Name: הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: חקור את שיטת PMCA להגברת חלבוני פריון מקופלים לא נכון בתרבית. למד כיצד לבצע מחזורי סוניקציה וחימום כדי לחקור מנגנוני המרה ומחסומי מינים בביולוגיית פריון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר Vesper פה מארי ראמוס לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 וG20RR024001) ומכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (2R01 NS052609).

1. הכנת הציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Misonix 3000 או 4000 sonicator Misonix (Farmingdale, ניו יורק) מחובר לThermo Electron Neslab אמבטית EX-7 מים (Newington, NH) כדי לשמור על טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס Sonicate את הדגימות ב200 רצועות μl בעלי קירות דקים PCR צינור עם כובעים כיפה מתקבלים מThermo Scientific (Waltham, MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicator מותג חדש דורש &quot;פריצה&quot; תקופת ההפעלה רציפה 9. פריצה של חודשי תקופה מורכבת של פרץ 40-sec sonication ומחזורי דגירה 10-דקה עם רמת המשרעת להגדיר עד 10. אדם צריך להתבונן בשחיקה לאורך פני השטח של טיטן microplate הצופר (1 איור, לוח ב &#39;). המים זורמים ייראו עכורים לבן עקב שחיקה של טיטניום microplate הצופר. החלף את המים מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגברה של PRP Sc תשתנה לאורך קרן microplate. יעילות ההגברה הטובה ביותר PRP Sc ניתן לקבל בתוךברדיוס של 5 סנטימטר ממרכז microplate הקרן (ראה תרשים 1, לוח ג&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב אחד PMCA מורכב 144 מחזורים. כל מחזור מורכב מsonication 5 שניות ודגירת דקות 10. זה בערך כרוך ל24 שעות בכל סבב של PMCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוקת החשמל של sonication, מוצגת בלוח הבקרה של sonicator, משתנית עם המספר של צינורות הנמצאים במדף של sonicator והטמפרטורה של מים זורמים מאמבט מי PCR. ודא שהמים מתאזנים על 37 מעלות צלזיוס, ולא למלא יותר מ 30% ממתלת הצינור של sonicator (1 איור, לוח C). מורח את צינורות PCR דרך קרן microplate. יש שורה אחת לפחות של חלל ריק בין רצועות צינור PCR ולאפשר לא יותר מארבעה צינורות המחוברים יחדיו לרצועה (1 איור, לוח C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוחו של sonication הוא קריטי להגברת לחץ פריון מוצלחת. בעוד sonicating, להתאים את המשרעת ליש כוח תפוקההנע בין 155 ~ 170 ואט. במעבדה שלנו ברמת הכח מוגדרת לשישה ושבעה לMisonix 3000 ו Misonix 4000, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במים מזוקקים באמבט המים כדי להימנע מצבירת כתמי מים קשים. חלף שבוע מים זה. במהלך מחזורי הדגירה וsonication, עיבוי מים יתרחש בתוך מכסת צופר microplate. כדי למנוע התעבות, לצרף פנקס חום אקווריום קטן לחלק העליון של תיבת המארז של sonicator כפי שמוצג באיור 1, לוח א &#39; </li></ol> 2. הכנת הדוגמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי אוניברסיטת קרייטון ומשתמשים ועדה ולעמוד במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. לפני כל אוסף רקמות, החיה חייבת להיות מורדמת וtranscardially perfused באמצעות פוספט קר כקרח שנאגר תמיסת מלח עם 5 מ&quot;מ בEDTA pH 7.4 להסיר דם מהמוח ולהימנע מהעיכוב שלתגובת PMCA ידי דם 7. איסוף רקמות חיות במהירות באמצעות טכניקת aseptic ויש כלי נתיחה ייעודיים עבור כל זן פריון. לאחר נתיחה, הנח את הרקמה בצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5, פלאש להקפיא אותו על קרח יבש, ולאחסן אותו ב-80 ° C עד הומוגניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את מצע PMCA פתרון (PRP C), הומוגני מוח אוגר אינו נגוע (האו&quot;ם BH) לפתרון 10% משקל / נפח (W / V) עם חיץ המרת קרח קר (ראה חלק 3) באמצעות מטחנת רקמת Tenbroeck. בעוד מאחד, להיזהר לא להכניס אוויר בתוך המטחנה להימנע מוגזם קצף מהפתרון. הבהר את הפתרון על ידי צנטריפוגה XG ב 500 למשך 30 שניות וaliquot supernatant ב1.5 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל. חנות ב -80 ° C עד שימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את פתרון זרע PMCA (PRP Sc), הומוגני חומר זיהומיות (מוח, טחול, בלוטות הלימפה, רקמות אחרות או אדמה מזוהמת) כדי 10% פתרון w / v עם wate הקר כקרחr וaliquot הפתרון ב 0.6 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל. חנות ב -80 ° C עד שימוש נוסף. </li></ol> 3. הכנת מאגר המרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 0.5093 גרם של טריטון X-100 בנפח בקבוק 50 מ&quot;ל (תוצאה היא 1% ריכוז סופי של טריטון X-100) (סיגמה אולדריץ GmbH; Steinheim, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פרוטאז אינהיביטור Tablet אחת שלם (Roche Diagnostics GmbH; מנהיים, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.0931 גרם של EDTA (זה יביא לריכוז סופי של 5 מ&quot;מ EDTA) (Mallinckrodt ייקר Inc; Phillipsburg, ניו ג&#39;רזי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH ל 7.4 עם 1N NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם נפח 50 מ&quot;ל עם פוספט של Dulbecco נאגר מלוח (DPBS) (Mediatech Inc; Manassas, VA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון דרך קרום ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.45 עם מנגנון סינון ואקום. חיץ ההמרה ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מפעם אחת בחודש. </li></ol> 4. הגברה של זני פריוני שימוש PMCA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">לדלל את זרע PMCA לתוך מצע PMCA ביחס של 1:20 (5 μl תמהיל כלומר מזרע PMCA ו95 μl של מצע PMCA) לתוך צינור PCR. הסר ולאחסן aliquot μl 15 ב-80 ° C לבקרת unsonicated; שליטת unsonicated זה ישמש לכמת הגברת PRP Sc דרך עיכול proteinase K (קי) ואחריו הניתוח מערבי כתם (WB). שליטת unsonicated נוספת יכולה להיות שנוצרה על ידי נחת aliquot μl 15 שניות על 37 מעלות צלזיוס למשך PMCA התגובה. מינימום שלוש חזרות נדרש למטרות סטטיסטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא שארית המדגם (70 μl) לסיבוב אחד של PMCA כמתואר בתרשים 1, לוח א &#39;Shake צינורות כל 5 hr כדי למנוע התעבות מים על כובע הכיפה של צינור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצינורות של המדגם צריכים להיות סובבים למטה ועדינות vortexed (נזהר שהפתרון אינו נכנס כיפה) לפני הפתיחה אחרי כל הליך כדי להבטיח homogeneity ולמנוע אפשרות של זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לPMCA הסידורי (sPMCA) של זני תקופת דגירה קצרים (כלומר ח.י. TME, HaCWD, או 263K), לדלל את החומר בsonicated יחס של 1:20 ידי העברת 5 μl של מדגם sonicated מסיבוב אחד ל95 μl של נגוע טרי המוח homogenate (איור 2, לוח ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לsPMCA של זני תקופת דגירה ארוכים (כלומר ד.י. TME, 139H, 22CH, 22AH, או ME7H), לדלל את חומר sonicated ביחס של 1:1 על ידי העברת 50 μl של מדגם sonicated מסיבוב אחד ל50 μl של נגוע טרי המוח homogenate (איור 2, לוח ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שתי 15 aliquots μl מתערובת sonicated דילול בעבר (מצעדי 4.4 או 4.5) ולאחסן את אחד מהם ב-80 ° C והשני על 37 מעלות צלזיוס (פתרוני בקרה unsonicated לPMCA סיבוב השני). להכפיף את השרידים לPMCA סיבוב שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך זה ניתן לחזור ללא הגבלה זמן. במעבדה שלנו, אנחנובצע עד 15 סיבובי PMCA, עם מאפייני הזן שנותרו ללא שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PK לעכל את הדגימות. לWB טיפוסי, לערבב 5 μl של קי μl 80 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​עד 5 מתוך מדגם (פתרון זה יהיה ריכוז PK סופי של 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. הוסף 10 μl של חיץ טעינת ג&#39;ל. פתרון זה מרתיח למשך 10 דקות. בואו הפתרון להתקרר ולטעון 10 μl לג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את ההצלחה של הגברה לבצע ניתוח WB על דגימות PK-מתעכלים להעריך את הכמות המוגברת PRP Sc ידי ההשוואה לאחד, פקדי unsonicated 20,21 תרשים 2, לוח C או לסכומים ידועים של PK-מעוכלים רקומביננטי PRP. </li></ol> 5. הימנעות מזיהום צולב שלבים קריטיים יש לנקוט כדי למזער את הזיהום צולב ואת המופע של תוצאות חיוביות שגויות עקב דה נובו היווצרות של מוצרים עמידים פרוטאז. </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בערכה ייעודית של כלי נתיחה (כלומר מלקחיים, פינצטה, מספריים) לאיסוף דגימה לכל זן פריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מאחד מוחות נגועים כדי לשמש כמצע PMCA, נגב את pipettes באקונומיקת 1%. משרה המדף של sonicator PCR הצינור, homogenizers רקמות, ומדפי אחסון צינור PCR באקונומיקת 1% למשך 10 דקות ולשטוף היטב במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את אזור העבודה עם שתיין Versi-יבשת מעבדת טריה בכל פעם מדגם חדש הוא להיות homogenized, ניסוי PMCA חדש הוא להיות מוכן, או כאשר aliquoting בין סיבובי sPMCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפפות בכל פעם חדשות דגימות חדשות מטופלות (במיוחד בעת העברת aliquots בין סיבובי sPMCA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פרצי sonication קצרים לכל מחזור PMCA. המחזורים של sonication 5 שניות בשילוב עם דגירת 10 דקות מספיקים כדי להגביר פריונים מבלי ליצור דה נובו PRP Sc 1,20,21,23,24. כמעבדות אחרות הראו, הגדלהזמן sonication, הגדלת המשרעת sonication, ולהרחיב את מספר מחזורי PMCA מגדילה את ההסתברות לדה נובו PRP Sc היווצרות 2. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+properties+of+the+prion+protein+from+two+strains+of+the+transmissible+mink+encephalopathy+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent.</a> J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+PrP+properties+suggest+the+molecular+basis+of+strain+variation+in+transmissible+mink+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy.</a> J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+biologically+distinct+strains+of+transmissible+mink+encephalopathy+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters.</a> J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).</li>
<li>Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134, 757-768 (2008).</li>
<li>Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+propagation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cell-free propagation of prion strains.</a> EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).</li>
<li>Caughey, B., Raymond, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie-associated+form+of+PrP+is+made+from+a+cell+surface+precursor+that+is+both+protease-+and+phospholipase-sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive.</a> J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).</li>
<li>Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+native+prions+from+minimal+components+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation of native prions from minimal components in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+different+scrapie+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Competition between different scrapie agents in mice.</a> Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).</li>
<li>Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+prions+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious prions in urine.</a> FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).</li>
<li>Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high+fidelity+prion+amplification+within+and+across+prion+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers.</a> PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אתגרים של חלבוני פריונים זיהומיות הגברה הם תקופות ארוכות דגירה וההוצאות של בניסויי vivo. טכניקת PMCA היא אמצעי חסכוני לסוכנים להגביר את פריון זיהומיות. מספר מעבדות שאשרו את היכולת של PMCA במדויק כדי להגביר זני פריון במבחנה 7, 9, 12, 14, 19,24. מחלות פריונים יכולות להיות מועברת בין מינים. Bessen ומארש שחסנו את האוגרים ביעילות עם אנצפלופתיה מינק המסירה, שהפיקה שני זנים המופקים מאוגר פרי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב / ציוד </td><td> יצרן </td><td> חתול. מספר </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> מטחנות רקמות Tenbroeck </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab אמבטית EX-7 מים </td><td> Thermo Electron </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> 0.2 רצועות Tube PCR מ&quot;ל </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T9284-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מעכב פרוטאז מלא </td><td> רוש </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT בייקר </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt ייקר Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Soakers המעבדה Versi-יבש </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> מחמם Repti Therm </td><td> גן החיות של מד מעבדות, Inc </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

פריונים הם גורמים מזהמים שגורמים ספג המוח המסיר תמיד הקטלני (TSE) בחיות ובני אדם 9,18. חלבון הפריון יש שני isoforms השונה, חלבון שאינו מדבק מארח בקידוד (PRP C) וחלבון המדבק (PRP Sc), איזופורם חריג מקופל של PRP C 8. אחד האתגרים של עבודה עם סוכני פריונים הוא תקופת הדגירה הארוכה לפני התפתחות סימנים קליניים לאחר חיסון מארח 13. זה מנדט מסורתי מחקרי אסיי לבעלי חיים ארוכים ויקרים. יתר על כן, את התכונות הביוכימיות וbiophysical של PRP Sc מאופיינות גרוע עקב מצבי הצבירה קונפורמציה ויוצאת הדופן שלהם. PRP Sc יכול לזרוע את ההמרה של PRP C כדי PRP Sc במבחנה 14. PMCA היא טכניקה במבחנה שלוקחת אדוהntage של יכולת זו באמצעות מחזורי sonication ודגירה כדי לייצר כמויות גדולות של PRP Sc, בקצב מואץ, ממערכת המכילה כמויות עודפות של PRP C וכמויות זעירות של זרע PRP Sc 19. טכניקה זו הוכיחה את היעילות לסכם את הספציפיות מינים וזן של PRP Sc המרה מPRP C, לחקות הפרעות מתח פריון, וכדי להגביר את הרמות נמוכות מאוד של PRP Sc מרקמות נגועות, נוזלים, ודגימות סביבתיות 6,7,16, 23. פרטי נייר זה פרוטוקול PMCA, כולל המלצות לצמצום זיהום, שהניב תוצאות עקביות, וכימות תוצאות אלה. גם אנחנו דנים כמה יישומי PMCA, כולל דור ואפיון של זני זיהומיות פריון, הפרעות מתח פריון, וזיהוי של פריונים בסביבה.

הגברה מחזורית misfolding חלבון (PMCA) משמשת כדי להגביר PRP Sc במבחנת 7, 12, 14, 19, 24. הגברת Sc PRP מוצלחת מוצגת על ידי עלייה בעוצמת להקה על כתמים מערביים של חלבון פריון קי העמיד (נודד בין 19 ו 30 kDa לזני פריוני אוגר-derived) כפי שמוצג באיור 3. העלייה בעוצמת הלהקה שלה לאחר PMCA מציין הגברה של חומר Sc PRP קי העמיד. הגברה מוצלחת של החלבון המופק מאוגר הפריונים, HaCWD וד.י. TME, מוצגת בניתוח WB של איור 3</...

ההגברה מחזורית misfolding חלבון (PMCA) היא assay במבחנה לחקר גיור פריון ומחסומי מתח ומינים. זה גם יכול לשמש כבדיקת גילוי פריונים.

פריונים הם גורמים זיהומיים הגורמים לאנצפלופתיה ספונגיופורמית מדבקת (TSE), מחלה קטלנית שאין ממנה מנוס, בבעלי חיים ובבני אדם9,18. חלבון הפריון...

מטרתו של הליך זה היא להגביר בהצלחה במבחנה (in vitro) זני PreOn שהותאמו להמסטר. דבר זה מושג תחילה על ידי הומוגניזציה של מוח המסטר לא נגוע שישמש כתשתית, ולאחר מכן הכנת הרקמה הנגועה שתשמש כזרע. השלב השני הוא ערבוב התשתית והזרע באنبובות PCR, ולאחר מכן ביצוע הגברה מחזורית של קיפול שגוי של חלבונים (PMCA) באמצעות מחזורי סוניקציה ואינקובציה.בשלב הבא, מדללים את החומר שהועשר עם מצע טרי ומבצעים הגברה סדרתית in vitro, ולאחר מכן מבצעים PMCA. לבסוף, מעכלים את הדגימות באמצעות proteinase K ולאחר מכן מנתחים אותן ב-western blot. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בעלייה בעוצמת הפס ב-western blot כדי לקבוע את מידת ההגברה in vitro של זן הפריון.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ה-PreOn, כגון מהם הקו-פקטורים החשובים המעורבים בהגברת PreOn? באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקושי בפרטים קטנים אך חשובים הנוגעים לטכניקה, וכן במניעת זיהום צולב של הדגימות. לפני ביצוע ההומוגניזציה, נגבו את הפיפטות ב-1%bleach, והספיגו גם את מעמדי מבחנות ה-PCR לסוניקציה, את ההומוגניזטורים של רקמות ואת מעמדי אחסון מבחנות ה-PCR ב-bleach.לאחר 10 דקות, שטפו היטב כל פיסת ציוד במים מזוקקים ולאחר מכן כסו את אזור העבודה ב-Verly dry lab Soaker חדש. כעת השתמשו ב-10 buric tissue grinder ובבופר המרה קר שהוכן זה עתה כדי להומוגניзировать מוח של המסטר לא נגוע לתמיסה בריכוז של 10% משקל לנפח. השתמשו ב-PMCA substrate solution, ואז העבירו את ההומוגנאט למבחנות קוניות של 15 מיליליטר ובצעו הבהרה (clarification) של התמיסה ההומוגנית באמצעות סבוב בצנטריפוגה במהירות של 500 ×g למשך 30 שניות.בשלב הבא, תוך הקפדה להימנע ממנת המשקע הגדולה, העבירו את הנוזל שהתקבל למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי להכין את תמיסת הזרע ל-PMCA, הומוגניזרו חומר זיהומי שנאסף לתמיסה של 10% משקל לנפח כפי שהודגם כעת, אך השתמשו ב-DPBS (תמיסת סליין חוצבת פוספט) במקום בבופר המרה, ולאחר מכן חלקו את התמיסה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 0.6 מיליליטר. לפני תחילת הליך ההגברה, כסו את אזור העבודה בנייר ספיגה למעבדה נקי ויבש; העבירו את תת-המצע של ה-PMCA לרצועת מבחנות PCR דקות-דופן של 200 מיקרוליטר ודללו לתוכה את זרע ה-PMCA ביחס של 1:20, והניחו סה"כ ארבעה שיכורים במבחנות המסומנות באדום.העבירו שתי כפילויות של מנה של 15 µL מכל דגימה לשפופרות PCR המסומנות בכחול, לשימוש כביקורת לא מושבעה ב-80°C- . העבירו שתי כפילויות נוספות של מנה של 15 µL מכל דגימה לשפופרות PCR לאחסון ב-37°C כביקורת לא מושבעה נוספת. לאחר מכן, הניחו את הביקורות הלא מושבעות ב-80°C- במקפיא של 80°C- ואת הביקורות הלא מושבעות האחרות באינקובטור של 37°C למשך משך תגובת ה-PMCA.כעת התחילו את סבב הגברת ה-PMCA הראשון על ידי הנחת רצועת מבחנות ה-PCR המכילה את 70 µL הנותרים מכל דגימה בתוך מכשיר סוניקציה המחובר לאמבט מים עם סירקולציה המכוון לטמפרטורה קבועה של 37 °C. ניתן לכלול מבחנת PCR המכילה תשת PMCA בלבד כביקורת דמה (mock control) כדי לבדוק זיהום צולב. מלאו לא יותר מ-30% מקיבולת המבחנות של הסוניקטור על ידי פיזור מבחנות ה-PCR לאורך קרן המיקרו-פלטה. השאירו לפחות שורה אחת של רווח ריק בין רצועות מבחנות ה-PCR, ואל תחברו יותר מארבע מבחנות יחד בכל רצועה.ההגברה של P-R-P-S-C משתנה לאורך קרן המיקרופלייט. יעילות ההגברה הטובה ביותר של P-R-P-S-C מתקבלת ברדיוס של חמישה סנטימטרים ממרכז קרן המיקרופלייט. סבב אחד של PMCA מורכב מ-144 מחזורים, כאשר בכל מחזור מתבצעים חמישה שניות של סוניקציה ו-10 דקות של אינקובציה, למשך כ-24 שעות לכל סבב PMCA; במהלך הסוניקציה, יש לכוונן את האמפליטודה כך שהספק המוצא יהיה בטווח של 155 עד 170 watts.הניחו פד חימום לאקווריום על מכסה הסוניקטור כדי למנוע התעבות של מים, שעלולה להוביל לזיהום צולב של הדגימות. נערו את המבחנות בכל חמש שעות כדי למנוע התעבות של מים על המכסים כיפתית של מבחנות ה-PCR לאחר סיום הסבב. הוציאו את רצועת המבחנות מהרוטור וסובבו אותן בנסיבוב (spin down) כדי לרכז את הדגימות בתחתית.לאחר מכן, ערבבו בעדינות את המבחנות ב-vortex, תוך שמירה על התמיסה הרחק מהפקק כדי למנוע זיהום בעת פתיחת הפקקים, ובכך לצמצם עוד יותר את הסיכון לזיהום בעת פתיחת המבחנות. הימנעו מנגיעה בשפה והניחו את הפקק על מגבון Kim נקי. לאחר מכן, עבור PMCA סריאלי של זן ה-PreOn, העבירו 5 µL מהדגימה שעברה סוניקציה לתוך 95 µL של מצע PMCA טרי.השתמשו בכפפות חדשות עבור כל דגימה. לאחר מכן, הסירו שתי מנות של 15 µL מכל אחת מהדגימות שעברו סוניקציה, ואחסנו מנה אחת ב-80°C- ואת המנה השנייה ב-37°C. עבור תמיסות הביקורת שלא עברו סוניקציה לסבב השני של PMCA, העבירו את השאריות לסבב PMCA שני כפי שהודגם כעת.ניתן לחזור על שלב זה מספר הפעמים הרצוי. ניתן לכלול מבחנת PCR המכילה תסבסב (substrate) PMCA של מוח לא נגוע בלבד כדי לבדוק זיהום צולב; לאחר ביצוע סוניקציה לדגימות למספר הסבבים הרצוי, ערבבו 5 µL של proteinase K בריכוז 18 µg/mL עם 5 µL של הדגימה שעברה סוניקציה, עם בקרת ה-80°C- ועם בקרת ה-37°C במבחנות PCR נפרדות, ועזרו את הדגימה ב-37°C למשך שעה אחת.לאחר מכן, יש להוסיף 10 µL של באפר טעינה לג'ל לדגימה שעברה עיכול ולהרתיח את התמיסה למשך 10 דקות. לאחר קירור, טענו 10 µL מתערובת הדגימה ובאפר הטעינה לג'ל על ג'ל Western block. כדי לקבוע את כמות ה-P-R-P-S-C שהועשיר, השוו את כמות הדגימה שעברה עיכול באמצעות Proteinase K ב-Western blot לבקרות שלא עברו עיכול או לכמויות ידועות של Proteinase.חלבון רקומביננטי לא שעוכר על ידי Proteinase K. נעשה שימוש ב-P-R-P-C-P-M-C-A כדי להגביר את P-R-P-S-C in vitro; ניתן לראות הגברה מוצלחת של חלבון PreOn שהותאם להמסטרים, CWD של המסטרים ו-TME של "drowsy" בניתוח Western blot זה על ידי השוואת עוצמות הפסים לפני ואחרי PMCA. עיכול של P-R-P-S-C על ידי proteinase K, ולאחריו ניתוח Western blot, מראה פס עליון, אמצעי ותחתון המתאימים לחלבון פריון diglycosylated, monoglycosylated ובלתי גליקוזילד בהתאמה. ניתן להבדיל בין כמה זני PreOn על פי הניידות האלקטרופורטית שלהם.לדוגמה, קיים הפרש של שני kilodalton בנידוד בין זני CWD של אוגר לבין זני TME PreOn של drowsy. הגברה בעלת נאמנות גבוהה זו נצפית על ידי נידוד אלקטרופורטי דומה של זן CWD של אוגר שהוגבר באמצעות PMCA בהשוואה לזרע CWD תואם של אוגר, וכן עבור זן TME drowsy בהשוואה לזרע TME drowsy שלו. במידה ולא מתרחשת זיהום צלבי או היווצרות de novo של P-R-P-S-C, בניתוח Western blot, דגימות PMCA של בקרת OFM צריכות להישאר נקיות לאחר עיכול באמצעות proteinase k.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקות כל פיסת ציוד לפני השימוש בדגימה חדשה, וזאת כדי למנוע זיהום צולב.

protein-misfolding-cyclic-amplification-of-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה...

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

לדגור עם אנזים פרוטאוליטי כדי לעכל את הפריונים הרגילים, ולהשאיר את האגרגטים העמידים שלמים.

זיהוי צברי חלבון פריון מקופלים שלא כהלכה ברקמת מוח עכבר באמצעות כתם מערבי

סרטון זה מתאר בדיקת פירוק עבור חלבונים שאינם מקופלים כהלכה באמצעות טיפול cycloheximide יחד עם שבר דטרגנט. שיטה זו מסייעת בחקר הדינמיקה של חלבונים שאינם מקופלים כהלכה ובחשיפת המנגנונים המעמיקים של תחלופת החלבונים.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

דוח זה מתאר פרוטוקולים למדידת שיעורי פירוק של חלבונים לא מקופלים על ידי כתם מערבי או מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות. ניתן ליישם את השיטות לניתוח של חלבונים אחרים שקופלו בצורה לא נכונה ולסינון תפוקה גבוהה.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה פריון הגברה, השיטה בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר).

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

לצבירת ראיות תומך ברעיון כי אגרגטים חלבון פתוגניים המשויך מחלות ניווניות להפיץ בין תאים עם תכונות כמו פריון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת ויזואליזציה בהפצת לתא של פריון כמו אגרגטים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה.

ניטור-לתא שידור של אגרגטים חלבון פריאון-כמו בדרוזופילה Melanogaster

יש אוכלי נבלות פוטנציאל translocate פריונים ספגו מוח העברה זיהומיות בצואה שלהם לאזורים ללא מחלה. שלנו שיטות פירוט משמשות כדי לקבוע אם פריונים מרוסקים מותאמים עכבר יישארו זיהומיות לאחר מעבר למרות שמערכת העיכול של עורבים אמריקאים (brachyrhynchos Corvus), הצריכה נפוצה של בעלי חיים מתים.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

חקור את שיטת PMCA להגברת חלבוני פריון מקופלים לא נכון בתרבית. למד כיצד לבצע מחזורי סוניקציה וחימום כדי לחקור מנגנוני המרה ומחסומי מינים בביולוגיית פריון.

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

גלה סרטונים נוספים