסרטון שנרכש, כגון גודל הווקסל ומרווח הזמן במאפייני התמונה, והגדירו חלונות נקודות זמן שווה-מרחק.לאחר הגדרת גודל הווקסל (voxel), ניתן להציג את הפריים בתלת-ממד, כמו גם את הזמן ואת קנה המידה של הסרטון, לצורך מעקב אוטומטי אחר התאים שהוקלטו. צרו נקודה עבור כל תא בשטח בחלון ה-surpass באמצעות בחירת פונקציית ה-spots, ומדדו את קוטר התא למעקב בחלון הפרוסה (slice window). הגדירו את פרמטרי המעקב והמשיכו בתהליך.בדקו את מהימנות האובייקטים שזוהו לאורך זמן. אם לא כל התאים הנודדים זוהו באופן אוטומטי, שנו את סף הזיהוי וודאו שכל התאים נבחרו עם נקודות בכל נקודות הזמן. יש להגדיר את המרחק המקסימלי ואת גודל הרווח המקסימלי בין שתי נקודות המייצגות נקודות זמן סמוכות של אותו עקב, כדי שהתוכנה תוכל לחבר את נקודות הזמן.לאחר יצירת המסלולים, ניתן לסנן אותם ולהסיר מסלולים שאינם רלוונטיים פשוט על ידי מחיקתם. ניתן לתקן מסלולים על ידי חיבור וניתוק של מסלולים שונים ונקודות זמן שונות של אותו מסלול. ברגע שכל התיקונים בוצעו, בצעו בדיקה סופית של המסלולים וייצאו את הנתונים לקובץ Excel, כולל ההעתקה של התא לנקודת זמן, אורך המסלול, מרחק ההעתקה ומשך המסלול.סרטון זה מציג הדמיית time lapse של נדידת נוירובלאסט (Neuroblast) ירוק לאורך כלי דם המסומנים ב-dextran, Texas red. שימו לב כי הנוירובלאסט הנודד מראה התנהגות סלטטורית (saltatory), כאשר שלבי הנדידה נקטעים על ידי תקופות סטטיות. סרטון זה מציג את מעקב נדידת הנוירובלאסט באמצעות תוכנת imas.הכדורים והקוים מציינים את גופי התאים ואת מסלולי הנדידה של תאים בודדים, בהתאמה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש להשיג פרוסות חיות טריות באיכות גבוהה של מוח קדמי של עכבר בוגר. בנוסף, יש לייצב את הפרוסות היטב בתא ההדמיה על ידי הנחה זהירה של רשת ניילון, כדי למנוע את תזוזת הפרוסה במהלך ההדמיה.כל שינוי בקצב פרפוזיית ה-A CSF, פרפוזיה לא סדירה או שינוי דרסטי בטמפרטורה עלולים לגרום לסטיות ולשינויים במישור המוקדי במהלך ההדמיה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד להקליט ולנתח נדידה של נוירובלסטים בפרוסות חדות של מבוגרים. אנו ממליצים להשתמש במרווחי צילום קצרים בסדר גודל של 15 עד 30 שניות כדי לזהות באופן מהימן את תחילתם וסיומם של השלבים המהגרים והסטטיים.

time-lapse-imaging-neuroblast-migration-acute-slices-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  הדמיה קונפוקלית של נוירונים נודדים בתרבית פרוסה אורגנוטיפית של מוח עכבר עוברי באמצעות In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse כדי לצפות בנדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח מהאזור התת-חדרי לצלחת קליפת המוח באמצעות פיגומי גליה רדיאליים בפרוסות מוח עובריות של עכבר.

הדמיית זמן-lapse של נדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח בפרוסות מוח עובריות של עכבר

הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

דימות תהודה מגנטית (MRI) הפך לכלי פופולרי יותר ויותר לבחינת הפנוטיפ של עכברים שעברו שינוי גנטי. מאמר זה מדגים את שיטות הדרושים כדי להשיג תפוקה גבוהה phenotyping של עכברים שעברו שינוי גנטי באמצעות מרובות עכבר MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

שיטה לטעון אזור תאי subventricular (SVZ) עם צבעי סיד חיווי לפעילות הסידן הקלטה מתוארת. SVZ לאחר הלידה מכיל תאים צפופים, כולל תאי אב עצביים וneuroblasts. במקום להשתמש בטעינת אמבטיה אנו מזריקים צבע בלחץ בתוך הרקמה המאפשרת דיפוזיה צבע טובה יותר.

הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד

ההכנה של פרוסות חריפות מוח מhippocampi המבודד, כמו גם את ההקלטות אלקטרו סימולטני של האסטרוציטים ונוירונים...

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

למד הדמיית זמן של הגירת נוירובלסטים בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמיקת ההגירה והמנגנונים התאיים המעורבים בפיתוח עצבי.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

גלה סרטונים נוספים