וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את תפקוד הגנים באמצעות שימוש בהפרעות RNA מבוססות וקטור DNA. זה מושג על ידי תכנון ויצירה ראשונים של מבני S-H-R-N-A המכוונים לגנים ספציפיים. השלב השני הוא לייצר לנטי-וירוס הנושא את קלטת הביטוי SH RNA.

לאחר מכן נוצרים קווי תאים יציבים על ידי הדבקת תאים ב-lentivirus והתאים הנגועים ב-lentivirus משמשים במבחנים שונים במבחנה וב-vivo כדי לקבוע את ההשפעות של השתקת הגן המעניין. בסופו של דבר, בהתאם למבחנים שנעשה בהם שימוש, התוצאות יכולות להראות שינויים בגניבות הגידול של התאים כתוצאה מהפלת גנים באמצעות שימוש במבחני התפשטות במבחנה, הגירה ופלישה, כמו גם מודלים של היווצרות קסנוגרפט in vivo. מדגימים את ההליך דניאל סטוול, מא חואן, ודניאל הוא סטודנט לתואר שני במעבדה שלי מא מא היא טכנאית.

צ'אנג הוא פוסט-דוקטורנט. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כגון האם לגן ספציפי יש תפקיד בהתפתחות והתקדמות הסרטן, ולאילו היבטים של תהליכים אלה הוא עשוי להיות חשוב. כדי להתחיל לתכנן ולסדר את האוליגונוקלאוטידים על סמך הקריטריונים המתוארים אניל את שני האוליגו המשלימים ההפוכים המכילים את רצף המטרה של 20 עד 23 נוקלאוטידים בגן המטרה.

הם יהוו אתרים אקולוגיים R אחד ושלושה הינדיים בשני הקצוות. לאחר כריעת ברך, אוליגו אחר מכיל רצף מחמיא הפוך לרצף המטרה, ושלושת הקצה הראשוני שלו. מסמרים לקצה השלישי של מקדם H one או U 6 עם פריימר במעלה הזרם.

השתמש ב-PCR כדי ליצור קטע שיש לו BAM H אחד ושלושה אתרים הינדיים משני קצותיו. בינתיים לעכל את וקטור ה-lentivirus ואת שבר ה-PCR. לאחר מכן בצע תגובת קשירה של שלושה שברים בין הווקטור, שבר ה-PCR ונוקלאוטידים של Anil oligo.

ביחס של 1 ל-10 עד 10 מולארי, הווקטור המתקבל יפיק את ה-HRNA המעניין עם רצף שלוש הינדי באזור הלולאה. אם נעשה שימוש בווקטור הניתן להשראה, ייצור ה-HRNA יהיה תלוי בנוכחות של מולקולת משרה כגון דוקסיציקלין עבור מערכת ה-Tet on. כעת הפוך את אי קולי DH חמישה תאי אלפא יעילים ומוכשרים ביותר באמצעות המוצר הקשור וזהה וקטורים חיוביים באמצעות מסך PCR מבוסס מושבה.

הגבירו מוצר המשתרע על פני הווקטור ואתר קשירת המקדם הניתן להשראה. הכן DNA פלזמה מהמושבות החיוביות עם ערכה מסחרית. לאחר מכן אשר את נוכחות התוספת על ידי BAM H אחד ו- ECO R אחד עיכול ועל ידי אלקטרופורזה של אגרוז DNA.

בנוסף, רצף את האזור המכיל את המקדם ו-S-H-R-N-A באמצעות נוקלאוטיד LIGA P חמש. באמצעות ערכת הכנה ל-MIDI או מקסי ללא אנדוטוקסין, הכינו את ה-DNA של ה-lentivirus הנושא את קלטת הביטוי של HRNA. קבע את ריכוז ה-DNA על ידי מדידת ספיגת האור ב-260 ננומטר והבטח את טוהר ה-DN a על ידי בדיקה שיחס ספיגת האור של 260 עד 280 ננומטר הוא בין 1.8 ל-2.0.

לבסוף הפעל את פלסמיד ה-lentivirus על ג'ל אוויר כדי לוודא שהוא מפותל S לפני הטרנספקציה, התכוננו לטרנספקציה על ידי ירידה איטית של 0.9 מיליליטר של תמיסה A לתוך 0.9 מיליליטר של תמיסה B תוך כדי בעבוע אוויר דרך תמיסה B עם פיפטה. לאחר מכן דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, זרוק לאט 0.6 מיליליטר מהתערובת על שלוש צלחות שונות של 10 סנטימטר עם תאי HEK 2 93 T.

לאחר מכן החזירו את התאים לאינקובטור כעבור ארבע עד שש שעות. החלף את המדיום בשבעה מיליליטר של מדיום DMEM שלם. לאחר 24 שעות, הוסיפו עוד חמישה מיליליטר של מדיום, ולאחר 24 שעות נוספות, קצרו את המדיום המכיל את נגיף הלנטי.

סובב את המדיום שנקטף ב -1500 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מסננים את הסופרנטנט באמצעות פילטר של 0.45 מיקרומטר. סובב את הזרימה דרך המדיום המכיל את נגיף הלנטי על ידי אולטרה צנטריפוגה.

שפכו את הסופרנטנט למיכל פסולת המכיל 5% אקונומיקה. השעו מחדש את כדור ה-lentivirus בחצי עד מיליליטר אחד של XPBS קר. לאחר מכן חלקו את תמיסת ה-lentivirus ל-50 עד 100 מיקרוליטר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לבסוף, קבע את טיטר ה-lentivirus באמצעות טכניקה אמינה. בדרך כלל, צלחת תרבית של 10 סנטימטרים תייצר 50 עד 100 מיליון יחידות זיהומיות לפני שתמשיך בזיהום בתאים. קבע את ה-MOI של טיטר ה-lentiviral באמצעות ערכה או R-T-P-C-R להליך זה.

מומלץ MOI נמוך מ-4. התחל בזריעת התאים שיידבקו בצלחת של שש בארות לשטף של 30 עד 40% ותרבית אותם למשך הלילה. למחרת.

החלף את המדיום במיליליטר אחד של מדיום טרי המכיל פולי מוח או פרוטמין. לאחר מכן מוסיפים בין מיליון ל-2 מיליון יחב"ל. וירוס לנטי המכיל סמן פלואורסצנטי או אנטיביוטי.

נערו לאט את הצלחת למשך 10 שניות כדי לערבב ולדגור אותה במשך שש שעות. לאחר שש שעות, החלף את המדיום במדיום רגיל ושלם, והפיץ את התאים למשך יומיים. המדיה לא צריכה להכיל אנטיביוטיקה או משרים ללא קשר לנגיף הנטי המשמש לאחר יומיים.

הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה אם נגיף הלנטי מכיל סמן אנטיביוטי. כמו כן, הוסף משרה למחצית מהתרביות אם ה-lentivirus ניתן להשראה. לאחר תרבית התאים במשך יומיים או שלושה נוספים עם אנטיביוטיקה ומשרה, בצע ניתוח דם מערבי כדי לבדוק את הפלת גן המטרה לפני עיני טריפסין קסנוגרפל.

התאים מתרבית תאים גדולים כלים ותלויים אותם מחדש במדיום מקורי המכיל 50% מטריג'ל. חיוני לשמור על תאי סרטן תלויים וב-50% מטריג'ל והמזרק על קרח. אחרת, קיים סיכון שהמטריג'ל יתמצק והזיהום יצטרך להתגבר על זה.

הכן את אתר הניתוח על ידי ניקויו ביסודיות עם אתנול 70% ובצע את ההרדמה עם אוורור מעולה ומסנן נבלות פלואור איזוף המחובר לתא האינדוקציה. להרדים עכברים עירומים עם תימוס באמצעות 2% איזוף פלואור מעורבב עם 1.5% חמצן שלוש עד חמש דקות לפני חיסון התאים. לאחר מכן שמור על ההרדמה באמצעות 2% פלואור מעורבב עם חמצן דרך חרוט אף.

מקם את העכבר על כרית חימום המוגדרת ל-30 מעלות צלזיוס. טען את התאים למזרקים עם מחטים בגודל 25 וחצי להזרקות תת עוריות, או מחטים בגודל 28 עד 30 לזריקות אורתוטופיות. חמש דקות לאחר השראת ההרדמה באתר אחד או שניים, יש להזריק בין 1 ל-10 מיליון תאים בבולוסים של 200 מיקרוליטר.

מספר התאים תלוי בממאירות או באגרסיביות של תאים סרטניים. עבור וקטורים פעילים מבחינה מכוננת, השתמש בשתי קבוצות של עכברים שהוזרקו עם התאים המבטאים את גן המטרה S-H-R-N-A או פורטט מקושקש S-H-R-N-A על וקטורים. השתמש באותן שתי קבוצות וחלק כל אחת מהן לתת-קבוצות שהן או לא מסופקות משרה במים שלהן.

החלף את הרופאים המכילים מים פעמיים בשבוע. עקוב אחר נפח הגידולים מדי שבוע או שבועיים עם C.ודא שנפח הגידול אינו חורג מהמגבלה המוסדית או ה-CUC והמתת חסד של כל בעלי חיים המראים כיב נרחב, זיהום ברור נמק, דימום בלתי נשלט או מחלה סופית. כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול והגרורות באמצעות סמן ביולומינסנט יש לחטא את אזור העבודה ולהרדים את העכברים בתא הדמיה בהרדמה גזית.

ראשית, בצע חשיפה של שתיים עד חמש דקות ובדוק את עוצמת האות ולאחר מכן התאם בהתאם. אם גודל הגידול עולה על 1000 מילימטרים מעוקבים או מגבלת גודל מוסדית, המתת חסד של החיה בעת ההקרבה, תעד את גודל הגידול ושמור אותם להמשך ניתוח. פרוטוקול זה שימש לחקר ההשפעות של מדוע Y נוקדאון אחד על היווצרות גידול קסנוגרפט של לוציפראז המבטא תאי אדנוקרצינומה בשד אנושיים שהושתלו בעכברים עירומים אתימיים.

רצף המטרה S-H-R-N-A של YY אנושי ו-S-H-R-N-A מקושקש, שלא היה לו דמיון משמעותי לשום תעתיק אנושי ידוע נבדקו. כתוצאה מכך, נבנו שני וקטורים לנטי-ויראלים ושימשו לייצור שני לנטי-וירוסים. שניהם שימשו להדבקת שתי אוכלוסיות תאים שונות והתקבלו אוכלוסיות תאים רב-שבטיות.

לאחר בחירת פור מיצין. ניתוח דם מערבי אישר שה-DS גרם ל-YY נוקדאון אחד בשורות התאים הנגועים הללו. לאחר מכן, אוכלוסיית התאים הפוליקלונליים של שיבוט 3 שנדבקה ב-YY ONE S-H-R-N-A הניתן להשראה והביקורת. ס-ה-ר-נ-א.

נגיפי LENTIVIRUS שימשו לבדיקת ההשפעות של דלדול YY אחד על פלישה. ראינו כי דלדול אחד של YY הפחית את הפולשניות של התאים. ניתוח דם מערבי אישר שרופאים גרמו להשתקת YY אחת בתאים עם אינדו YY אחד S-H-R-N-A, בעוד שתאים המכילים בקרה.

S-H-R-N-A לא הראה השפעה זו. תאים אלה שימשו לאחר מכן במחקר מודל עכברי xenograft בהשוואה לקבוצות הביקורת indu, YY עכברים מושתלים S-H-R-N-A שסופקו עם ה-DOS המכילים מים הראו היווצרות גידול מופחתת משמעותית כאשר הודגמו על ידי ביולומינסנציה וכאשר משקל הגידול נמדד כצפוי. YY השתקה אחת בגידולי קסנוגרפט אלה אושרה בקלות על ידי כתם מערבי.

מחקרים: אל תשכח שעבודה עם לנטי-וירוס עלולה להיות מסוכנת ביותר על פי שיקולי הבטיחות של ה-NIHB למחקר עם וקטורים לנטי-ויראליים נדרשים נהלי בלימה משופרים ברמת בטיחות B שתיים, בכל הגדרות המעבדה.