הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד

מטרת הליך זה היא לדמות את פעילות הסידן של תאים באזור התת-חדרי שלאחר הלידה. זה מושג על ידי הסרה זהירה של רקמת מוח מעכבר לאחר לידה. השלב השני הוא ליצור פרוסות מוח חיות חריפות המכילות את האזור התת-חדרי.

לאחר מכן, פרוסות המוח נטענות בצבע רגיש לסידן. השלב האחרון הוא לצלם פעילות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם זמן-lapse. בסופו של דבר, הדמיית זמן-lapse של פעילות הסידן בתאי אזור החדר משמשת להצגת דינמיקת פעילות בין-תאית כדי לחשוף דפוסי תקשורת בין סוגי תאים שונים וכלי הדם.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה, כגון כיצד סוגי תאים שונים מתקשרים זה עם זה, וכיצד תאים עשויים להשפיע על כלי הדם לאחר הקרבה ועריפת ראש של גור עכבר P 20 עד P 30. על פי הנחיות שאושרו על ידי המוסד, הנח את הראש בשדה מגש עם תמיסת דיסקציה. ייצב את הראש בעזרת מלקחיים והשתמש במספריים מיקרו כדי לבצע חתכים רציפים סביב הגולגולת וקו האמצע.

ודא שפקעת הריח נשארת מחוברת למוח ואינה פגומה. בצע חתכים בצד הגבי ולאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להסיר את הגולגולת שמעליו מהמוח. לאחר מכן, תוך כדי החזקת הראש במלקחיים, השתמש בלהב כירורגי כדי לבצע חתך קורונלי ברמת הלמבדה.

השתמש באותו סכין גילוח כדי לבצע חתכים סגיטליים משני צידי המוח כשניים עד שלושה מילימטרים לרוחב קו האמצע. לאחר מכן השתמש בלהב כדי לגרוף מתחת למוח ולהסיר אותו לחלוטין מהגולגולת. ההליך עד לנקודה זו צריך להיעשות תוך פחות משלוש דקות.

הניחו טיפה של דבק סופר מבוסס ציאנואקרילט על צלחת הוויברם. לאחר מכן הרימו את רקמת המוח והרכיבו אותה על אחד הצדדים השטוחים שנוצרו על ידי החיתוך הסגיטלי הרוחבי. הרכבת בלוק אגרוז לייצוב הרקמה במהלך החיתוך היא אופציונלית.

שטפו את להב הוויברם באתנול כדי להסיר שמנים ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים. הנח את הלהב לתוך מחזיק הלהב והתקן את מחזיק הלהב על הוויברטור. הגדר את הוויברטור כך שפרוסות הרקמה ייחתכו לעובי של 250 עד 350 מיקרון ברטט בתדר גבוה ובמהירות נמוכה חותכות בהדרגה דרך הרקמה.

המראה של נורת הריח הוא אינדיקטור טוב לכך שהחלקים הסגיטליים מתקרבים לאזור התת חדרי. מראה החדרים ועיבוי הקורפוס קלוסום הם גם אינדיקטורים טובים להופעת האזור התת-חדרי לאחר מכן. לאחר שמגיעים לאזור התת-חדרי, השתמשו בפיפטה פסטה מפלסטיק עם חתך הקצה כדי להסיר כל פרוסה ולהעביר אותה לתא החזקת פרוסות.

עם CSF. הפרוסות דורשות שעה אחת של דגירה ב-CSF. במהלך תקופה זו, ניתן להכין את הפיפטות, הצבע והמיקרוסקופ לשלבי ההדמיה הבאים.

להכנת הפיפטות, משוך שש עד שמונה פיפטות זכוכית כך שלכל אחת אורך קצה של כשני מילימטרים וקוטר של שניים עד שלושה מיקרון. בנוסף, מחזיק הפיפטה מוגדר מראש בזווית של כ -16 מעלות כך שניתן יהיה להרכיב את הפיפטה מבלי ליצור קשר עם תא הזלוף או להפריע למיקום המטרה. להכנת צבע הסידן, הוסף 4.6 מיקרוליטר של תמיסה אוניק F1 27, 20% ב-DMSO ל-50 מיקרוגרם של שפעת הו ארבע.

לבסוף, כדי להכין את המשאבה הפריסטלטית, שהשימוש בה מסייע למזער את סחף התמונה, העבירו CSF דרך קווי הזלוף והבטיחו שהקווים נקיים מבועות. כעת, מקם את קצה הוואקום כדי לוודא שהתמיסה נשאבת מתא הזילוף. תמונה זו מציגה את ההגדרה של מערכת הזילוף.

הפתרון צריך להיות ברמה נאותה כדי לטבול את המטרה במרחק העבודה המתאים, אך לא כל כך גבוה שהתמיסה תישפך על דפנות החדר. הקשיבו ליציבות כדי לאמת שאיפה מתמדת למרוח צבע העמסה בשיטת האמבטיה. ראשית, הכינו מיליליטר אחד עד שניים מתמיסת העבודה של ארבעה עד חמישה מיקרו-מולרים על ידי דילול תמיסת המלאי.

ב-A CSF, העבירו את הפרוסות לכלי מתורבת בגודל 35 מילימטר עם תחתית רשת מלאה ב-A CSF. השתמש בפיפטה מפלסטיק של שלושה מיליליטר כדי להסיר בעדינות את ה-A CSF ובמקביל להוסיף את תמיסת העבודה של צבע הסידן. לאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות בסביבה מבוקרת של גז פחמן דו חמצני של 5%.

לאחר הדגירה, הנח את הפרוסה בחזרה לתא האחיזה המלא ב-A CSF כדי לשטוף צבע שלא נכנס לתאים. לאחר 30 דקות ב-CSF, העבירו את הפרוסה לתא הזלוף להפעלת לחץ של הצבע. העבירו פרוסה מתא ההחזקה לתא הזלוף במיקרוסקופ שהוקם.

לאחר מכן מלאו מחדש את פיפטת הזכוכית בתמיסת עבודה של צבע מיקרו-מולארי 250. ודא שקצה הפיפטה נקי מבועות ומונח על המניפולטור המיקרו. עכשיו הורד את הפיפטה לאזור העניין.

אפשר למקם את הפיפטה כך שהקצה יהיה כמה מיקרומטרים מעל המשטח הפרוס, או לקבור כמה מיקרומטרים מתחת לפני השטח, אבל הרחק מהאזור המתועד. הגדר את שפריצר הפיקו כך שיספק פחות משלושה קילו לאינץ' רבוע ומרח את הצבע למשך דקה עד שתיים. ייתכן שיהיה צורך ביישומים חוזרים בהתאם לתיוג כפי שהוערך על ידי העין.

כאשר מיושם על פני השטח של הפרוסה, פרוטוקול זה יסמן באופן מועדף נוירובלסט כאשר הוא מיושם מתחת לפני השטח, טכניקה זו תעדיף לסמן אסטרוציטים, אך אם מיושמים במשך יותר משלוש דקות בריכוז של 500, נוירובלסט מיקרו-מולרי יסומן. ללא קשר למיקום קצה הפיפטה, אפשר לפרוסה להישטף ולהתאושש ב-CSF למשך 30 עד 45 דקות. אתר את אזור העניין עם יעד הספק נמוך יותר, ולאחר מכן עבור ליעד טבילה במים בעוצמה גבוהה יותר והעריך את בריאות התאים באזור העניין.

תחת ניגוד הפרעות דיפרנציאלי, תאים בריאים נראים עגולים ושמנמנים ומציגים עומס חלש של שפעת. לאחר וידוא שהזלוף והוואקום פועלים כראוי, הגדר את רזולוציית זמן-lapse והרזולוציה המרחבית לקצבים הרצויים. במקרה זה, מסגרת אחת מצולמת בערך בכל שנייה ברזולוציה של חמש 12 על חמש 12 פיקסלים.

לאחר הגדרת משך הזמן של 2 עד 10 דקות, התחל את הריצה. חומרים פרמקולוגיים נשטפים במשך חמש עד 10 דקות ולאחר מכן נשטפים למשך חמש עד 10 דקות נוספות. תמונה ממוצעת מייצגת זו מהקלטת זמן-lapse של פעילות סידן צולמה לאחר אסטרוציטים באזור התת-חדר.

היו עמוסים בלחץ. מריחת שפעת הו 4:00 בבוקר עמוק לתוך הפרוסה. הסרטים נרכשו ב-0.5.

צעדים בפעם השנייה, אזורי העניין ממוקמים מעל תאים המציגים פעילות. להלן העקבות מאזורי העניין הממוספרים שהוצגו קודם לכן. העקבות סוננו עם ממוצע נע ונורמלו.

הסולם האנכי מייצג פי שניים דלתא F על F אפס כאשר F היא עוצמת האות, ו-F אפס הוא אות הבסיס הממוצע ודלתא F שווה F פחות F אפס. ברגע ששולטים. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע עד חמש שעות אם היא נעשית כהלכה.