רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית

מחקר זה של פפטידי הרוק משתמש בגשש אולטרה-פילטרציה דמוי סוכרייה על מקל (lollipop), ולאחריו ניתוח ישיר באמצעות nano LC LT Q mass spectrometry. ראשית, הרכיבו את גשש ה-LLUF באמצעות ממבנאת polyether וצינור ethylene propylene. לאחר מכן, אספו דגימות רוק ממתנדבים ועבדו אותן דרך גשש ה-LLUF כדי לדגום את הרוק.

לאחר מכן, עברו ישירות למספקטרומטריית מסות nano L-C-L-T-Q ונתחו את הנתונים מדגימות רוק עם ובלי טיפול בProbe LLUF. בסופו של דבר, ניתן להפיק את הפפטיד מהרוק על ידי ניתוח נתוני L-C-M-S-S והשוואת הפפטידים שזוהו בין שתי הדגימות. גישה זו, המשתמשת בProbe לסינון אולטרה דמוי סוכרייה על מקל המשולב עם ניתוח מספקטרומטריית מסות nano LC LTQ ישירה, מציעה יתרונות מרכזיים על פני שיטות אחרות, כגון עיכול חלבון הרוק לפפטידים.

בעקבות ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות, ה-LUF PRO מפשט ומנקה את הרוק וכן משפר את זיהוי הפפטידים ברוק שלם עבור יישום קליני. השתמשו בדבק אפוקסי כדי לאטום את ממברנות הפוליאתר על גבי השוליים של משטי הפוליפרופילן המשולשים. לאחר מכן, חברו צינור Teflon fluorinated ethylene propylene ליציאת הגליל של המשולש.

יש לעקר את הגששים של משוט הפוליפרופילן באמצעות 70% alcohol למשך לילה. כדי להעריך את תקינות האיטום, יש לטבול את גששי ה-LLUF בפתרון Blue dextran בריכוז 50 mg/mL למשך שעתיים. יש לוודא את היעדר ה-Blue dextran בדגימות שנאספו.

גייסו מתנדבים בריאים בגילאי 20 עד 40. לאחר שטיפת הפה במים, בקשו מהנבדק לירוק דגימות של רוק שלם לתוך כלי מקורר על קרח. איספו את כל הדגימות יחד ואחסנו אותן על קרח.

מיד לאחר האיסוף, עברו לחדר בטמפרטורה של 4 °C עם 200 µL רוק לצורך דגימה באמצעות גששים מסוג LLUF. כעת, השרו את ממבנה הפוליאתר בתרבית של רוק אנושי בתוך צלחת תרבית. צרו לחץ שלילי על ידי משיכה במזרק כדי לדמות תהליך של אולטרה-פילטרציה עבור הדגימה מתוך הרוק.

בשלב הבא, קבעו את ריכוזי החלבון. הכינו דגימות של חלבון רוק בריכוז של one microgram per microliter לצורך אנליזה באמצעות nano lc mass spectrometry. לצורך אנליזה של הדגימות, אנו משתמשים ב-exigent nano lc המחובר באופן מקוון למספקטרומטר מסות Finnegan LTQ. ראשית, טענו five microliters של דגימות רוק שלא עברו עיכול לעמודת הלכידה (trap column) של מערכת ה-nano lc באמצעות הדוגם האוטומטי (auto sampler).

לאחר שלב שטיפה, העבר את השסתום והזרם גרדיאנט ליניארי של 0% עד 50% של בופר B למלכודת ולעמודת ההפרדה C 18. באמצעות מצב ה-data dependent של Excalibur, אסוף ספקטרא של ms ms עבור ארבעת יוני ה-MS החזקים ביותר שמעל עוצמה של 1×10⁴. עבור כל דגימה, בצע הרצות כפולות של שלוש הכנות נפרדות ושונות.

לאחר מכן, ייבא את קובץ הנתונים למערכת sequester sorcerer two ובחר בחיפוש מול מאגר חלבונים אנושי מתאים של NCBI תוך שימוש ב-non enzyme specificity. לאחר החיפוש ב-sequester, התוצאות מסוננות, מאומתות ומוצגות באופן אוטומטי ב-peptide profit וב-protein profit על בסיס תוצאות ה-sequester. ה-Peptide profit מעריך ציון הסתברות P מקיף לכך ששיוך הפפטיד הוא נכון לעומת שגוי, ומזהה גם מידע נוסף על כל רצף פפטידי.

Protein profit מחשב ציון הסתברות מאפס עד אחד עבור כל חלבון על בסיס פפטידים שהוקצו לספקטרום Ms.Ms. חלק זה קובע את היכולת של גששים מסוג LLUF להסיר חיידקים מהפה לצורך תרבית זיהוי חיידקית, כאשר דגימות הרוק נלקחות לפני ואחרי איסוף באמצעות גשש LLUF על צלחות אגר לבדיקת חיידקים אירוביים. השתמש בצלחות LB אגר ללא אנטיביוטיקה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך יום אחד, ועבור חיידקים אנאירוביים, השתמש ב-gas pack לתרבית.

את הדגימה זרעו על מצע bru broth ועל צלחות auger בתנאים אנאירוביים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך יום אחד. ייצורם של התקני אולטרה-פילטרציה דמויי סוכרייה על מקל (lollipop) מקל על דגימת רוק בסביבה פהית מדומית. במערכת זו, ממברנת polyether בעלת מטען שלילי עם סף משקל מולקולרי של 30 kilodaltons מודבקת למחבט polypropylene וממוקמת לפני גשושית ה-LLUF כדי לסנן חלבונים גדולים יותר ברוק.

על מנת לחקות את הסביבה הפהית האנושית, ספיגה נספגת ברוק באמצעות מזרק. הרוק מסונן ונאסף דרך הצינור המחובר. השוואה בין כרומטוגרמות lc של הרוק לפני ואחרי דגימת LLUF הובילה לזיהוי פפטידים מקומיים ברוק באמצעות ספקטרומטריית מסה nano L-C-L-T-Q.

מאחר שכרומטוגרמות דיפרנציאליות אלו נגזרות ללא עיכול כימי או אנזימטי, הן מפשטות את הכנת הדגימות למטרות קליניות. בדגימה זו, לאחר ביצוע LLUF להבהרה של הרכבי החלבונים השונים, זוהו 131 פפטידים ברוק שלא עבר עיכול.

פפטידים אלו הם מקטעים שנגזרו מחלבונים שונים עשירים בפרולין. Actin alpha amylase alpha one globin beta globin, his sustain one keratin, one mucin seven polymeric immunoglobin receptor serin ו-S 100. 26 פפטידים ייחודיים שזוהו ברוק לאחר סינון באמצעות גששים מסוג LLUF הם מקטעים שנגזרו בעיקר מחלבונים שונים עשירים בפרולין.

פפטיד זה, שנגזר מ-alpha amylase, זוהה באופן בלעדי בדגימת רוק שלא נאספה באמצעות גששי LLUF, דבר המדגים את יכולתם של גששי LLUF להסיר חלבונים גדולים. באופן מסקרן במיוחד, לאחר הסרת חלבונים גדולים יותר, ניתן היה לזהות מספר פפטידי רצף ברוק שנדגם באמצעות גשש LLUF; בפרט, פפטידים עם קצבים C rich ב-proline זוהו בדגימות לאחר סינון אולטרה באמצעות גששי LLUF. כעת אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן השימוש ב-A-L-L-L-L-U-F PRO עבור דגימות רוק פשוטות לצורך אנליזת מסה.

ניתוח משופר הוא חשוב מאוד לאיסוף פשוט של רוק תחת תנאים עקביים. ברגע שהטכניקה תהפוך לשולטת, אני מאמין שניתן יהיה לבצעה כראוי בתוך שלוש שעות. גישה זו של גשושית אולטרה-פילטרציה דמוית סוכריה על מקל, המשולבת עם ניתוח ישיר ב-nano L-C-L-T-Q-M-S, spectrum chain, מקלה על יישומים קליניים של סממנים ביולוגיים לאבחון מחלות בבני אדם.