Name: וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: למדו כיצד להשתמש ב-RNAi מבוסס וקטור DNA לחקירת תפקוד גנים בסרטן. השיטה מאפשרת השתקת גנים לטווח ארוך בתאים יציבים ובמודלים של קסנוגרפיה אינ-ויוו, ומסייעת להבין תהליכים ביולוגיים מרכזיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר המלומדת (116403-RSG-09-082-01-MgO) של האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן וקופות המיפוי של אוניברסיטת Wake Forest למדעי הבריאות ל GS. DBS נתמך על ידי NCI אימון מענק 5T32CA079448.

<ol><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncog%22%5BJournal%5D)">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li>
<li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li>
<li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li>
<li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+%28MOI%29+for+predicting+gene+transfer+events%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Vaccines+Ther%22%5BJournal%5D)">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6(2004).</li>
<li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li>
<li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

פרוטוקול זה מתאר שיטה להפיל הגן באמצעות shRNA ולדמיין ההשפעה הביולוגית שלה באמצעות הדמיה bioluminescent גידול תאים סרטניים in vivo. אתר היעד של shRNA לא יכילו כל אחד משלושת אתרי הגבלה (BamHI, HindIII ו EcoRI) משמש עבור subcloning. בתרחיש נדיר כאשר כל אחד מהאתרים הללו קיים, אנזים הגבלה נוספת שניתן להשתמש בהם כדי להחליף אותו ביצירת מבנה. צעדים מרכזיים בפרוטוקול זה תאיץ את בניית וקטורים lentiviral shRNA. רא...

בנוסף ציוד מעבדה נפוצה המשמשת RNA וניתוח חלבון ו תרבית תאים, חומרים הבאים ריאגנטים נדרשים עבור פרוטוקול זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית מתאים הבלימה ברמת בטיחות ביולוגית 2 הממשלה </td></tr><tr><td> PCR thermocycler </td></tr><tr><td> Ultracentrifuge </td></tr><tr><td> הרדמה, אינדוקציה קאמרית עם אוכלי נבלות isoflurane </td></tr><tr><td> Digital Vernier קליפר </td></tr><tr><td> IVIS הדמיה המערכת </td></tr><tr><td> המוסמכות ביותר DH5a החיידק אשריכיה קולי </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, &amp; HindIII הגבלה אנזימים </td></tr><tr><td> האנזים T4 DNA </td></tr><tr><td> הדור השלישי lentivirus אריזה פלסמידים VSV-G, pRSV-Rev ו pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> רשימת חומרים

וקטור מבוסס dna התערבות rna ללמוד לתפקד גנים סרטן

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

התערבות RNA (RNAi) מעכב ביטוי גנים על ידי mRNAs יעד משפילים במיוחד. מאז גילויו של פעמיים תקועים התערבות RNA קטן (siRNA) בגן ההשתקה 1, RNAi הפך לכלי רב עוצמה המחקר במחקרים תפקוד הגן. לעומת מחיקה גנטית, RNAi בתיווך להשתקת גנים בעל יתרונות רבים, כגון הקלות שבה היא מתבצעת והתאמתו שורות תאים ביותר. מחקרים רבים הדגימו את היישומים של טכנולוגיית RNAi בחקר הסרטן. בפרט, פיתוח טכנולוגיית ה-DNA וקטור מבוסס לייצר סיכת ראש RNA קטן (shRNA) מונע על ידי U6 או האמרגן H1 הפכה לטווח ארוך הגן מושרה להשתיק 2,3 אפשרי. השימוש בו בשילוב עם וקטורים ויראליים מהונדסים גנטית, כמו lentivirus, מקלה על יעילות גבוהה של משלוח shRNA ו / או אינטגרציה לתוך הדנ&quot;א הגנומי לביטוי shRNA יציב. אנו מתארים detaileהליך D באמצעות וקטור מבוססי טכנולוגיית ה-DNA RNAi לקבוע תפקוד הגן, כולל בנייה של וקטורים lentiviral המבטאים shRNA, ייצור lentivirus וזיהום התא, ומחקרים תפקודית באמצעות מודל xenograft העכבר. אסטרטגיות שונות דווחו ביצירת מבנים shRNA. פרוטוקול המתואר כאן העסקת הגברה PCR ו קשירת 3-שבר יכול לשמש ישירות וביעילות ליצור shRNA המכילים מבנים lentiviral מבלי לעזוב כל הצמוד נוקלאוטיד נוסף ברצף shRNA קידוד. מאז shRNA ביטוי קלטות שנוצרו על ידי אסטרטגיה זו ניתן לגזור על ידי אנזימי הגבלה, הם יכולים להעביר בקלות וקטורים אחרים עם סמנים ניאון או אנטיביוטיקה שונים. ריאגנטים transfection המסחריים יכולים לשמש בייצור lentivirus. עם זאת, בדו&quot;ח זה, אנו מספקים שיטה כלכלית באמצעות סידן זרחתי משקעים כי ניתן להשיג על יעילות transfection של 90%293T תאים. לעומת מכוננת וקטורים shRNA הביטוי, מערכת shRNA מושרה מתאים במיוחד כדי לדפוק את הגן חיוני התפשטות תאים. אנחנו מדגימים להשתקת גנים של ין יאנג 1 (YY1), oncogene פוטנציאל בסרטן השד 4,5, על ידי ט במערכת מושרה shRNA והשפעתו על היווצרות הגידול. מחקר באמצעות lentivirus מחייב סקירה ואישור פרוטוקול בטיחות ביולוגית על ידי ועדת בטיחות ביולוגית של המוסד של החוקר. מחקרים באמצעות מודלים של בעלי חיים מחייבת בדיקה ואישור של פרוטוקול בעלי חיים על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (ACUC) במוסד של החוקר.

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת הגן<em&gt; In vivo</em&gt;.

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

השתקה של RNA (RNA interference - RNAi) מעכבת ביטוי גנים על ידי פירוק ספציפי של mRNA מטרה. מאז הגילוי של RNA התערבות קטן ודו-גדילי...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את תפקוד הגן באמצעות השתמשת בהשתקה של RNA (RNA interference) מבוססת וקטור DNA. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תכנון ויצירה של מבני S-H-R-N-A המכוונים לגנים ספציפיים. השלב השני הוא הפקת לנטי-וירוס הנושא את קסרת הביטוי של ה-SH RNA.לאחר מכן, קווי תאים יציבים נוצרים על ידי הדבקת תאים בלנטיבירוס, והתאים שהודבקו בלנטיבירוס משמשים במגוון בדיקות in vitro ו-in vivo כדי לקבוע את ההשפעות של השתקת הגן הנחקר. בסופו של דבר, בהתאם לבדיקות שנבחרו, התוצאות עשויות להראות שינויים ביכולת הגונוגנית של התאים כתוצאה מהנמכת ביטוי הגן (knockdown), באמצעות בדיקות proliferaton, migration ו-invasion in vitro, וכן באמצעות מודלים של xenograft formation in vivo. את הפרוצדורה ידגימו Daniel Stowell ו-ma Juan; דניאל הוא סטודנט לתואר מחקר במעבדה שלי, ו-Ma היא טכנאית.צ'אנג הוא עמית פוסט-דוקטורט. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מחקר הסרטן, כגון האם לגן ספציפי יש תפקיד בהתפתחות ובהתקדמות הסרטן, ולאילו היבטים של תהליכים אלה הוא עשוי להיות חשוב. כדי להתחיל, תכננו והזמינו את האוליגונוקלאוטידים על בסיס הקריטריונים המתוארים: שני אוליגואים משלימים הפוכים המכילים את רצף המטרה בן 20 עד 23 הנוקלאוטידים בגן המטרה.הם יצרו אתרי EcoR1 ו-HindIII בשני הקצוות. לאחר ביצוע ליגציה, אוליגו נוסף המכיל רצף משלים הפוך לרצף המטרה, ובקצה ה-3' שלו, מולחם לקצה ה-3' של מקדם H1 או U6 באמצעות פריימר מעלה (upstream primer).השתמש ב-PCR כדי ליצור מקטע הכולל אתרים ל-BAM H one ו-Hindi three בכל אחד מקצותיו. במקביל, בצע עיכול של וקטור הלנטי-וירוס ומקטע ה-PCR. לאחר מכן, בצע תגובת ליגציה של שלושה מקטעים בין הווקטור, מקטע ה-PCR ואוליגנוקלאוטידי ה-Anil.ביחס מולארי של 1:10:10, הווקטור המתקבל יפיק את ה-HRNA המבוקש עם רצף Hindi three באזור הלולאה. אם נעשה שימוש בווקטור הניתן להשראה, ייצור ה-HRNA יהיה תלוי בנוכחות של מולקולה מעוררת, כגון doxycycline עבור מערכת ה-Tet on. כעת, בצע טרנספורמציה לתאי e coli DH five alpha kompetent בעלי יעילות גבוהה באמצעות המוצר שעבר ליגציה, וזהה וקטורים חיוביים באמצעות סריקת PCR מבוססת מושבות.בצעו הגברה של תוצר המשתרע על פני הווקטור ואתר הליגציה של הפרומוטור האינדוסיבילי. הכינו DNA פלסמי מהמושבות החיוביות באמצעות ערכה מסחרית. לאחר מכן, אשרו את נוכחות הinsert באמצעות עיכול ב-BAM H one ו-ECO R one ובאמצעות אלקטרופורזה של DNA בג'ל אגרוז.בנוסף, בצעו רצף לאזור המכיל את הפרומוטור ואת S-H-R-N-A באמצעות LIGA nucleotide P five. השתמשו בערכה ל-MIDI או maxi prep נטולת אנדוטוקסינים כדי להכין את ה-DNA של הלנטי-וירוס הנושא את קסטת הביטוי של ה-HRNA. קבעו את ריכוז ה-DNA על ידי מדידת בליעת האור ב-260 nanometers, וודאו את טוהר ה-DNA על ידי בדיקה כי יחס בליעת האור ב-260 ל-280 nanometer הוא בין 1.8 ל-2.0.לבסוף, הרץ את הפלסמיד של הלנטי-וירוס על aero gel כדי לוודא שהוא במבנה S coiled. לפני הטרנספקציה, הכן את התמיסות על ידי טפטוף איטי של 0.9 milliliters של תמיסה A לתוך 0.9 milliliters של תמיסה B, תוך כדי הזרמת בועות אוויר לתוך תמיסה B באמצעות פיפטה. לאחר מכן, דגור את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, טפטף באיטיות 0.6 milliliters מהתערובת על שלוש צלחות שונות של 10 סנטימטר המכילות תאי HEK 2 93 T.לאחר ארבע עד שש שעות, החזירו את התאים לאינקובטור. החליפו את המצע ב-7 milliliters של מצע DMEM מלא. לאחר 24 שעות, הוסיפו 5 milliliters נוספים של מצע, ולאחר 24 שעות נוספות, אספו את המצע המכיל את הלנטיווירוס.סובב את המצע שנאסף במהירות של 1500 RPM בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. סנן את העלייה באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר. סובב את המצע שעבר סינון ומכיל את הלנטי-וירוס באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה.שפכו את הנוזל העליון (supernatant) למכל פסולת המכיל 5% bleach. השעיקו מחדש את משקע הלנטי-וירוס (lentivirus pellet) ב-0.5 עד 1 מיליליטר של 1X PBS קר. לאחר מכן, חלקו את תמיסת הלנטי-וירוס לאליקוויטות של 50 עד 100 µL לאחסון בטמפרטורה של 80- °C.לבסוף, קבעו את הטיטר של הלנטי-וירוס באמצעות טכניקה מהימנה. בדרך כלל, צלחת תרבית של 10 סנטימטר תפיק בין 50 ל-100 מיליון יחידות זיהומיות לפני המעבר להדבקת התאים. קבעו את ה-MOI של טיטר הלנטי-וירוס באמצעות ערכה או R-T-P-C-R עבור הליך זה.מומלץ להשתמש ב-MOI נמוך מארבע. התחלו בזריעת התאים המיועדים להדבקה בפלטה של שישה בארות עד להשגה של 30% עד 40% התקהלות (confluency) וגדלו אותם למשך הלילה. למחרת.החליפו את המצע במילליטר אחד של מצע טרי המכיל poly brain או protamine. לאחר מכן, הוסיפו בין מיליון ל-2 מיליון iu של lentivirus המכיל סמן פלואורסצנטי או סמן אנטיביוטי.נערה את הפלטה בעדינות למשך 10 שניות כדי לערבב, והדגה אותה למשך שש שעות. לאחר שש שעות, החליפו את המצע במצע רגיל ומלא, וגדלו את התאים למשך יומיים. המצעים לא יכילו אנטיביוטיקה או אינדוקטורים, ללא קשר ללנטי-וירוס שנעשה בו שימוש, לאחר יומיים.הוסיפו את האנטיביוטיקה המתאימה אם הלנטי-וירוס מכיל סמן אנטיביוטיקה. באופן דומה, הוסיפו משרה (inducer) למחצית מהתרביות אם הלנטי-וירוס הוא ניתן להשראה. לאחר גידול התאים למשך יומיים או שלושה נוספים עם אנטיביוטיקה ומשרים, בצעו אנליזת western blot כדי לבחון את ה-knockdown של הגן מטרה לפני ביצוע השתלת קסנוגרפט (xenograft) באמצעות טריפסין.יש להעביר את התאים מצלחות תרבית גדולות ולסבב אותם במדיום המקורי המכיל 50% matrigel. חיוני לשמור על תרחיף תאי הסרטן ב-50% matrigel ועל המזרק על קרח. אחרת, קיים סיכון שה-matrigel יתגבש והתהליך יופסק בגלל זאת.הכינו את אזור הניתוח על ידי ניקוי יסודי עם 70%ethanol ובצעו את ההרדמה עם אוורור מצוין ומסנן לספיגת isof fluorine המחובר לתא ההשראה. הרדימו עכברים עם ת'ימוס חסר (thymic nude mice) באמצעות 2%isof fluorine מעורבב עם 1.5%oxygen שלוש עד חמש דקות לפני הזרקת התאים. לאחר מכן, שמרו על ההרדמה באמצעות 2%isof fluorine מעורבב עם oxygen דרך מסכת אף.מקמו את העכבר על פד חימום המכוון ל-30 °C. העמיסו את התאים למזרקים עם מחטים בכיול 25.5 להזרקות תת-עוריות, או מחטים בכיול 28 עד 30 להזרקות אורתוטופיות. חמש דקות לאחר השראת ההרדמה, במקום אחד או שניים, ההריצו בין מיליון ל-10 מיליון תאים בבוליסים של 200 µL.מספר התאים תלוי במידת הממאירות או באגרסיביות של תאי הסרטן. עבור וקטורים בעלי פעילות קבועה (constitutively active), השתמשו בשתי קבוצות עכברים שהוזרקו תאים המבטאים או את הגן המטרה S-H-R-N-A או S-H-R-N-A scrambled על וקטורים. השתמשו באותן שתי קבוצות וחלקו כל אחת מהן לתתי-קבוצות שקיבלו או לא קיבלו מושרה (inducer) במי השתייה שלהן.יש להחליף את כלי השתייה המכילים מים פעמיים בשבוע. יש לנטר את נפח הגידולים מדי שבוע או פעם בשבועיים באמצעות קליפר. ודאו שנפח הגידול אינו עולה על המגבלה המוסדית או של ה-ACUC, והקריבו (euthanize) כל בעל חיים המראה כיבובים נרחבים, נמק, זיהום גלוי, דימום בלתי נשלט או מחלה בשלב סופי. כדי לנטר את צמיחת הגידול ואת הגלישה (metastasis) באמצעות סמן ביולומינצנטי, יש לחטא את אזור העבודה ולהרדימ את העכברים בתא דימות באמצעות הרדמה גזית.ראשית, בצעו חשיפה של שתי עד חמש דקות ובדקו את עוצמת האות, ולאחר מכן התאימו אותה בהתאם. אם גודל הגידול עולה על 1000 מילימטרים מעוקבים או על מגבלת הגודל המוסדית, השמידו את בעל החיים בעת ההקרבה, תעדו את גודל הגידול ושמרו אותם להמשך ניתוח. פרוטוקול זה שימש למחקר של השפעות ה-knockdown של why Y one על התפתחות גידולי קסנוגרפט של תאי אדנוקרצינומה של השד האנושי המבטאים לוסיפרז, אשר הועברו לעכברים עירומים (nude) אתיימיים.נבדקו הן רצף המטרה של S-H-R-N-A עבור YY1 אנושי והן S-H-R-N-A בקרה מסודר מחדש (scrambled), שלא הראה דמיון משמעותי לאף תמליל אנושי ידוע. כתוצאה מכך, נבנו שני וקטורים לנטיביריאליים אשר שימשו להפקת שני וירוסים לנטיביריאליים. שניהם שימשו להדבקת שתי אוכלוסיות תאים שונות, ובהתאם התקבלו אוכלוסיות תאים פוליקלונליות.לאחר סלקציה באמצעות puromycin, ניתוח Western blot אישר את ה-knockdown של YY1 המושרה על ידי DS בקווי תאים נגועים אלו. לאחר מכן, אוכלוסיית התאים הפוליקלונלית של קלון שלוש שהודבקה ב-inducible YY1 shRNA וב-control shRNA.לנטי-וירוסים (LENTIVIRUSES) שימשו לבדיקת ההשפעות של מחסור ב-YY one על פלישה. הצפנו כי מחסור ב-YY one הפחית את הפלישתיות של התאים. ניתוח Western blot אישש כי ה-YY one S-H-R-N-A המשרה הוביל להשתקה של YY one בתאים, בעוד שבתאים המכילים את השליטה.S-H-R-N-A לא הראתה השפעה זו. תאים אלו שימשו לאחר מכן במחקר של מודל מעכברים עם השתלה קסנוגראפטית (xenograft) בהשוואה לקבוצות הביקורת indu, YY one; עכברים שבהם הושתלו תאי S-H-R-N-A וקיבלו מים הכילים את הדוזה הראו הפחתה משמעותית ביצירת גידולים כפי שנצפה בבדיקת ביו-לומנצנציה ובמדידת משקלי הגידולים, כפי שצפוי. השתיקה של YY one בגידולים קסנוגראפטיים אלו אושרה בקלות באמצעות western blot.מחקרים: אין לשכוח שעבודה עם lentivirus עלולה להיות מסוכנת ביותר; בהתאם לשיקולי הבטיחות של ה-NIHB למחקר עם וקטורים לנטיוויריאליים, נדרשים נהלי הכלה של רמת בטיחות 2 (BSL-2) בכל סביבת מעבדה.

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד...

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

אנו מציגים פרוטוקול להפגין מערכת העברת גנים סומאטית הרומן ניצול RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם העכבר כדי ללמוד את הפונקציה של גנים גרורות. העופות רטרווירוסים נמסרות intracardiacally כדי להבטיח העברה גנטית לתוך נגעים טרום ממאירים, לא פולשנית של תאי β בלבלב בעכברים בוגרים.

זיהוי ואפיון הגורמים גרורתי על ידי העברה גנטית לתוך הרומן RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם מאתר

כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.

ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

גנים רבים מעודכנים, מעודדים נדידה ופלישה של תאי גידול, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה. קביעה אילו גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול היא קריטית. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקר ההשפעות של ביטוי מוגבר של גן על נדידה ופלישה של תאי גידול בזמן אמת.

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

מחקר זה מציג מערכת CRISPRi כפולה המכוונת ל-RNA ארוכים שאינם מקודדים בתאי מלנומה. הוא מאפשר הפלת גנים קומבינטוריים ובדיקה קטלנית סינתטית, זיהוי אינטראקציות lncRNA ספציפיות לסרטן לאסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

אסטרטגיית הפרעות CRISPR כפולות למיקוד אינטראקציות קטלניות סינתטיות בין RNA לא מקודדים בתאים סרטניים

אנו מתארים שיטה מינימלית פולשנית וללא כאבים למדוד hindlimb כלבים שריר וכוח התגובה התכווצויות שריר אקסצנטרי חוזרות ונשנות.

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

למדו כיצד להשתמש ב-RNAi מבוסס וקטור DNA לחקירת תפקוד גנים בסרטן. השיטה מאפשרת השתקת גנים לטווח ארוך בתאים יציבים ובמודלים של קסנוגרפיה אינ-ויוו, ומסייעת להבין תהליכים ביולוגיים מרכזיים.

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

גלה סרטונים נוספים