Name: טיהור vacuoles הפתוגן מ הלגיונלה נגועים phagocytes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למד שיטה לבידוד vacuoles של Legionella מphagocytes נגועים באמצעות הומוגניזציה, הפרדה אימונו-מגנטית וצנטריפוגה במדרג צפיפות. שיטה זו משפרת את הטוהר לחקר מנגנוני מולקולריים של פתוגניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר במעבדה שלנו נתמך על ידי מקס פון Pettenkofer המכון, לודוויג מקסימיליאן, אוניברסיטת מינכן, קרן המחקר הגרמנית (DFG, HI 1511/3-1) ואת הפרווה Bundesministerium Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Genomics זיהום רפואי&quot; היוזמה ( 0315834C).

1. ההכנות בידוד LCV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס ייצור את הלגיונלה pneumophila DsRed-Express 13,14 ממניות וגליצרול על צלחות אגר CYE עם 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל chloramphenicol (רמ&quot;א) ארבעה ימים לפני בידוד LCV. דגירה של חיידקים על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את זרעי 1 x 10 7 ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin או RAW264.7 מקרופאגים Murine ב 75 התרבות 2 ס&quot;מ רקמות צלוחיות 1 זיהום לפני יום. השתמש 10 מ&quot;ל HL5 בינוני עם 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל G418 של ד discoideum ו דגירה אמבות ב 23 ° C. עבור RAW264.7 מקרופאגים להשתמש 10 מ&quot;ל RPMI 1640 בינוני השלימו עם FCS 10% (חום מומת) ו גלוטמין 1%, ולהגדיל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. השתמש לפחות שלוש צלוחיות 75 2 ס&quot;מ לכל זיהום המדגם (6 מינימום 7 x 10 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבות בין לילה עם ל &#39; pneumophila מהצלחת CYE. קח מבחנה 15 מ&quot;ל עם 3 מ&quot;ל בינוני כןו 5 מיקרוגרם / CAM מ&quot;ל. לחסן עם μl 100 ההשעיה חיידקי להניב OD 600nm של 0.1. דגירה התרבות לילה על ההגה סיבוב מעל הראש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 21-22 שעות. </li></ol> 2. LCV בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום של ד תאים discoideum להסיר את האנטיביוטיקה, אשר יפריע זיהום הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את OD של תרבות לילה. חיידקים צריכים להגיע infectivity לשיאם ב 600nm OD של ≥ 3, אשר תואמים את 2 x 10 9 חיידקים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים על ידי הוספת כ 500 μl של ל &#39; pneumophila התרבות לילה לתאים הגדלים בינוני HL5 10 מ&quot;ל (discoideum ד) או 10 מ&quot;ל RPMI 1640 (מקרופאגים). זה מתאים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 50. לאחר מכן הזיהום מסונכרן על ידי צנטריפוגה של החיידק לתוך התאים ב 500 × ג&#39;10 דקות. צנטריפוגה אחריועל דגירה של ד discoideum תאים במהירות של 25 ° C ואת RAW264.7 מקרופאגים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, בהתאמה. זמן ההדבקה של שעה 1 כוללת את הצעד צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדבקה להסיר בינוני לשטוף את התאים פעם אחת כדי להסיר את החיידקים תאיים. השתמש קר כקרח חיץ Sorc עבור ד discoideum וקרח קר PBS עבור RAW264.7 מקרופאגים. הוסף 3 מ&quot;ל HS חיץ, השלימו עם מעכבי פרוטאז (רוש) על כל בקבוק ולאסוף את התאים באמצעות מגרד התא. בריכת דגימות המתאימים במבחנה 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור homogenization של השימוש מדגם 3 מ&quot;ל פלסטיק Luer-נעל מזרקים פלדה אל חלד הכדור homogenizer. ודא כי אתה עובד על קרח. לפני שמתחילים, לשטוף homogenizer הכדור עם מים מזוקקים, כדי למנוע זיהום חומר ניקוי ולשטוף אותו עם חיץ קר קרח HS להיפטר בועות אוויר. השתמש 8 אישור הכדור מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מ&quot;ל 1 3 לתוך und את המזרק להרכיב אותו על הדואר homogenizer. לחצו על מדגם הלוך ושוב תשע פעמים דרך homogenizer. להחליף את המזרקים לאחר מכן, כדי למנוע זיהום בחומר הלא הומוגני. איסוף ובריכת מדגם הומוגני במבחנה 15 מ&quot;ל ולקחת מדגם 150 μl ניתוח מיקרוסקופי. לפני שתמשיך מדגם שונה לפרק ולשטוף homogenizer הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום homogenate עם CS 2% או FCS למשך 30 דקות על שאכר על הקרח או על גלגל תקורה-ספינינג (10-20 סל&quot;ד) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימת משתמשים נוגדן זיקה-מטוהרים העיקרי נגד SidC (דילול 1:3000) או נגד הסמן כל חיידקי אחר מחייב אך ורק קרום LCV. מערבולת נוגדנים פתרון לפני הוספתו homogenate. דגירה לדוגמה עבור שעות 1 על שאכר על הקרח או על הגלגל מעל הראש, ספינינג (10-20 סל&quot;ד) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, מכינים את שיפוע Histodenz. השתמש מבחנה 15 מ&quot;ל לכל צבע ושלושה 75 ס&quot;מ 2 בקבוקי מדגם 1. אשוחרחוב, להוסיף 5.75 מ&quot;ל של Histodenz 35% ל הצינור, ושנית, בזהירות להוסיף 5.75 מ&quot;ל של תמיסת Histodenz 10% למעלה. לאחר מכן בזהירות להניח את הצינורות לאורך אופקית של 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של homogenate מגיב עם חסימת נוגדן ראשוני, צנטריפוגות ב × 600 גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C עד גלולה המדגם. מחק supernatant ו resuspend גלולה במאגר HS 1.5 מ&quot;ל. להעביר את דגימות צינור טרי 15 מ&quot;ל הבדיקה לקחת דגימה 40 μl ניתוח מיקרוסקופי בהמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה גלולה עם נוגדנים משני - מחשבי Mac נגד ארנב עיזים IgG חרוזים Micro (דילול 01:25) - למשך 30 דקות על שאכר ב 4 ° C. בינתיים, לשים את העמודות על בעל MACS מגנטי לאזן אותם עם מאגר 0.5 HS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, החל את דגימות לעמודה. איסוף 150 μl של זרימה באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לאחר מכן. לשטוף את הטור שלוש פעמים עם חיץ 0.5 HS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודות מ tהוא מגנט eluate את LCVs עם חיץ 0.5 HS מ&quot;ל של גמירה מיידית. קח לדוגמה 20 μl לניתוח מיקרוסקופיים. שלב טיהור על ידי הפרדה חיסונית מגנטי צפוי להניב ל 1 × 10 7 נגוע ד discoideum תאים כ -1 × 10 6 LCVs שלמים, אשר על פי שבעה מועשר ב eluate לעומת זרימה עד 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צינורות מעבר צבע Histodenz בחזרה למצב אנכי ובזהירות לטעון eluate למעלה. בצנטריפוגה צינורות ב 3350 × g עבור שעות 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה לקחת 1.5 מ&quot;ל שברים החל מהחלק התחתון של המבחנה באמצעות ארוכה זכוכית פיפטה פסטר. בסך הכל שמונה לאסוף שברים, כל אחד מהחלק התחתון של הצינור. שכבות לא נראים לעין נצפות שיפוע Histodenz מתמשך. התשואה הגבוהה ביותר LCVs צפוי בדרך כלל ביחס של ~ 2 בשבריר 4 × 10 5 LCVs שלמים לכל 1 × 10 7fected אמבות 13. כמויות קטנות של LCVs נוכחים גם שברים 3 ו -5 בהתאמה. כך, התשואה הכוללת של LCVs מטוהרים הוא ~ 1 × 10 6 LCVs שלמים לכל 6 × 10 7 נגוע ד discoideum תאים 13. ההתאוששות של LCVs יכול להתבצע בטמפרטורת החדר (RT), ו LCVs נראים יציבים במשך כמה שעות. </li></ol> 3. ניתוח מיקרוסקופי של דגימות שנאספו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 24 גם שטוח התחתונה התרבות צלחת רקמות עם פולי-L-ליזין coverslips מצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה כל מדגם נלקח במהלך טיהור LCV בתוספת 150 μl של חלק זה צפיפות הדרגתי לתוך צלחת של 24 הבאר. הוסף 0.5 מ&quot;ל חיץ HS היטב בכל לדלל את ריכוז גבוה Histodenz. לאחר מכן, בצנטריפוגה צלחת ב 600 × ג&#39;10 דקות ב 4 ° C. מוציאים בזהירות את supernatant ולתקן את הדגימות עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות ב RT. לאחר קיבוע לשטוף את דגימות פעמיים. לנודואר Sorc עבור ד discoideum ו PBS עבור RAW264.7 מקרופאגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את דגימות ה-GFP-calnexin המבטאים ד discoideum, נלקחה ב שלבים שונים במהלך הבידוד LCV, ישירות למוצרי שקופיות הזכוכית באמצעות Vectashield למשל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של דגימות RAW264.7 מקרופאגים, שצולמו במהלך שלבים שונים בידוד LCV, עם פתרון חסימת (1% BSA ב PBS) 10 דקות ב RT. השתמש נוגדנים נגד SidC העיקרי להכתים את LCVs ו דגירה של 1h בחדר רטוב ב RT (זיקה, מזוכך הארנב נגד SidC: 1:1000 בחסימת המאגר). לאחר מכן לשטוף את דגימות שלוש פעמים עם PBS. דגירה עם נוגדנים משני (למשל נגד ארנב Cy5: 1:200 לבלום פתרון) למשך 30 דקות בחדר רטוב כהה RT. סוף סוף, לשטוף את דגימות שלוש פעמים עם PBS ו הר להם on-שקופיות הזכוכית באמצעות Vectashield למשל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , מורפולוגיה שלמות וכמות של LCVs מבודד GFP-calnexin להביע ד דיסcoideum או RAW264.7 מקרופאגים הם נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצוידים במסננים הולמים. </li></ol> 4. נציג תוצאות איכות תשואה של טיהור LCV ידי הפרדה חיסונית הזיקה ואת שיפוע צנטריפוגה צפיפות יכולה להיות מלווה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). סקירה של דגימות שנאספו במהלך הבידוד LCV מ ד discoideu מ &#39;או מקרופאגים מוצג (איור 2). Homogenate של ל pneumophila נגועים phagocytes מראה LCVs שלמים, אבל גם הרבה פסולת תאים וחיידקים תאיים. לאחר pelleting לדוגמה, התמונה דומה homogenate, לפעמים קצת צפוף. מאז LCVs שלמים לדבוק הטור, זרימה דרך מכיל בעיקר חיידקים תאיים ופסולת התא. לאחר משחררי מדגם מהעמודה, eluate מכיל LCVs שלמים בכמות גדולה. בידינו, LCV purificati<html> ב נראה יעיל יותר עבור ד discoideum מאשר מקרופאגים. ב ד את discoideum vacuoles פתוגן מופיעים עגולים תשואה של LCVs מבודדים הוא יותר מ -10 פעמים גבוה יותר בהשוואה מקרופאגים (איור 3). ב מקרופאגים שלמים LVCs מוכתמים נוגדנים שונים מופיעים גם יותר צורה בלתי מוגדרת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> 1. תרשים סכמטי סקירה של בידוד LCV. א) בידוד של LCVs ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדן זיקה, מטוהרים מפני SidC חלבון חיידקי מפעיל, למקם אך ורק קרום LCV. MACS משני מיקרו חרוז מצמידים נוגדנים ואת מגנט משמשים לבודד LCVs מן ההריסות התא. ב) לאחר חיסוני מגנטיים LCVs ההפרדה מטוהרים עוד יותר על ידי צנטריפוגה שיפוע Histodenz צפיפות. LCVs מועשרים בשבריר 4. upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; דוגמאות באיור 2. שנאסף במהלך טיהור LCV. תמונות homogenate, גלולה, זרימה דרך eluate ו מ ד discoideum או מקרופאגים מתוארים. דגימות עולה ל pneumophila לייצר DsRed-Express (אדום) ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin האות (על לוח ירוק, העליון) או מקרופאגים מוכתמים נוגדנים נגד SidC (ציאן, הפאנל התחתון). ברים, 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> איור 3. מטוהרים LCVs מ ד discoideum או מקרופאגים. הדגימות להראות חלק 4 לאחר צנטריפוגה צפיפות Histodenz שיפוע של ל pneumophila לייצר DsRed-Express (אדום) (א) ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin האות (ירוק) או (ב) מקרופאגים מוכתמים נוגדנים נגד SidC (ציאן). ברים, 10 מיקרומטר.

<ol><li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+spp.+outdoors%3A+colonization%2C+communication+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li>
<li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot%2FIcm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638(2011).</li>
<li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchors+for+effectors%3A+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91(2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li>
<li>Lührmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li>
<li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li>
<li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li>
<li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages%3A+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li>
<li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li>
<li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li>
<li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3(2010).</li>
<li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li>
<li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בניגוד לשיטות שפורסמו בעבר, פרוטוקול זה מבוסס על שני שלבים, 1 הפרדת LCVs ידי גישה חיסונית מגנטי, והשני, טיהור LCVs על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בידוד LCV ניתן בעקבות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כאשר גם חיידקים שכותרתו fluorescently ו-GFP תאים מייצרי נוגדנים או כתמים משמש. פרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, ישר קדימה השיטה, מה שגורם להעשרת LCVs עם טוהר גבוה. חשוב לציין, מעכבי פרוטאז במאגר homogenization נדרש RAW264.7 מקרופאגים, אבל לא חובה עבור discoideum ד 13.</...

טיהור vacuoles הפתוגן מ<em&gt; הלגיונלה</em&gt; נגועים phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

פתוגן אופורטוניסטי הלגיונלה pneumophila הוא חיידק עמיד אמבה, אשר גם משכפל ב מקרופאגים מכתשיים ובכך גורם לדלקת ריאות חמורה &quot;הליגיונרים&quot; מחלה &quot;1. ב phagocytes protozoan ו יונקים, ל pneumophila מעסיקה מנגנון משומר כדי ליצור מסוים, שכפול התא, מתירנית, &quot;הלגיונלה המכיל vacuole&quot; (LCV). היווצרות LCV דורש חיידקי ICM / דוט סוג מערכת הפרשת IV (T4SS), אשר translocates רבים כמו 275 &quot;מפעיל&quot; חלבונים לתוך התאים המארחים. Effectors לתפעל את החלבונים המארחות, כמו גם שומנים לתקשר עם הפרשה, האברונים endosomal ואת המיטוכונדריה 2-4. היווצרות LCVs מהווה תהליך מורכב, חזק מיותר, שהיא קשה להבנה בצורה רדוקציוניסטית. גישה אינטגרטיבית נדרש להבין באופן מקיף היווצרות LCV, כולל ניתוח גלובלי של נתיבעוגן מארח גורם האינטראקציות והדינמיקה הזמן והמרחב שלהם. כצעד ראשון לקראת מטרה זו, LCVs שלמים הם מטוהרים ונותחו על ידי proteomics ו lipidomics. הרכב היווצרות של הפתוגן המכילים vacuoles נחקר על ידי ניתוח proteomic באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית או 2-D ג&#39;ל אלקטרופורזה מצמידים את ספקטרומטר מסה. Vacuoles מבודד או discoideum אדמה חברתית אמבה Dictyostelium או phagocytes יונקים טיפח שושנת יריחו 5, 6 ליסטריה, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 או סלמונלה הלגיונלה spp. 10. עם זאת, הפרוטוקולים טיהור המועסקים מחקרים אלה זמן רב ומייגע, כפי שהם דורשים מיקרוסקופ אלקטרונים למשל לנתח מורפולוגיה LCV, יושר וטוהר. בנוסף, פרוטוקולים אלה אינם מנצלים תכונות ספציפיות של vacuole הפתוגן עבור enrichment. השיטה המוצגת כאן מתגבר על מגבלות אלה על ידי העסקת ד discoideum לייצר סמן פלואורסצנטי LCV ועל ידי מיקוד SidC חיידקי חלבון מפעיל, אשר סלקטיבי עוגנים קרום LCV באמצעות קשירה phosphatidylinositol 4-פוספט (PtdIns (4) P) 3,11. LCVs מועשרים בשלב הראשון על ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדן זיקה-מטוהרים העיקרי נגד SidC ו נוגדנים משני מצמידים את החרוזים מגנטיים, ולאחר מכן בשלב השני על ידי צנטריפוגה קלאסית צפיפות Histodenz שיפוע 12,13 (איור 1) . המחקר proteome של LCVs מבודד ד discoideum עולה יותר מ 560 התא המארח חלבונים, כולל חלבונים הקשורים שלפוחית ​​phagocytic, המיטוכונדריה, מיון, Golgi, כמו גם GTPases שונים, אשר לא היו מעורבים ביצירת LCV לפני 13. LCVs מועשר מטוהרים עםפרוטוקול המתואר כאן ניתן לנתח עוד יותר על ידי מיקרוסקופ (immunofluorescence, במיקרוסקופ אלקטרונים), בשיטות ביוכימיות (מערב כתם) וגישות proteomic או lipidomic.

מאמר זה מתאר שיטה בידוד וטיהור של שלמה<em&gt; הלגיונלה</em&gt; המכילים vacuoles (LCVs) של אמבה ומקרופגים. פרוטוקול שני שלבים כולל העשרת LCV ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדנים נגד סמן LCV חיידקים טיהור נוספת על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.

הפתוגן האופורטוניסטי Legionella pneumophila הוא חיידק העמיד לאמבות, אשר משכפל את עצמו גם במקרופאגים אלבולריים ובכך גורם ל... החמיר

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבודד Legionella שלמה המכילה VAEs או LCDs מפגוציטים נגועים. זאת מושג תחילה על ידי הומוגניזציה של הפגוציטים הנגועים באמצעות הומוגניזר עם כדור פלדה אל-חלודה. בשלב השני, ההומוגנאט מדוגר עם נוגדן ראשוני המכוון ספציפית לחלבון אפקטור חיידקי הממוקם בממברנת ה-LCV, ולאחר מכן מדוגר עם נוגדן משני המשורשר לחרוזי מגנט.בשלב הבא, ה-lc המעוטרים בנוגדנים נשמרים על ידי שדה מגנטי, ולאחר מכן נשטפים ואלוטים. לבסוף, ניתן לטהר את ה-LCDs המועשרים מגנטית באופן נוסף באמצעות סנטריפוגציה במדרג צפיפות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן לנצל מאפיינים מולקולריים ספציפיים למדורים של הטפילים המודבקים כדי לטהר חיידקי פתוגן שלמים. ארבעה ימים לפני בידוד LCV, בצעו מריחה של *Legionella pneumophila* המבטאת DS red express ממאגרי גליצרין על צלחות charcoal yeast extract auger עם 5 µg/mL Chloramphenicol. דגרו את החיידקים ב-37 °C יום אחד לפני ההדבקה. דגרו *Dictyostelium discoideum* המבטאת Calnexin GFP בריכוז 1×10⁷ בתרביות של בקבוקי tissue culture בני 75 cm², ב-10 mL של מצע HL5 עם G418 ב-23 °C. ביום שלפני הניסוי, חצנו מבחנה של 15 mL המכילה 3 mL של מצע YE ו-5 µg/mL של chloramphenicol עם כ-100 µL של תרחיף *L. pneumophila*.כדי להגיע לצפיפות אופטית של 0.1 באורך גל של 600 ננומטר

purification-of-pathogen-vacuoles-from-legionella-infected-phagocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Jung, A. L. et al., שלפוחיות הממברנה החיצונית של Legionella pneumophila: בידוד וניתוח הפוטנציאל הפרו-דלקתי שלהם על מקרופאגים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את הטיפול המקדים במקרופאגים עם שלפוחיות הממברנה החיצונית של לגיונלה פנאומופילה (OMVs) כדי לבחון את השפעתם על שכפול חיידקים. על ידי שינוי האיתות החיסוני של המארח, OMVs הופכים את המקרופאגים למתירניים יותר לזיהום. ספירת מושבות גבוהה יותר בתאים שטופלו, בהשוואה לתאים שלא טופלו, מצביעה על כך ש-OMV מקדמים שכפול של L. pneumophila בתוך...

בדיקת שכפול לגיונלה פנאומופילה במקרופאגים שטופלו מראש בשלפוחיות הממברנה החיצונית

מקור: יונג, א. ל. ואחרים. וזיקולות ממברנה חיצונית של Legionella pneumophila: בידוד וניתוח הפוטנציאל הפרו-דלקתי שלהן על מקרופאגים. J. Vis. Exp. (2017)הסרטון הזה מדגים את הבידוד של וזיקולות ממברנה חיצונית (OMVs) מ-Legionella pneumophila באמצעות צנטריפוגציה סדרתית, סינון סטרילי ואולטרה-צנטריפוגה. ה-OMVs המטוהרים, המועשרים בחלבוני ממברנה וליפופוליסכרידים, מתאימים למחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן.

בידוד מבוסס אולטרה-צנטריפוגציה של וזיקולות ממברנה חיצונית של Legionella pneumophila

מקור: סיגל, נ., ואחרים. טיהור RNA מ-Listeria monocytogenes תוך-תאית בתאי מקרופאג'.  J. Vis. Exp. (2016).הסרטון הזה מדגים את הבידוד של חיידקים פתוגניים פנימיים ממקרופאגים נגועים שמקורם במח עצם (BMDMs). חיידקים מורשים להיצמד לתאי המארח, וחיידקים לא מחוברים נשטפים. לאחר ההפנמה, מוסיפים אנטיביוטיקה לחיסול חיידקים שאינם מופנמים. תאי המארח עוברים ליזה, צנטריפוגה, והסופרנטנט מסונן כדי ללכוד את החיידקים על נייר סינון, שמוקפא במהירות ומאוחסן לשימוש נוסף.

בידוד חיידקים פתוגניים תוך-תאיים מתאי מארח נגועים

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

הזחל של עש mellonella Galleria שעווה הוקם לאחרונה כמודל vivo בללמוד זיהום pneumophila הלגיונלה. הנה, אנחנו מדגימים טכניקות בסיסיות לאפיין את הפתוגנזה של הלגיונלה בזחלים, כוללים חיסון, מדידה של אלימות ושכפול חיידקים, כמו גם הפקה וניתוח של hemocytes הנגוע.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

אנו מתארים את הכימות של סלמונלה טיפימוריום ציטוזולי ווואקולרי במקרופאגים שמקורם במח עצם באמצעות חדירות דיפרנציאלית של דיגיטונין.

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

כאן, אנו מתארים את טיהור pneumophila הלגיונלה (pneumophila L.) שלפוחית הקרום החיצוני (OMVs) מתרבויות נוזלי. שלפוחית ​​מטוהרים אלה משמשות לטיפול מקרופאגים לנתח פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

למד שיטה לבידוד vacuoles של Legionella מphagocytes נגועים באמצעות הומוגניזציה, הפרדה אימונו-מגנטית וצנטריפוגה במדרג צפיפות. שיטה זו משפרת את הטוהר לחקר מנגנוני מולקולריים של פתוגניות.

טיהור vacuoles הפתוגן מ

גלה סרטונים נוספים