Name: בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: למדו לבודד ולגדל תאי עצב לפסגה מצינור עוברי עצבי של עכברים בשיטה יעילה ללא צורך במיון תאים או שכבות תומכות. הפרוטוקול מספק אוכלוסייה טהורה של 96% לחקר תכונות תאי העצב לפסגה ותהליכי התמיינות בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות מארק ווזניאק לסיוע וידאו. אנו רוצים גם להודות שון מוריסון ב UT Southwestern בפרוטוקול המקורי של עכברים לתאים culturing NC. עבודה זו נתמכה הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט מרכז התמיכה של תוכנית אקדמית על ידי תרומות של NIH (HD36720 HD036720 ו-11S109) ו 11GRNT7690040 AHA ל PAL, מלגות predoctoral של AHA (0615209B) ו-NIH (NS065604) לווייטנאם, היה ה-ERP נתמך על ידי מתן הכשרה NIH T32HD007502.

1. הכנת פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה סטרילית בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fibronectin (FN) על ידי דילול 100 μL מלאי אדם FN פלזמה לתוך נפח סופי של 3.3 מ&quot;ל ב PBS Dulbecco של (dPBS). הריכוז הסופי הוא 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​וזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים תחתית של כל אחד בצלחת סטרילית התרבות 4 רקמות היטב עם פתרון FN ולתת לשבת במשך 15 דקות. ודא את כל פני השטח מכוסה. הפוך את התקשורת במהלך תקופה זו (שלבים 2 ו -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחוץ Fn פתרון ולאפשר צלחות לייבוש. בעדינות ולשטוף בארות עם 500 DMEM μL, הסר DMEM, ולהוסיף 500 μL של התחדשות עצמית (SR) בינוני (ראו להלן). דגירה על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכילה 5 אחוז CO 2. להשלים כשעה לפני החיתוך כך הצלחות יהיה יבש לפני השימוש. </li></ol> 2. הכנת בינוני SR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות של NC מחנק והגומתוך עשרה עוברי (כ 1 המלטה, בהתאם לרקע הגנטי של הקו העכבר), להכין 25 מ&quot;ל של מדיום SR. שלב 12.5 מ&quot;ל גלוקוז נמוכה DMEM, 7.5 מ&quot;ל Neurobasal בינוני, 25 חומצה retinoic μL (117 מיקרומטר הריכוז הסופי), ו 25 μL 2-mercaptoethanol (50 mM הריכוז הסופי). מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף צ&#39;יק 3.75 מ&quot;ל תמצית העובר, 250 μL N 2 תוספת מלח, 500 μL תוסף B27 ו 250 μL פניצילין, סטרפטומיצין (הריכוז הסופי 1%). סינון בינונית דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 IGF1 סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ריכוז סופי) ו - 20 bFGF סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בריכוז הסופי). מערבבים על ידי היפוך. לאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 3. הכנת בינוני Wash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כ 10 עוברים להכין 50 מ&quot;ל של מדיום שטיפה. שלב 50 מ&quot;ג BSA עם 35 מ&quot;ל גלוקוז DMEM נמוך, בינוני 15 מ&quot;ל Neurobasal, ו 500 μL פניצילין, סטרפטומיצין (1% ריכוז סופי). מסנן סטריליים עם 0.22מיקרומטר הסינון. </li></ol> 4. הכנת collagenase / dispase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase / dispase עד 5 dPBS מ&quot;ל. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק מסנן עם 0.2 מיקרומטר לסנן ולהוסיף 1.5 מ&quot;ל לתוך כל אחת משלוש הבארות של צלחת 12 באר. פיפטה כ 1 מ&quot;ל בינוני לשטוף את הבארות הנותרות. אחסן את כל הצלחת על הקרח עד מוכנים לעכל את הרקמה גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור קצות קצה פיפטה P20 ו p1000 מסנן בסכין גילוח סטרילית. גזור מתחת הקצה המחודד של קצה. לחתוך את p1000 ישמש להעביר את העובר כולו תוך P20 ישמש להעברת פיסות רקמה מבודדת. </li></ol> 5. בידוד מחנק צינור Trunk עצבית מ 9.5 עוברים DPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הריונות זמן קבועים, סכרים עם תקע הנרתיק נחשבים 0.5 DPC בצהריים בבוקר תקע הוא ציין. להקריב את ולהסיר את הרחם ב 9.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את decidua מהרחם בעדינות Remove העובר מן decidua. חוויתי פעם אחת עם פרוטוקול זה, לבודד 3-4 9.5 עוברים DPC בכל פעם dPBS סטריליים. השתמש בטכניקה סטרילית ומכשירים הנתיחה מעוקרות. מכשירים ניתן לעקר על ידי עיקור, מעוקר חום או דגירה של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הקדמי מחנק NC: באמצעות מחטים אינסולין, לחתוך את הצינור העצבי על placode otic באמצע. חותכים שוב בקצה האחורי של somite 4 ה. חתוך הרקמה הגחון כדי הצינור העצבי להסיר את הקשתות הגרון והלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור NC הגזע: באמצעות מחטים אינסולין, להסיר את החלק של הצינור העצבי בין somites 16-22 (או somite האחרון אם הם עוברים שלב התפתחותי מוקדם יותר מאשר 22 somite). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את שק החלמון וכל רקמה עוברית הנותרים עבור genotyping. </li></ol> 6. הסרת האאקטודרם ללא עצבית והמזודרם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצינור העצבי המכיל קטעים לתוך collagenase / dispase בטמפרטורת החדר למשך 10 דקותs. מיד לשטוף בינוני לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור רקמות dPBS סטריליים. שימוש במחטים סטריליות אינסולין, הוצא בעדינות האאקטודרם לא העצבית מרקמת ולהפריד את somites מן הצינור העצבי. החלקים האחרונים של והמזודרם מרקמות somite ניתן להסיר על ידי triturating בעדינות באמצעות חתך למטה P20 עצה. להיזהר לא לפגוע בצינור העצבי. להתבונן מקרוב במהלך טחינה דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור העצבי מבודד באמצעות שטיפה 2 ו 3 2 30 בינוני לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם בינוני SR, ומקום בצינור העצבי מבודד למרכז גם FN מצופה שהוכנה קודם לכן (שלב 1.3). ללחלח את החדר היפוקסיה עם צלחת של מים סטריליים. מניחים את הצלחת לתוך תא היפוקסיה ולשטוף את החדר בגז מעורבת על 3% O 2 (להשתמש במיכל המכיל תערובת של 1% מ 2, 6% CO 2, 93% N 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד להתמודד עם הקאמרית מאוד בזהירות כדי להבטיח thaexplants T הם באין מפריע ולהישאר במרכז וולס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 ° C. סיכום של צעדים 5-6 מוצג באיור 1. </li></ol> 7. הסרת בצינור העצבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, הסר בצינור העצבי על ידי בעדינות מתגרה קצה הצינור העצבי מן התאים הנודדות באמצעות מחט סטרילית אינסולין. הסר וזורקים בצינור העצבי ממדיום באמצעות חתך P20 סטרילית כמו בשלב 6.2 ולהחליף בינוני עם בינוני SR טרי (איור 2). הדבר נעשה בקלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. </li></ol> 8. נציג תוצאות לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס בתנאי חוסר חמצן, תאים צפון קרוליינה היגרו מן הצינור העצבי באוכלוסייה טהור כמעט (איור 3 א). לפעמים, פחות תרבויות אידיאליים לא תניב בצמחים חזקים. לדוגמה, ייתכן כי לאחר 24 שעות לאהוא בצינור העצבי יהיה מכורבל על עצמה ו NC לא יעברו מן הצינור העצבי (איור 3 ב). מדי פעם בצינור העצבי לא יצרף את הצלחות מצופה fibronectin. מניסיוננו, תת אופטימלית הגירה NC או בעיות עם החיבור של הצינור העצבי יכול להיות מושפע לרעה בתנאי normoxia או ריכוז של fibronectin, בהתאמה. הפעילות האנזימטית של collagenase / dispase משתנה מעט על ידי אצווה זמן עיכול חייב להיות מותאם כראוי, לעומת זאת, לא לעכל את הרקמה יותר מרבע שעה. Overdigestion של הצינור העצבי המכיל רקמות collagenase / dispase תגרור בצמחים לקויה. אם הרקמה somite לא יוסר בקלות לאחר דגירה של collagenase / dispase של הצינור העצבי, הצינור העצבי ניתן מודגרות למשך זמן ארוך יותר מעשר דקות. לפעמים בצינור העצבי לא לצרף המצע. אם זה המקרה, בדוק fibronecפח ריכוז ותנאי חוסר חמצן. למרות התנאים normoxic ניתן wild-type תרבות NC, תנאי חוסר חמצן לחקות באופן הדוק יותר בסביבה vivo 29,30. מניסיוננו, בתנאי חוסר חמצן הפכה קריטית כאשר culturing מוטציה NC. לדוגמה, כאשר Foxd3 מוטציה NC היו בתרבית בתנאים normoxic, היה המטען NC תוצאה תא הקטינה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת. פער זה בגודל תוצאה הוסר כאשר explants היו בתרבית בתנאי חוסר חמצן (איור 4). יתר על כן, כאשר wild-type explants בצינור העצבי היה מתורבת normoxia, מספר caspase-חיוביים בתאים היה גדול יותר מזה של explants דומים בתרבית היפוקסיה (מידע לא מוצג). על ידי שמירה על כל התרבות NC ב היפוקסיה, השוואות יכולים יותר בקלות בין הדינמיקה של שליטה ותרבויות מוטציה. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="איור 1" /> <strong<html> &gt; באיור 1. סכמטית כוללת של בידוד NC. א) לנתח אזורים של עניין מן העובר. ב) לקט בצינור העצבי של collagenase / dispase עשר דקות (לא יעלה על רבע שעה). ג) לשטוף בינוני לשטוף. D) לנתח משם האאקטודרם לא עצבית והמזודרם. EF) לשטוף פעמיים בינוני לשטוף. ז) צלחת בינונית התחדשות עצמית. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב 3% O 2 בתנאי חוסר חמצן. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הסרת בשלבים של הצינור העצבי מן explant. הצינור העצבי יש להסיר לאחר 24-48 שעות על מנת למנוע זיהום עם לא-NC תאים. א) הודעה הגבול בין הצינור העצבי ואת תולדה NC (קו מוצק). ב) גזור לאורך הקצה של הצינור העצבי עם מחט האינסולין. ג) מחק בצינור העצבי ולהחליף בינוני עם בינוני עצמית חדשה והתחדשות. קו מקווקו מציין היקף תוצאה. קיצור: NT, בצינור העצבי. &gt; <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. דוגמאות מייצגות תוצאות. א) תוצאה explant בדרך כלל אחרי 24 שעות הדגירה במדיום התחדשות עצמית בתנאי חוסר חמצן (קו מקווקו מציין היקף תוצאה). ב) יתגדל לאור תוצאה NC לאחר 48 שעות בתרבית. ג) תרבות אידיאלי פחות עם תשואה תוצאה נמוכה. A ו-C היו בתרבית בתנאים זהים. תמונות להדגים את טווח טבעי חוסן התרבות. זה יכול להיות מושפע יעילות הבידוד בצינור העצבי, ריכוז של FN, תנאי חוסר חמצן, ולאחר זמן collagenase / dispase digestions. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. בניתוח חוץ גופית של תרבויות צפון קרוליינה explant ב normoxia לעומת היפוקסיה. בקרה (סוג בטבע) צפון קרוליינה התאים נדדו מן explants בצינור העצבי לאחר 48 שעות בתנאים תרבות normoxic. לעומת זאת, מוטציה Foxd3NC לא פחותה בהרבה בצמחים תא normoxia (סימן אדום לרמות שולי בצמחים NC). כאשר explants דומים גדלו בתנאי חוסר חמצן, Foxd3 מוטציה explants צפון קרוליינה גברה comparably לבקרות, המאפשר ניתוח שלאחר מכן. שימו לב, התנהגות זו קשורה גם עם התנהגות של Foxd3 מוטציה NC in vivo.

<ol><li>Le Douarin, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLe+Douarin%2C+N+%22The+neural+crest%22">The neural crest</a>. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).</li>
<li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration%3A+patterns%2C+phases+and+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Developmental biology. 344, 566-568 (2010).</li>
<li>Saint-Jeannet, J. -P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaint-Jeannet%2C+J-P+%22Neural+crest+induction+and+differentiation%22">Neural crest induction and differentiation</a>. , Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).</li>
<li>Plank, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+and+timing+of+arrival+of+murine+neural+crest+on+pancreatic+beta+cell+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation.</a> Developmental biology. 349, 321-330 (2011).</li>
<li>Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+neural+crest+regulate+beta-cell+mass+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas.</a> Development. 135, 2151-2160 (2008).</li>
<li>Freem, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre%3BYFP+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> J. Anat. 217, 651-664 (2010).</li>
<li>Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+approach+to+the+problem+of+neural+crest+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A clonal approach to the problem of neural crest determination.</a> Developmental biology. 46, 262-280 (1975).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+quail+neural+crest+cells%3A+they+are+pluripotent+and+differentiate+in+vitro+in+the+absence+of+noncrest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells.</a> Developmental biology. 80, 96-106 (1980).</li>
<li>Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+precursors+for+neural+and+mesectodermal+derivatives+in+the+cephalic+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest.</a> Development. 112, 301-305 (1991).</li>
<li>White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cells+undergo+cell-intrinsic+developmental+changes+in+sensitivity+to+instructive+differentiation+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals.</a> Neuron. 29, 57-71 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification%2C+isolation+by+flow+cytometry%2C+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+avian+neural+crest%3A+migration+and+maturation+of+mixed+neural+crest+clones+injected+into+host+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos.</a> J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).</li>
<li>Chung, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+property+of+postmigratory+cranial+neural+crest+cells+and+their+utility+in+alveolar+bone+regeneration+and+tooth+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development.</a> Stem Cells. 27, 866-877 (2009).</li>
<li>Biernaskie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKPs+derive+from+hair+follicle+precursors+and+exhibit+properties+of+adult+dermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).</li>
<li>Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0+and+PMP22+mark+a+multipotent+neural+crest-derived+cell+type+that+displays+community+effects+in+response+to+TGF-beta+family+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors.</a> Development. , 126-3781 (1999).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+isolation+of+enteric+nervous+system+progenitors+using+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2.</a> Stem Cells. 29, 128-140 (2011).</li>
<li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+in+reduced+levels+of+oxygen+promotes+clonogenic+sympathoadrenal+differentiation+by+isolated+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.</a> J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).</li>
<li>Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+clonal+analysis+of+mouse+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">In vitro clonal analysis of mouse neural crest development.</a> Developmental biology. 157, 517-525 (1993).</li>
<li>Etchevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+chick%2C+mouse+or+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells.</a> Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).</li>
<li>Mundell, N. A., Labosky, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cell+multipotency+requires+Foxd3+to+maintain+neural+potential+and+repress+mesenchymal+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates.</a> Development. 138, 641-652 (2011).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development. 133, 99-106 (2006).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling+is+essential+for+cranial+neural+crest+migration+and+trigeminal+ganglion+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation.</a> Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).</li>
<li>Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrins+and+N-cadherin+coordinate+to+control+the+pattern+of+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia.</a> Development. 133, 4839-4847 (2006).</li>
<li>Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin%2Fneuropilin+signaling+influences+the+positioning+of+migratory+neural+crest+cells+within+the+hindbrain+region+of+the+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick.</a> Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).</li>
<li>Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+signaling+guides+neural+crest+cells+to+coordinate+pathway+choice+with+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).</li>
<li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).</li>
<li>Ivanovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+or+in+situ+normoxia%3A+The+stem+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm.</a> J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן בשלב ההתפתחותי של העובר על מנת להבטיח את ההצלחה של גישה זו. ספירת somites של עוברי עכברים מוקדם הוא קריטי גם לשלב התאמת עוברים בתוך פסולת וקביעת אזורים הנכונות של הצינור העצבי של בידוד. וריאציה של אחד או שניים somites בין העוברים נמצא בטווח סביר של עיתוי התפתחותי, תלוי ברזולוציה של הניסוי שנערך. העובר בין 9 ל 9.5 DPC תהיה בין 17 ו -25 somites. אם לעובר יש יותר מ -25 somites, צפון קרוליינה היא מתקדמת עוד יותר בזמן התפתחותית, ואת בצמחים צפון קרוליינה יהי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM (גלוקוז נמוכה) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal בינוני </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> dPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354037 </td><td> חנות 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> BD Biosciences </td><td> 354060 </td><td> חנות 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Gibco </td><td> 33016-015 </td><td> מאוחסן 1mg/mL אלiquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Retinoic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> R2625 </td><td> חנות 35 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots לאחר לשחזר באתנול ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> D-5637 </td><td></td></tr><tr><td> N 2 תוספת </td><td> Gibco </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> תוסף B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Steriflip 0.22 מיקרומטר מסננים </td><td> Millipore </td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> מסננים 0.20 מיקרומטר </td><td> קורנינג </td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td> מזרקים (לסינון) </td><td> BD Biosciences </td><td> 301604 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> ארבע צלחות גם </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> רוש </td><td> 269 ​​638 </td><td> פעילות משתנה לפי אצווה. חנות 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> אינסולין מחטים (29 מד ½) </td><td> בקטון דיקסון </td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td> היפוקסיה הקאמרית </td><td> Billups-רוטנברג </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חמצן Analyzer </td><td> Billups-רוטנברג </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים # 5 </td><td> מדע כלים עדינים </td><td></td><td> להסרת הרחם decidua. </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA (0.25%) </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית murine

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

עובריים עצביים לפסגה (NC) היא האוכלוסייה אבי multipotent שמקורו ב היבט הגב של הצינור העצבי, עובר אפיתל המעבר mesenchymal (EMT) ו נודד ברחבי העובר, והוליד סוגי תאים שונים 1-3. NC גם יש את היכולת הייחודית להשפיע על התמיינות והתבגרות של אברי המטרה 4-6. כאשר explanted במבחנה, אבות צפון קרוליינה לעבור עצמית והתחדשות, להעביר להתמיין למגוון של סוגי רקמות כולל נוירונים, גליה, תאים שריר חלק, סחוס ועצמות. Multipotency NC תוארה לראשונה מ explants של הצינור העצבי העופות 7-9. בבידוד מבחנה של תאים צפון קרוליינה מאפשר לימוד NC Dynamics כולל התפשטות, הגירה, ו multipotency. עבודה נוספת במערכות העופות ואת העכברים הראו כי explanted תאים צפון קרוליינה NC לשמור על הפוטנציאל שלהם כאשר מושתלים בחזרה העובר 10-13. בגלל מאפיינים אלה הסלולר הטמונות נשמרים explanted אבות צפון קרוליינה, assay עצבית explant הצינור מספק אופציה אטרקטיבית ללימוד NC במבחנה. כדי להשיג הבנה טובה יותר של NC יונקים, שיטות רבות הועסק לבודד אוכלוסיות NC. NC-derived אבות יכול להיות מתורבת מתוך הפוסט נודדות למקומות בעובר וגם למבוגרים ללמוד את הדינמיקה של פוסט נודדות אבות צפון קרוליינה 11,14-20 עם זאת הבידוד של אבות צפון קרוליינה כפי שהם להגר הצינור העצבי מספק שימור מיטבי של NC תא הפוטנציאל ומאפיינים נודדות 13,21,22. פרוטוקולים מסוימים להעסיק תא הקרינה מיון מופעל (FACS) כדי לבודד את האוכלוסייה NC מועשר עבור אבות מסוימים 11,13,14,17. עם זאת, כאשר החל עוברים בשלבים מוקדמים, מספרים סלולריים הולמים עבור ניתוחים קשה להשיג עם FACS, שמסבך את בידודה של צפון קרוליינה מוקדם populatioNS מעוברים בודדים. כאן, נתאר גישה זו אינה מסתמכת על FACS ותוצאות ב האוכלוסייה כ 96% טהור NC על פי כתב Wnt1-Cre שושלת הופעל 23. השיטה המוצגת כאן הוא עיבוד פרוטוקולים מותאם לתרבות של עכברוש NC 11,13. יתרונותיה של פרוטוקול זה לעומת שיטות קודמות הן כי 1) התאים לא גדלים על שכבה מזין, 2) FACS לא נדרש לקבל האוכלוסייה טהור יחסית NC, ​​3) premigratory תאים צפון קרוליינה מבודדות 4) התוצאות בקלות לכמת. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש הבידוד של צפון קרוליינה מהמודל כל עכבר מוטנטי, להקל על מחקר של מאפיינים צפון קרוליינה עם מניפולציות גנטיות שונות. הגבלה של גישה זו היא כי NC מוסר בהקשר של העובר, אשר ידוע להשפיע, הישרדות הגירה והבחנה של NC 2,24-28.

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את השימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; שיטות לחקר ההגירה, התחדשות עצמית, ו multipotency של הרכס העצבי.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

הרכס העצבי (NC) העוברי הוא אוכלוסיית תאי מוצא רב-פוטנציאלית שמקורו בחלק הדורסלי של צינור העצבים, והוא עובר מעבר מאפיתל ל...

הקדישו שלוש שעות לביצוע פרוטוקול זה. לאחר שתצברו ניסיון, ביצוע הפרוטוקול אמור לארוך בין שעה וחצי לשעתיים, תלוי במספר העוברים שיבוצע להם דיסקציה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע חיתוך של עובר ביום 9.5 לאחר ההפריה (9.5 days post cort), בגובה הלוח האוטי (otic plaque) ובגובה סומייט 4, כדי לבודד רקמה המכילה את צינור העצבים הוואגלי (vagal neural tube). חיתוך.בסומייטים 16 ו-22 נבודד רקמה המכילה את צינור העצבים של הגו. תאי רב-עצביים וגאליים נודדים מצינור העצבים הוגאלי. בעוד שתאי רב-עצביים של הגו נודדים מצינור העצבים של הגו, הרקמה המבודדת תעבור עיכול אנזימטי בתמיסת collagenase, תשטף, והאפידרמיס והמזודרם שאינם עצביים יוסרו באמצעות דיסקציה.את צינור העצב המבודד יש לשטוף פעמיים נוספות ולאחר מכן להעבירו למצע לחידוש עצמי. אני אליס גראף מהמעבדה של בוסקי באוניברסיטת ונדרבילט. היום אדגים כיצד לבודד את רכס העצבים מתוך צינור העצב בתרבית explan.טכניקה זו תאפשר לכם לחקור את מאפייני הרכס העצבי In vitro. בואו נתחיל. התחילו בדילול של 100 µL של fibronectin בריכוז 1 mg/mL לתוך 3.2 mL של DPBS סטרילי.הוסיפו כמות מספקת של תמיסת fibronectin בריכוז 30 microgram per milliliter כדי לכסות את תחתיתו של כל באר בלוח של ארבעה בארות. הקישו בעדינות על פינות הלוח כדי להבטיח שכל באר מכוסה באופן אחיד. השאירו את הלוח בצד בזמן הכנת

isolation-culture-neural-crest-cells-from-embryonic-murine-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מתאר את שיטת לבידוד של neuroprecursors מהקורטקס המתפתח של עכברים עובריים. ההליך להסרת עוברים מן הרחם, לנתח את רקמת קליפת המוח, ולעכל את קליפת המוח מבודד מוצג.

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

כאן אנחנו מראים השיטה שלנו לבודד אפידרמיס עכבר לתאי גזע עצביים לפסגה (EPI-NCSC). טכניקה מערבת מיקרו לנתח זקיקי השערה, בידוד בליטה ו placeing אותו בתרבית רקמה. EPI-NCSC להתחיל להגר explants בליטה על גבי תשתית בתוך 3-4 ימים.

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

כדי לטפח גזע עצביים לפסגה תאים (NCSC) במבחנה, בינוני מיוחד (NCSCM) נדרשת. חלק חיוני של NCSCM הוא עובר אפרוח לחלץ (CEE). כאן אנו מתארים טכניקות מדויקות כדי לייצר כמות מוגדל של איכות CEE טהור גבוהה, כולל פרטים כמו בידוד, מסמוס, צנטריפוגה, תהליכי סינון.

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

מאמר זה מציג פרוטוקול חזק לבידוד ולתרבות של תאי גזע רכס עצביים מן זקיקי שיער אדם.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד קפלים עצביים גולגולתיים מאזור המוח התיכון של עוברי אפרוחים. הוא מציג תהליך דיסקציה מפורט של הקפלים העצביים, מיקומם וחיבורם על כיסויים מצופים פיברונקטין ואחריו תצפית על נדידת תאי הפסגה העצבית מהקפלים העצביים.

בידוד קפלים עצביים גולגולתיים מעובר אפרוח לצורך תרבית תאי קרסט עצבית

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח והתרבות של תאי ציצה עצביים הגולגולת מדגמי העכבר, בעיקר למחקר של הגירה תא. אנו מתארים את טכניקות ההדמיה החי בשימוש וניתוח של מהירות וצורה תא שינויים.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

פרוטוקול רב-תכליתי זה מתאר את הבידוד של תאי פסגה עצבית קדם-מיגרטיבית (NCCs) באמצעות כריתה של קפלים עצביים גולגולתיים מעוברי אפרוחים. עם הציפוי והדגירה, NCCs נודדים מגיחים מתוך קצוות עצביים, מה שמאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים ונדידה בסביבה דו-ממדית פשוטה.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

פרוטוקול זה מתאר ניסוי נדידה חוץ גופית המתאים לניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת in vivo של תאי פסגה עצבית לתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן.

במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

אנו מציגים פרוטוקול התמיינות תלת מימדי (תלת מימדי) במבחנה המייצר נוירוספירות בגודל הניתן לשחזור כדי לייצר תאי פסגה עצבית גולגולתית מתאי גזע עובריים של עכברים. אנו מראים כי מתודולוגיה זו מפחיתה את השונות בהשוואה לפרוטוקולים קודמים וכיצד ניתן להשתמש בה לבדיקה מרובה לחקר התפתחות תאי פסגה עצבית גולגולתית.

תאי פסגה עצבית גולגולתית פרוטוקול התמיינות תלת מימדי במבחנה לבדיקה מרובבת

למדו לבודד ולגדל תאי עצב לפסגה מצינור עוברי עצבי של עכברים בשיטה יעילה ללא צורך במיון תאים או שכבות תומכות. הפרוטוקול מספק אוכלוסייה טהורה של 96% לחקר תכונות תאי העצב לפסגה ותהליכי התמיינות בביולוגיה התפתחותית.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

גלה סרטונים נוספים