וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את תפקוד הגן באמצעות השתמשת בהשתקה של RNA (RNA interference) מבוססת וקטור DNA. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תכנון ויצירה של מבני S-H-R-N-A המכוונים לגנים ספציפיים. השלב השני הוא הפקת לנטי-וירוס הנושא את קסרת הביטוי של ה-SH RNA.

לאחר מכן, קווי תאים יציבים נוצרים על ידי הדבקת תאים בלנטיבירוס, והתאים שהודבקו בלנטיבירוס משמשים במגוון בדיקות in vitro ו-in vivo כדי לקבוע את ההשפעות של השתקת הגן הנחקר. בסופו של דבר, בהתאם לבדיקות שנבחרו, התוצאות עשויות להראות שינויים ביכולת הגונוגנית של התאים כתוצאה מהנמכת ביטוי הגן (knockdown), באמצעות בדיקות proliferaton, migration ו-invasion in vitro, וכן באמצעות מודלים של xenograft formation in vivo. את הפרוצדורה ידגימו Daniel Stowell ו-ma Juan; דניאל הוא סטודנט לתואר מחקר במעבדה שלי, ו-Ma היא טכנאית.

צ'אנג הוא עמית פוסט-דוקטורט. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מחקר הסרטן, כגון האם לגן ספציפי יש תפקיד בהתפתחות ובהתקדמות הסרטן, ולאילו היבטים של תהליכים אלה הוא עשוי להיות חשוב. כדי להתחיל, תכננו והזמינו את האוליגונוקלאוטידים על בסיס הקריטריונים המתוארים: שני אוליגואים משלימים הפוכים המכילים את רצף המטרה בן 20 עד 23 הנוקלאוטידים בגן המטרה.

הם יצרו אתרי EcoR1 ו-HindIII בשני הקצוות. לאחר ביצוע ליגציה, אוליגו נוסף המכיל רצף משלים הפוך לרצף המטרה, ובקצה ה-3' שלו, מולחם לקצה ה-3' של מקדם H1 או U6 באמצעות פריימר מעלה (upstream primer).

השתמש ב-PCR כדי ליצור מקטע הכולל אתרים ל-BAM H one ו-Hindi three בכל אחד מקצותיו. במקביל, בצע עיכול של וקטור הלנטי-וירוס ומקטע ה-PCR. לאחר מכן, בצע תגובת ליגציה של שלושה מקטעים בין הווקטור, מקטע ה-PCR ואוליגנוקלאוטידי ה-Anil.

ביחס מולארי של 1:10:10, הווקטור המתקבל יפיק את ה-HRNA המבוקש עם רצף Hindi three באזור הלולאה. אם נעשה שימוש בווקטור הניתן להשראה, ייצור ה-HRNA יהיה תלוי בנוכחות של מולקולה מעוררת, כגון doxycycline עבור מערכת ה-Tet on. כעת, בצע טרנספורמציה לתאי e coli DH five alpha kompetent בעלי יעילות גבוהה באמצעות המוצר שעבר ליגציה, וזהה וקטורים חיוביים באמצעות סריקת PCR מבוססת מושבות.

בצעו הגברה של תוצר המשתרע על פני הווקטור ואתר הליגציה של הפרומוטור האינדוסיבילי. הכינו DNA פלסמי מהמושבות החיוביות באמצעות ערכה מסחרית. לאחר מכן, אשרו את נוכחות הinsert באמצעות עיכול ב-BAM H one ו-ECO R one ובאמצעות אלקטרופורזה של DNA בג'ל אגרוז.

בנוסף, בצעו רצף לאזור המכיל את הפרומוטור ואת S-H-R-N-A באמצעות LIGA nucleotide P five. השתמשו בערכה ל-MIDI או maxi prep נטולת אנדוטוקסינים כדי להכין את ה-DNA של הלנטי-וירוס הנושא את קסטת הביטוי של ה-HRNA. קבעו את ריכוז ה-DNA על ידי מדידת בליעת האור ב-260 nanometers, וודאו את טוהר ה-DNA על ידי בדיקה כי יחס בליעת האור ב-260 ל-280 nanometer הוא בין 1.8 ל-2.0.

לבסוף, הרץ את הפלסמיד של הלנטי-וירוס על aero gel כדי לוודא שהוא במבנה S coiled. לפני הטרנספקציה, הכן את התמיסות על ידי טפטוף איטי של 0.9 milliliters של תמיסה A לתוך 0.9 milliliters של תמיסה B, תוך כדי הזרמת בועות אוויר לתוך תמיסה B באמצעות פיפטה. לאחר מכן, דגור את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, טפטף באיטיות 0.6 milliliters מהתערובת על שלוש צלחות שונות של 10 סנטימטר המכילות תאי HEK 2 93 T.

לאחר ארבע עד שש שעות, החזירו את התאים לאינקובטור. החליפו את המצע ב-7 milliliters של מצע DMEM מלא. לאחר 24 שעות, הוסיפו 5 milliliters נוספים של מצע, ולאחר 24 שעות נוספות, אספו את המצע המכיל את הלנטיווירוס.

סובב את המצע שנאסף במהירות של 1500 RPM בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. סנן את העלייה באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר. סובב את המצע שעבר סינון ומכיל את הלנטי-וירוס באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה.

שפכו את הנוזל העליון (supernatant) למכל פסולת המכיל 5% bleach. השעיקו מחדש את משקע הלנטי-וירוס (lentivirus pellet) ב-0.5 עד 1 מיליליטר של 1X PBS קר. לאחר מכן, חלקו את תמיסת הלנטי-וירוס לאליקוויטות של 50 עד 100 µL לאחסון בטמפרטורה של 80- °C.

לבסוף, קבעו את הטיטר של הלנטי-וירוס באמצעות טכניקה מהימנה. בדרך כלל, צלחת תרבית של 10 סנטימטר תפיק בין 50 ל-100 מיליון יחידות זיהומיות לפני המעבר להדבקת התאים. קבעו את ה-MOI של טיטר הלנטי-וירוס באמצעות ערכה או R-T-P-C-R עבור הליך זה.

מומלץ להשתמש ב-MOI נמוך מארבע. התחלו בזריעת התאים המיועדים להדבקה בפלטה של שישה בארות עד להשגה של 30% עד 40% התקהלות (confluency) וגדלו אותם למשך הלילה. למחרת.

החליפו את המצע במילליטר אחד של מצע טרי המכיל poly brain או protamine. לאחר מכן, הוסיפו בין מיליון ל-2 מיליון iu של lentivirus המכיל סמן פלואורסצנטי או סמן אנטיביוטי.

נערה את הפלטה בעדינות למשך 10 שניות כדי לערבב, והדגה אותה למשך שש שעות. לאחר שש שעות, החליפו את המצע במצע רגיל ומלא, וגדלו את התאים למשך יומיים. המצעים לא יכילו אנטיביוטיקה או אינדוקטורים, ללא קשר ללנטי-וירוס שנעשה בו שימוש, לאחר יומיים.

הוסיפו את האנטיביוטיקה המתאימה אם הלנטי-וירוס מכיל סמן אנטיביוטיקה. באופן דומה, הוסיפו משרה (inducer) למחצית מהתרביות אם הלנטי-וירוס הוא ניתן להשראה. לאחר גידול התאים למשך יומיים או שלושה נוספים עם אנטיביוטיקה ומשרים, בצעו אנליזת western blot כדי לבחון את ה-knockdown של הגן מטרה לפני ביצוע השתלת קסנוגרפט (xenograft) באמצעות טריפסין.

יש להעביר את התאים מצלחות תרבית גדולות ולסבב אותם במדיום המקורי המכיל 50% matrigel. חיוני לשמור על תרחיף תאי הסרטן ב-50% matrigel ועל המזרק על קרח. אחרת, קיים סיכון שה-matrigel יתגבש והתהליך יופסק בגלל זאת.

הכינו את אזור הניתוח על ידי ניקוי יסודי עם 70%ethanol ובצעו את ההרדמה עם אוורור מצוין ומסנן לספיגת isof fluorine המחובר לתא ההשראה. הרדימו עכברים עם ת'ימוס חסר (thymic nude mice) באמצעות 2%isof fluorine מעורבב עם 1.5%oxygen שלוש עד חמש דקות לפני הזרקת התאים. לאחר מכן, שמרו על ההרדמה באמצעות 2%isof fluorine מעורבב עם oxygen דרך מסכת אף.

מקמו את העכבר על פד חימום המכוון ל-30 °C. העמיסו את התאים למזרקים עם מחטים בכיול 25.5 להזרקות תת-עוריות, או מחטים בכיול 28 עד 30 להזרקות אורתוטופיות. חמש דקות לאחר השראת ההרדמה, במקום אחד או שניים, ההריצו בין מיליון ל-10 מיליון תאים בבוליסים של 200 µL.

מספר התאים תלוי במידת הממאירות או באגרסיביות של תאי הסרטן. עבור וקטורים בעלי פעילות קבועה (constitutively active), השתמשו בשתי קבוצות עכברים שהוזרקו תאים המבטאים או את הגן המטרה S-H-R-N-A או S-H-R-N-A scrambled על וקטורים. השתמשו באותן שתי קבוצות וחלקו כל אחת מהן לתתי-קבוצות שקיבלו או לא קיבלו מושרה (inducer) במי השתייה שלהן.

יש להחליף את כלי השתייה המכילים מים פעמיים בשבוע. יש לנטר את נפח הגידולים מדי שבוע או פעם בשבועיים באמצעות קליפר. ודאו שנפח הגידול אינו עולה על המגבלה המוסדית או של ה-ACUC, והקריבו (euthanize) כל בעל חיים המראה כיבובים נרחבים, נמק, זיהום גלוי, דימום בלתי נשלט או מחלה בשלב סופי. כדי לנטר את צמיחת הגידול ואת הגלישה (metastasis) באמצעות סמן ביולומינצנטי, יש לחטא את אזור העבודה ולהרדימ את העכברים בתא דימות באמצעות הרדמה גזית.

ראשית, בצעו חשיפה של שתי עד חמש דקות ובדקו את עוצמת האות, ולאחר מכן התאימו אותה בהתאם. אם גודל הגידול עולה על 1000 מילימטרים מעוקבים או על מגבלת הגודל המוסדית, השמידו את בעל החיים בעת ההקרבה, תעדו את גודל הגידול ושמרו אותם להמשך ניתוח. פרוטוקול זה שימש למחקר של השפעות ה-knockdown של why Y one על התפתחות גידולי קסנוגרפט של תאי אדנוקרצינומה של השד האנושי המבטאים לוסיפרז, אשר הועברו לעכברים עירומים (nude) אתיימיים.

נבדקו הן רצף המטרה של S-H-R-N-A עבור YY1 אנושי והן S-H-R-N-A בקרה מסודר מחדש (scrambled), שלא הראה דמיון משמעותי לאף תמליל אנושי ידוע. כתוצאה מכך, נבנו שני וקטורים לנטיביריאליים אשר שימשו להפקת שני וירוסים לנטיביריאליים. שניהם שימשו להדבקת שתי אוכלוסיות תאים שונות, ובהתאם התקבלו אוכלוסיות תאים פוליקלונליות.

לאחר סלקציה באמצעות puromycin, ניתוח Western blot אישר את ה-knockdown של YY1 המושרה על ידי DS בקווי תאים נגועים אלו. לאחר מכן, אוכלוסיית התאים הפוליקלונלית של קלון שלוש שהודבקה ב-inducible YY1 shRNA וב-control shRNA.

לנטי-וירוסים (LENTIVIRUSES) שימשו לבדיקת ההשפעות של מחסור ב-YY one על פלישה. הצפנו כי מחסור ב-YY one הפחית את הפלישתיות של התאים. ניתוח Western blot אישש כי ה-YY one S-H-R-N-A המשרה הוביל להשתקה של YY one בתאים, בעוד שבתאים המכילים את השליטה.

S-H-R-N-A לא הראתה השפעה זו. תאים אלו שימשו לאחר מכן במחקר של מודל מעכברים עם השתלה קסנוגראפטית (xenograft) בהשוואה לקבוצות הביקורת indu, YY one; עכברים שבהם הושתלו תאי S-H-R-N-A וקיבלו מים הכילים את הדוזה הראו הפחתה משמעותית ביצירת גידולים כפי שנצפה בבדיקת ביו-לומנצנציה ובמדידת משקלי הגידולים, כפי שצפוי. השתיקה של YY one בגידולים קסנוגראפטיים אלו אושרה בקלות באמצעות western blot.

מחקרים: אין לשכוח שעבודה עם lentivirus עלולה להיות מסוכנת ביותר; בהתאם לשיקולי הבטיחות של ה-NIHB למחקר עם וקטורים לנטיוויריאליים, נדרשים נהלי הכלה של רמת בטיחות 2 (BSL-2) בכל סביבת מעבדה.