Name: וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: למדו כיצד להשתמש ב-RNAi מבוסס וקטור DNA לחקירת תפקוד גנים בסרטן. השיטה מאפשרת השתקת גנים לטווח ארוך בתאים יציבים ובמודלים של קסנוגרפיה אינ-ויוו, ומסייעת להבין תהליכים ביולוגיים מרכזיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר המלומדת (116403-RSG-09-082-01-MgO) של האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן וקופות המיפוי של אוניברסיטת Wake Forest למדעי הבריאות ל GS. DBS נתמך על ידי NCI אימון מענק 5T32CA079448.

<ol><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncog%22%5BJournal%5D)">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li>
<li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li>
<li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li>
<li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+%28MOI%29+for+predicting+gene+transfer+events%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Vaccines+Ther%22%5BJournal%5D)">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6(2004).</li>
<li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li>
<li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

פרוטוקול זה מתאר שיטה להפיל הגן באמצעות shRNA ולדמיין ההשפעה הביולוגית שלה באמצעות הדמיה bioluminescent גידול תאים סרטניים in vivo. אתר היעד של shRNA לא יכילו כל אחד משלושת אתרי הגבלה (BamHI, HindIII ו EcoRI) משמש עבור subcloning. בתרחיש נדיר כאשר כל אחד מהאתרים הללו קיים, אנזים הגבלה נוספת שניתן להשתמש בהם כדי להחליף אותו ביצירת מבנה. צעדים מרכזיים בפרוטוקול זה תאיץ את בניית וקטורים lentiviral shRNA. רא...

בנוסף ציוד מעבדה נפוצה המשמשת RNA וניתוח חלבון ו תרבית תאים, חומרים הבאים ריאגנטים נדרשים עבור פרוטוקול זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית מתאים הבלימה ברמת בטיחות ביולוגית 2 הממשלה </td></tr><tr><td> PCR thermocycler </td></tr><tr><td> Ultracentrifuge </td></tr><tr><td> הרדמה, אינדוקציה קאמרית עם אוכלי נבלות isoflurane </td></tr><tr><td> Digital Vernier קליפר </td></tr><tr><td> IVIS הדמיה המערכת </td></tr><tr><td> המוסמכות ביותר DH5a החיידק אשריכיה קולי </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, &amp; HindIII הגבלה אנזימים </td></tr><tr><td> האנזים T4 DNA </td></tr><tr><td> הדור השלישי lentivirus אריזה פלסמידים VSV-G, pRSV-Rev ו pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> רשימת חומרים

וקטור מבוסס dna התערבות rna ללמוד לתפקד גנים סרטן

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

התערבות RNA (RNAi) מעכב ביטוי גנים על ידי mRNAs יעד משפילים במיוחד. מאז גילויו של פעמיים תקועים התערבות RNA קטן (siRNA) בגן ההשתקה 1, RNAi הפך לכלי רב עוצמה המחקר במחקרים תפקוד הגן. לעומת מחיקה גנטית, RNAi בתיווך להשתקת גנים בעל יתרונות רבים, כגון הקלות שבה היא מתבצעת והתאמתו שורות תאים ביותר. מחקרים רבים הדגימו את היישומים של טכנולוגיית RNAi בחקר הסרטן. בפרט, פיתוח טכנולוגיית ה-DNA וקטור מבוסס לייצר סיכת ראש RNA קטן (shRNA) מונע על ידי U6 או האמרגן H1 הפכה לטווח ארוך הגן מושרה להשתיק 2,3 אפשרי. השימוש בו בשילוב עם וקטורים ויראליים מהונדסים גנטית, כמו lentivirus, מקלה על יעילות גבוהה של משלוח shRNA ו / או אינטגרציה לתוך הדנ&quot;א הגנומי לביטוי shRNA יציב. אנו מתארים detaileהליך D באמצעות וקטור מבוססי טכנולוגיית ה-DNA RNAi לקבוע תפקוד הגן, כולל בנייה של וקטורים lentiviral המבטאים shRNA, ייצור lentivirus וזיהום התא, ומחקרים תפקודית באמצעות מודל xenograft העכבר. אסטרטגיות שונות דווחו ביצירת מבנים shRNA. פרוטוקול המתואר כאן העסקת הגברה PCR ו קשירת 3-שבר יכול לשמש ישירות וביעילות ליצור shRNA המכילים מבנים lentiviral מבלי לעזוב כל הצמוד נוקלאוטיד נוסף ברצף shRNA קידוד. מאז shRNA ביטוי קלטות שנוצרו על ידי אסטרטגיה זו ניתן לגזור על ידי אנזימי הגבלה, הם יכולים להעביר בקלות וקטורים אחרים עם סמנים ניאון או אנטיביוטיקה שונים. ריאגנטים transfection המסחריים יכולים לשמש בייצור lentivirus. עם זאת, בדו&quot;ח זה, אנו מספקים שיטה כלכלית באמצעות סידן זרחתי משקעים כי ניתן להשיג על יעילות transfection של 90%293T תאים. לעומת מכוננת וקטורים shRNA הביטוי, מערכת shRNA מושרה מתאים במיוחד כדי לדפוק את הגן חיוני התפשטות תאים. אנחנו מדגימים להשתקת גנים של ין יאנג 1 (YY1), oncogene פוטנציאל בסרטן השד 4,5, על ידי ט במערכת מושרה shRNA והשפעתו על היווצרות הגידול. מחקר באמצעות lentivirus מחייב סקירה ואישור פרוטוקול בטיחות ביולוגית על ידי ועדת בטיחות ביולוגית של המוסד של החוקר. מחקרים באמצעות מודלים של בעלי חיים מחייבת בדיקה ואישור של פרוטוקול בעלי חיים על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (ACUC) במוסד של החוקר.

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת הגן<em&gt; In vivo</em&gt;.

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

השתקה של RNA (RNA interference - RNAi) מעכבת ביטוי גנים על ידי פירוק ספציפי של mRNA מטרה. מאז הגילוי של RNA התערבות קטן ודו-גדילי...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את תפקוד הגן באמצעות השתמשת בהשתקה של RNA (RNA interference) מבוססת וקטור DNA. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תכנון ויצירה של מבני S-H-R-N-A המכוונים לגנים ספציפיים. השלב השני הוא הפקת לנטי-וירוס הנושא את קסרת הביטוי של ה-SH RNA.לאחר מכן, קווי תאים יציבים נוצרים על ידי הדבקת תאים בלנטיבירוס, והתאים שהודבקו בלנטיבירוס משמשים במגוון בדיקות in vitro ו-in vivo כדי לקבוע את ההשפעות של השתקת הגן הנחקר. בסופו של דבר, בהתאם לבדיקות שנבחרו, התוצאות עשויות להראות שינויים ביכולת הגונוגנית של התאים כתוצאה מהנמכת ביטוי הגן (knockdown), באמצעות בדיקות proliferaton, migration ו-invasion in vitro, וכן באמצעות מודלים של xenograft formation in vivo. את הפרוצדורה ידגימו Daniel Stowell ו-ma Juan; דניאל הוא סטודנט לתואר מחקר במעבדה שלי, ו-Ma היא טכנאית.צ'אנג הוא עמית פוסט-דוקטורט. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מחקר הסרטן, כגון האם לגן ספציפי יש תפקיד בהתפתחות ובהתקדמות הסרטן, ולאילו היבטים של תהליכים אלה הוא עשוי להיות חשוב. כדי להתחיל, תכננו והזמינו את האוליגונוקלאוטידים על בסיס הקריטריונים המתוארים: שני אוליגואים משלימים הפוכים המכילים את רצף המטרה בן 20 עד 23 הנוקלאוטידים בגן המטרה.הם יצרו אתרי EcoR1 ו-HindIII בשני הקצוות. לאחר ביצוע ליגציה, אולי

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד...

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

מקור: Fuchs, M. ואח'. אדנופקציה: שיטה לחקר תפקידם של מלווים מולקולריים (Molecular Chaperones) במורפודינמיקה תאית באמצעות ניסויי דלל-הצלה (Depletion-Rescue). J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הובלה באמצעות אדנווירוס של טרנסגן פלואורסצנטי בשילוב עם טרנספקציית siRNA–calcium phosphate בתאי סרטן של צוואר הרחם. האדנווירוס מבטא חלבון מחליף פלואורסצנטי, בעוד שה-siRNA משרה דגרדציה ממוקדת של mRNA באמצעות קישור ל-RISC. קו-טרנספקציה רצפית זו מאפשרת knockdown סימולטני של החלבון האנדוגני והצלה (rescue)...

טרנסדוקציה אדנו-ויראלית משולבת עם השתקה מתווכת siRNA בתאי סרטן

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

אנו מציגים פרוטוקול להפגין מערכת העברת גנים סומאטית הרומן ניצול RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם העכבר כדי ללמוד את הפונקציה של גנים גרורות. העופות רטרווירוסים נמסרות intracardiacally כדי להבטיח העברה גנטית לתוך נגעים טרום ממאירים, לא פולשנית של תאי β בלבלב בעכברים בוגרים.

זיהוי ואפיון הגורמים גרורתי על ידי העברה גנטית לתוך הרומן RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם מאתר

כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.

ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

גנים רבים מעודכנים, מעודדים נדידה ופלישה של תאי גידול, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה. קביעה אילו גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול היא קריטית. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקר ההשפעות של ביטוי מוגבר של גן על נדידה ופלישה של תאי גידול בזמן אמת.

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה אינטרדוקטלית של וקטורים נגיפיים דרך הטיט כדי להעביר גנים מעניינים לתאי אפיתל החלב.

ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

מחקר זה מציג מערכת CRISPRi כפולה המכוונת ל-RNA ארוכים שאינם מקודדים בתאי מלנומה. הוא מאפשר הפלת גנים קומבינטוריים ובדיקה קטלנית סינתטית, זיהוי אינטראקציות lncRNA ספציפיות לסרטן לאסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

אסטרטגיית הפרעות CRISPR כפולות למיקוד אינטראקציות קטלניות סינתטיות בין RNA לא מקודדים בתאים סרטניים

למדו כיצד להשתמש ב-RNAi מבוסס וקטור DNA לחקירת תפקוד גנים בסרטן. השיטה מאפשרת השתקת גנים לטווח ארוך בתאים יציבים ובמודלים של קסנוגרפיה אינ-ויוו, ומסייעת להבין תהליכים ביולוגיים מרכזיים.

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

גלה סרטונים נוספים