הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם
23 במאי 2012
סרט הווידאו הזה מדגים נהלים ואפיון של איים הלבלב אדם באמצעות hematoxylin ו eosin (H & E) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC). סעיפים הלבלב מן הראש, הגוף, באזורים הזנב מוכתמות על ידי שני H & E ו-IHC לקבוע הרכב האנדוקרינית איון (אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד), שכפול תאים (Ki67), וכן מחלחל דלקתיות (H & E, CD3). האזור אונקלי הוא מקומי באמצעות IHC של הלבלב פוליפפטיד.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לאפיין אילי לבלב אנושיים באמצעות צביעת hematin and eosin ואימונוהיסטוכימיה. דבר זה מושג על ידי יצירת חתכים סדרתיים מדגימה של לבלב שטומנה בבלוק פראפין. החתכים מונחים לאחר מכן על סליידים באוריינטציה המקורית שלהם.
חלק מהשקופיות נצבעות ב-hematin ו-eoin בעוד ששאר השקופיות נצבעות בשיטת immunohistochemistry; השלב הסופי הוא לסרוק את השקופיות הצבועות ולארגן אותן לפי מקרה. בסופו של דבר, ניתן להעלות תמונות אלו למאגר פתולוגיה מקוון שבו יוכלו להיצפה חוקרים אחרים בתחום. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהשקופיות נצבעות בסדרה תוך שמירה על אוריינטצייתן המקורית.
את הפרוצדורה ידגימו לינדה סניידר, טכנאית היסטולוגיה, אמילי מונטגומרי, מדענית ביולוגית, וטיפני היפו, טכנאית מעבדה במעבדתי. לתחילת העבודה, הגדירו את אמבט המים והמיקרוטום בהתאם לנהלים הסטנדרטיים למיקרוטומיה של פאראפין. לאחר מכן, סמנו שקופיות טעונות חיובית עם מספר המקרה, אזור הלבלב ומספר השקופית.
לאחר שהכל מוכן, מקמו את בלוק הפרפין בתושבת המיקרוטום כאשר תווית הקסטה נמצאת בצד שמאל. בהתאם לנהלי המיקרוטומיה הרגילים, בצעו חיתוכים בבלוק עד לחשיפה אחידה של הרקמה. ברגע שהרקמה נחשפת באופן שווה, הכינו סרט של חיתוכים סדרתיים בעובי של כ-4 microns.
נדרשים שלושה עד שישה חתכים, בהתאם למספר הצביעות הראשוניות הנדרשות. לאחר מכן, הפרד את חתכי הסרט. הרם כל חתך לפי הסדר והנח אותו על עלית.
סמנו את מספר החתך בעיפרון. אם חתך אינו שמיש, דלגו על מספר זה והמשיכו במספור החתכים לפי הסדר המדויק. הקפידו לשמור על אותה אוריינטציה של הדגימה על הזכוכית כפי שהייתה בקסטה, כאשר תווית הזכוכית מופנית שמאלה.
בשלב הבא, הניחו את השקופיות במעמד לשקופיות והניחו להן להתייבש במהלך הלילה. בטמפרטורת החדר, אתמו מחדש את פני בלוק הפרפין בשכבה דקה של פרפין כדי לשמר את הרקמה, ואחסנו אותו בטמפרטורת החדר או ב-minus 20 degrees Celsius. חזרו על הליך זה עבור הדגימה הבאה.
חשוב לשמור על המספור של חתכים סדרתיים בכל רמה, כפי שמוצג לעיל עבור צביעת h and e. הניחו את השקופית הראשונה מכל בלוק במגש שקופיות, ולאחר מכן הניחו את המגש בתבנית הראשונה של מכשיר הצביעה האוטומטי. בחרו בתוכנית HE הסטנדרטית והפעילו את תהליך הצביעה.
עם סיום הצביעה, הוציאו את השקופיות מהצובע האוטומטי והניחו אותן במנדף לצורך הנחת זכוכית כיסוי. הניחו זכוכית כיסוי על כל שקופית תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות. לסיום, סמנו את השקופיות באמצעות תווית מודפסת והניחו להן להתייבש לחלוטין במנדף.
התחילו בהגדרת מכשיר הצביעה האוטומטי ובהכנת כל הרכיבים הדרושים. בחרו בתוכנית Daco לצביעות כפולות. הזינו את מספר הפלחיות ואת סוג הטיפול שכל אחת מהן תקבל.
טענו את כל הריאגנטים למכשיר הצביעה האוטומטי בהתאם להמלצות היצרן. לאחר מכן, הכינו את TBST, באפרים של ציטראט, נוגדנים וריאגנטים אחרים הנדרשים לפרוצדורה. בצעו דה-פראליזציה (De parize) לשקופיות על ידי הנחתן ב-xylene למשך חמש דקות.
אין לאפשר לנסכיות להתייבש, שכן הדבר יגרום לצביעת רקע ונקבים מוגברת במהלך ה-depa. שפכו בופר ציטראט למכשיר אידוי (steamer) לחימום מוקדם לפני השימוש. לאחר מכן, העבירו את נסכיות ה-depa לסדרה של שטיפות אתנול.
שטפו את השקופיות פעם אחרונה במים דה-יוניזציה. העבירו את השקופיות לתמיסת באפר ציטראט שחוממה מראש והשאירו אותן לאידוי במשך 30 דקות. בתום תקופה זו, העבירו מיד את השקופיות לאמבט מים בטמפרטורת החדר עד לקירורם המלא.
לאחר הקירור, העבירו את השקופיות למגשי צביעה אוטומטית של Dayco, תוך הקפדה על שמירת הרצף הנכון. לבסוף, הפעילו את תוכנית הצביעה הכפולה שהוטענה קודם לכן. עם סיום תוכנית הצביעה הכפולה, הוציאו את השקופיות מהצובע האוטומטי והניחו להן להתייבש במשך שעה אחת לפחות לפני תהליך הדהידרציה.
כדי להמשיך בתהליך הדהידרציה, העבירו אותם ל-80% ethanol למשך דקה אחת. המשיכו בדהידרציה של השקופיות על ידי השריה ב-95% ethanol ולאחר מכן ב-100% ethanol. לבסוף, טבלו את השקופיות ב-xylene והחזיקו אותן כך למשך דקה אחת.
כדי להשלים את הפרוצדורה, יש להכין מיד את הזריקות עם כיסויי זכוכית באמצעות cyto seal. הדפיסו תוויות המכילות את פרטי המקרה, כולל האיבר ומספר הבלוק, סוג הצביעה והתאריך. הצמידו תווית לכל זריקה לצורך סריקת זריקות הצביעה.
הניחו אותן על מגש הסורק ופעלו לפי הנוהל הסטנדרטי. ארכבו את השקופיות הצבועות בטמפרטורת החדר ואת השקופיות הנותרות שלא נצבעו במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לבסוף, ארגנו את התמונות הצבועות לפי תורם וסוג הרקמה שנצפתה.
להלן דוגמה לצביעה של KI 67 ואינסולין הן ברמת הגדלה נמוכה והן ברמת הגדלה גבוהה. תמונות של חתכי הלבלב הצבועים מועלות למאגר פתולוגי מקוון היוצר ביו-בנק וירטואלי. באמצעות מאגר זה, חוקרים יכולים לגשת במהירות למידע הדרוש למחקר על סוכרת מסוג 1.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה והצביעה של סליידים באיכות גבוהה מבלב אנושי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים פרוצדורות לאפיון של איים לבלב אנושיים באמצעות צביעת hematoxylin and eosin (H&E) ואימונוהיסטוכימיה (IHC). טכניקה זו מאפשרת להעריך את ההרכב האנדוקריני של האיים, רפליקציית תאים והסננות דלקתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אנדוקרינולוגיה
- היסטולוגיה
רקע
- איי לבלבל אנושיים ממלאים תפקיד מכריע במטבוליזם של גלוקוז.
- אפיון הרכב האיים חיוני להבנת מחלת הסוכרת.
- H&E ו-IHC הן טכניקות סטנדרטיות לניתוח רקמות.
- שמירה על האוריינטציה המקורית של השקופיות קריטית להערכה מדויקת.
מטרת המחקר
- לאפיין איי לבלבל אנושיים.
- לקבוע את ההרכב האנדוקריני של האיים.
- להעריך רפליקציה של תאים ותגובות דלקתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת חתכים סדרה מדגימות לבלב שטומנו בפרפין.
- צביעת חתכים ב-H&E וב-IHC.
- סריקת שקופיות צבועות לצורך ניתוח.
- ארגון תמונות לפי מקרה להעלאה למסד הנתונים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי אינסולין, גלוקגון ופוליפפטיד לבלב באיים.
- הערכה של שכפול תאים באמצעות צביעת Ki67.
- הערכה של חדירות דלקתיות באמצעות צביעת H&E ו-CD3.
- מיקום מוצלח של האזור המקולף (uncinate region) באמצעות IHC.
מסקנות
- השיטה מספקת אפיון מקיף של איים לבלביים.
- שמירה על הכיוון המקורי של הפלח משפרת את דיוק הניתוח.
- התוצאות תורמות להבנת התפקוד הלבלבי במצב בריאות ובמחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תהליכי עבודה סטנדרטיים של היסטופתולוגיה עבור איים של תאי בטא בלבלב אנושי מאפשרים אפיון הדיר של תאים אנדוקריניים, ובכך תומכים בתיקוף מטרות במחקרים על סוכרת. באמצעות שימור אוריינטציית חתכים סדרתיים ויצירת תמונות דיגיטליות של השקף כולו, השיטה מקלה על שיתוף נתונים בין-פונקציונלי ועל ביו-בנקאיות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של טיפולים המכוונים לאיים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי אספקת נתונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית על הרכב האיים, שכפולם והסננת חיסונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות היסטופתולוגיה קפדנית ומיקום אימונולוגי של תאי איים אנדוקריניים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אפיון מורפולוגיית האיים, גודלם, צפיפותם והרכב התאים האנדוקריניים באמצעות צביעות H&E ו-IHC.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי הערכת שכפול איים ותאים אפופטוטיים באמצעות Ki67 וסמני פרוליפרציה אחרים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות עוברי-תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים, באמצעות עיבוד סטנדרטי של לבלב אנושי לאזורים מוגדרים (ראש, גוף, זנב) ולחתכים רוחביים.
- ערך תפעולי: מענה לסטנדרטיזציה ושחזוריות של בדיקות באמצעות מספור וסימון אלפביתי של תתי-חתכים על בסיס גודלם, לצורך ניתוח מלא של חתכים רוחביים.
- ערך הפלטפורמה: הדגשת המוכנות לסריקה ויכולת ההרחבה באמצעות תמונות דיגיטליות של שקופיות שלמות, המאורגנות במסד נתונים פתולוגי מקוון הנגיש ליותר מ-200 חוקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי הערכת איים לזיהוי דלקת, פיברוזיס, עמילואיד וחדירה של תאי T באמצעות צביעות H&E ו-CD3.
- ערך תפעולי: מתאר את הרצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי הערכת המרכיבים האנדוקריניים והאקסוקריניים, כולל פתולוגיה דוקטולרית ונאופלזיה.
- קידום מותאם סיכון: מתמקד בהפחתת סיכונים חזויה על ידי אפיון נאופלזיה תוך-נישבתית בלבלב והקשר שלה למערכת הנישבים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרות ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי מתן אפשרות לביצוע חיתוכים סדרתיים, צביעה סטנדרטית ובנקאות ביולוגית דיגיטלית של רקמת לבלב אנושית.
- ביולוגיה של גילוי: תמיכה בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות היסטופתולוגיה ומיקום אימונולוגי של איים לבלביים ותאים אנדוקריניים.
- סריקה: הבטחת מוכנות ושחזוריות של הבדיקה על ידי שמירה על אוריינטציה מקורית של השקופיות במהלך חיתוך סדרתי וצביעה בסדרות.
- אנליטיקה: הדגשת מדידות כמותיות של שטח האיים, מספרם, הרכב התאים האנדוקריניים, שכפול וחדירות של T-cells באמצעות H&E ו-IHC כדי לאפשר השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: קישור לרציפות פרה-קלינית באמצעות הערכת עמילואיד באיים, פיברוזיס וחדירות דלקתיות הרלוונטיות לפתוגנזה של סוכרת מסוג 1.
- שימוש חוזר ארגוני: הגדרת השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר באמצעות מאגר פתולוגיה מקוון המאפשר שיתוף נתונים מהיר ובחירת בלוקים עבור חיתוכים סדרתיים בפרפין או בהקפאה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית בהרכב האנדוקריני של האיים ובאינטראקציות חיסוניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של חיתוך סדרתי, צביעה וארכוב דיגיטלי של שקופיות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות זיהוי מוקדם של פתולוגיה באיים ומצב השכפול.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על מורפולוגיה כמותית של האיים, צפיפות ופנוטיפים של תאים אנדוקריניים.
שיקולים ליישום
- מומחיות מדעית נדרשת בהיסטו-טכנולוגיה, אימונוהיסטוכימיה ותהליכי עבודה של פתולוגיה דיגיטלית.
- צרכי תשתית אנליטית וציוד, כולל מיקרוטום, צובע אוטומטי, סורק שקופיות וגישה למסד נתונים פתולוגי מקוון.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין-צוותית עבור סימון שקופיות, מספור חתכים ושמירה על אוריינטציה בין צוותי ההיסטולוגיה והדימיון.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים, במיוחד עבור יישום עיבוד אזורי סטנדרטי (ראש, גוף, זנב) ללבלב שאינו אנושי.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות ברקמות מתורמי איברים ואת הצורך בתיקוף אופטימלי של נוגדנים עבור צביעת IHC מולטיפלקס.
