דוגמנות סרטן קוליטיס-Associated עם Azoxymethane (AOM) ונתרן סולפט dextran (DSS)

ביום אפס, מזריקים למייסר azoxymethane או OM בשבוע הבא. מי שתייתם מוחלף בתמיסה המכילה dextran sulfate sodium או DSS. בשבוע השלישי, העכברים מקבלים מים למשך השבועיים הבאים.

מחזור מים זה עם DSS חוזר על עצמו פעמיים נוספות. לאחר מחזור ה-DSS השני, ניתן לבחון את העכברים לאיתור גידולים באמצעות אנדוסקופיה במראה.

לאחר שבוע 10, העכברים מושמדים והמעיים הגסים נאספים. המעיים הגסים נשטפים ונפתחים לאורכם. המעיים הגסים נבדקים לצורך הערכת גודל הגידול ומספר הגידולים.

ניתן להטמיע ולהגיש לבדיקה היסטולוגית חתךlongitudinal של המעי הגס המחולק לשלישים. באמצעות מיקרוסקופיה של אור ניתן לספור ולסווג גידולים. אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן החומר הגנוטוקסי OM, ולאחריו שלושה מחזורים של החומר הפרו-דלקתי.

DSS גורם להיווצרות מהירה ועקבית של גידולי מעי גס בעכברים, בעלי דמיון מורפולוגי ומולקולרי לאלו הנראים בסרטן המעי הגס הקשור לקוליטיס בבני אדם. יש לסמן כל עכבר בנפרד באמצעות סימון זנב או תג אוזן ביום אפס, לרשום בטבלה את משקל הבסיס של כל עכבר, ולאחר מכן להזריק לכל עכבר תמיסה של 10 milligram per kilogram של OM exercise. יש לנהוג בזהירות בעת טיפול ב-OM שכן זהו חומר גנוטוקסי. ביום השביעי, יש לספק לעכברים תמיסת 2.5% DSS כמי שתייה לשבוע הבא. להכנת תמיסה זו, יש להוסיף אבקת DSS למים מזוקקים ולערבב עד להמסה מלאה.

התמיסה מוכנה לאחר סינונה דרך מסנן אצטט צלולוז של 0.2 micron. כדי לספק אספקה רציפה של תמיססת DSS למשך שבעה ימים, יש להחליף את ה-DSS כל יומיים עד שלושה ימים.

לאחר תקופה זו, העבירו את הכלובים בחזרה למים למשך שבועיים. שקלו את העכברים פעמיים עד שלוש בשבוע והשגיחו אם מופיעים דימומים רקטליים ושלשולים. עכברים עם גידולים גדולים עשויים לפתח זמנית בלט רקטלי, אם כי בדרך כלל הדבר אינו מפחית את אחוז ההישרדות.

ירידה במשקל ביחס לקו הבסיס משמשת כמדד עקיף לחומרת הקוליטיס. ניתן לצפות לירידה במשקל של עד 10% לצד שלשאלים ודימומים רקטליים במשך יומיים עד שלושה ימים בשבוע שלאחר מחזור מלא של DSS endoscopy. ניתן לבצע מחזור שני או שלישי של DSS כדי לאשר צמיחת גידול in vivo לפני ההקרבה.

היות ומודל A-O-M-D-S-S הוא אמין למדי ביצירת גידולים, שלב זה בדרך כלל אינו נחוץ. רק מספר מצומצם של עכברים צריך להיבדק בשיטה זו, שכן היא עלולה להוביל להפרעה של גידולי העכברים. אזור העבודה שלך צריך לכלול כלי זכוכית עם תמיסת פוספט סליין מאובפנת סטרילית או PBS, וכן כלי זכוכית ריק.

כדי להוציא PBS משומש, שאבו 8 עד 10 מיליליטר של PBS לתוך מזרק וחברו אותו לאנדוסקופ לאחר כל שימוש. לשטיפת תכנים תוך-לומנליים, הרדימו כל עכבר באמצעות הרדמה בשאיפה או בהזרקה, והדביקו את העכבר ללוח שטוח בעזרת סרט הדבקה בזנב ובחזה; ניתן למחוץ את כריות כפות הרגליים של העכבר. כדי להבטיח הרדמה נאותה, השתמשו באגודל ובאצבע המורה כדי למחוץ את הבטן התחתונה של העכבר כדי לחשוף את פיסו, והחדירו את האנדוסקופ של המורן לרקטום של העכבר.

השתמשו בעדינות ב-PBS לנפח ולהשקות כדי לשפר את התצפית התוך-לומנלית ולהסיר תכני צואה. המשיכו להחדיר את האנדוסקופ לאט תוך כדי צפייה במסך. עבור נוכחות של גידולים גסים ביום 70, כל עכבר שטופל ב-A-O-M-D-S-S אמור לשאת מספר גידולי מעי גס ולהיות מוכן להערכה.

ניתן לדחות שלב זה בשבועות עד חודשים אם מעוניינים בגידולים גדולים יותר. הכינו מזרק מלא ב-PBS המחובר למחט גavage. מזרק טעון ב-10% formalin, מספריים כירורגיים בסיסיים ומספריים עם קצוות מעוגלים.

מזרק קטן טעון בתמיסת Ian Blue בריכוז 1% ופינצטה עדינה. כמו כן, יש להכין מגש קירור, סירה (boat) המכילה PBSA מקורר, תער חדש לחיתוך ואגן קיבוע מלא בפורמלין 10%. יש להקרין כל עכבר באמצעות איזופלורן ופריקה צווארית או בשיטה אחרת המאושרת על ידי המוסד. ניתן לבצע מדידת משקל סופית ומדידות נוספות.

בשלב זה, הנח את העכבר על לוח חיתוך כאשר צדו הבטני חשוף. רסס את הבטן ב-70% ethanol כדי לשמור על אזור הניתוח נקי מפשערות. השתמש בפינצטה כדי לתפוס את קו האמצע של הבטן ובצע חתך קטן דרך העור כדי לחשוף את הפריטונאום.

הפעיל מתיחה עדינה כדי להפריד את העור מהפריטונאום ולחשוף את כל חלל הבטן. בצע חתך בפריטונאום והרחב אותו לאורך השוליים הצלעיים משני הצדדים. השתמש במספריים סגורים כדי להסיט את המעי הדק והמעי הגס הצידה.

פעולה זו תחשוף את קשרי הלימפה המזנטריים, אותם ניתן לאסוף באופן רשות. לצורך הערכה, הזיזו את דרכי השתן והמין כלפי מטה כדי לחשוף את המעי הגס היורד ואת הרקטום, וכריתו את השלפוחית והאיברים הרבייתיים במידת הצורך כדי לחשוף עוד יותר את האגן. יש להקפיד לא לפגוע ברקמות סמוכות.

חתכו את הענפים העשתיים התחתונים והעליונים כדי לחשוף את החיבור בין פישרית המעי הגס למעי הרקטום. חתכו את העור מסביב לחיבור בין פישרית המעי הגס למעי הרקטום כדי לשחרר את המעי הגס, תוך הפעלת מתיחה עדינה כלפי מעלה. בעזרת פינצטה מזנטרית, ניתן להסיר או להפריד את ההיצמדויות של המעי הגס.

חשוב לשמר חלק מהעור בחיבור שבין פיג המעי הרחב לרקטום, כיוון ששטח זה מושפע לעיתים קרובות מדיספלזיה. בצעו חיתוך של המעי הגס מהמעי הדק, מימין (פרוקסימלי) לערום (cecum). הפרידו את הערום מהמעי הגס הסמוך באמצעות מחט גavage בקוטר 18 gauge המחוברת למזרק של חמישה מיליליטר.

שטפו את המעי הגס ב-PBS קר מאוד כך שהנוזל ייצא בכיוון הפיזיולוגי, באמצעות מספריים בעלי קצוות מעוגלים. פתחו את המעי הגס לאורך המזנטרה שלו. הניחו את המעי הגס הפתוח על המגש הקר.

וודאו שהמגש הופשר מספיק כדי למנוע הקפאה של הרקמה. מרחו מספר טיפות של 1% Ian Blue בעזרת אצבע כדי לשפר את הנראות של הגידולים. העריכו את מספר הגידולים ואת גודלם באמצעות סרגל או צלמו תמונות לצורך ניתוח דיגיטלי.

בשלב זה ניתן להוציא חיתוכים קטנים של הגומלור בשילוב עם רקמה נורמלית סמוכה לצורך ניתוחים עתידיים בשיטות של RNA, חלבון או אימונוהיסטוכימיה, תוך השארת חלק מהמעי הגס להערכה היסטולוגית. יש להחליק 10% formal למעי הגס שנותר על מגש הקירור באמצעות מזרק או אצבע, ולהמתין לפחות 30 שניות לקיבוע הרקמה. באופן זה, תתבצע העברה קלה יותר לאגן הקיבוע.

יש לוודא ששאריות של פורמלין נגובו לפני צביעת מעי גס פתוח חדש באותה תבנית. העבירו את המעי הגס לאגן מלא ב-10% formalin וקבעו את קצותיו בעזרת סיכות. לאחר שלוש שעות של קיבוע, השליכו את ה-formin והחליפו אותו ב-70% ethanol.

ניתן לשמר מעיים הגדילים ב-70% ethanol למשך זמן בלתי מוגבל. השתמשו בחום נמוך להכנת תמיסה של 2% agar והניחו זכוכית למסחרה נקייה על פלטה מזכוכית. חתכו את המעי הגדיל המקובע לשלושה חלקים והחזירו את החלקים שאינם בשימוש לאגן ה-ethanol.

קצצ את חלקי המעי הגס לגודל אחיד באמצעות שני תערים. הטמע את חלקי המעי הגס והשכבות באגאר על שקף נקי. חזור על תהליך זה עבור המעי הגס הבא.

בצעו חיתוך של הסגמנט, הסירו עודפי אגר, והניחו את המעי הגס המוטמע בתוך קסטה לצורך עיבוד וצביעה ב-hematin and eoin. איור 1 מפרט את הפרוטוקול להשראת סרטן הקשור לקוליטיס. איור 2 מציג את משקל העכבר ביחס למשקל הבסיס במהלך מתן OM ו-DSS.

שימו לב שבשבוע שלאחר כל מחזור DSS, העכברים מאבדים בין 5% ל-10% ממשקל גופם. ירידה במשקל בניסוי זה מהווה מדד עקיף לחומרת הקוליטיס. איור 3 מציג תצפית על גידולים במעי הגס המרוחק באמצעות אנדוסקופיה לעכברים ביום ה-50 של הטיפול ב-A-O-M-D-S-S.

שימו לב למסות הפוליפואידיות המרובות החוסמות את לומן המעי הגס הדיסטלי בלוחות B ו-C, בהשוואה למעי גס תקין. בלוח a של איור 4 מוצג מעי גס של עכבר שנפתח לאורכו, הממחיש את המראה הגס של הגידולים. שימו לב לעומס הגידולי הגבוה יותר במעי הגס הדיסטלי ולמרקם המאפיין של המעי הגס הפרוקסימלי עם צמיחה גידולית מועטה.

איור חמש מציג גידולים המודגשים באמצעות יישום של lc וצבע כחול. שימו לב כיצבע מדגיש את המרקם הרגיל של המעי הגס וכן את גבולות כל גידול בנפרד. צביעה כזו עשויה לסייע במדידה מדויקת של שטחי הגידולים באמצעות סרגל או מדידה דיגיטלית.

איור שש מציג את ההתפלגות המייצגת של מספר הגידולים הממוצע לכל עכבר שטופל ב-OM ו-DSS. שימו לב כי מרבית הגידולים ממוקמים במעי הגס הדיסטלי וגודלם פחות משני מילימטרים. איור שבע מציג חתכים אורכיים של מעי גס שהטמעו בפרפין בתוך קסטה ושקופית צבועה ב-h and E.

שימו לב ששאריות של S וצבע כחול אינן מפריעות לצביעת h and e. גידול גדול מסומן במעגל בתמונת השريחה. הסימונים distal, middle ו-proximal נובעים מחלוקת המעי הגס כולו לשלישים בין העיוור (cecum) לפיחיס.

איור שמונה מציג היסטולוגיה מייצגת של גידול שנוצר כתוצאה ממתן OM ו-DSS במעי הגס המרוחק. הפוטומיקרוגרפים המוצגים נצבעו ב-H ו-E-B-R-D-U ובבטא-קטנין (beta-catenin), והם מדגימים שינויים דיספלסטיים הדומים לאדנוקרצינומות של מעי הגס בבני אדם. בסרטון זה, הדגמנו פרוטוקול לתסבכת קרצינוגנית של המעי הגס המונעת מדלקת בעכברים, תוך שימוש בהזרקה בודדת של OM ולאחריה שלושה מחזורים של שבעה ימים של DSS.

במהלך תקופה של 10 שבועות, מודל זה משרה גידולים עם שינויים היסטולוגיים ומולקולריים הדומים מאוד לאלו המתרחשים בסרטן המעי הגס הקשור לקוליטיס בבני אדם, ומספק מודל בעל ערך רב לחקר האונקוגנזה ומניעה כימית של מחלה זו.