בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את השימוש

הקדישו שלוש שעות לביצוע פרוטוקול זה. לאחר הניסיון, פרוטוקול זה אמור להימשך בין שעה וחצי לשעתיים בהתאם למספר העוברים שנותחו. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקחת עובר חתוך 9.5 ימים לאחר הליבה בקוד הרובד האוטי האמצעי ואולי ארבעה כדי לבודד רקמה המכילה את הצינור העצבי הנרתיק. חיתוך.

בסו קרדית 16 ו-22 יבודדו רקמה המכילה את הצינור העצבי של תא המטען. הפסגה העצבית הנרתיקית נודדת מהצינור העצבי הנרתיק. בעוד שהפסגה העצבית של תא המטען נודדת מהצינור העצבי של תא המטען, הרקמה המנותחת תתעכל אנזימטית בתמיסה של דיס קולגנאז, שטופת חלל ואפידרם ומזודרם לא עצביים ינותחו.

הצינור העצבי המבודד יישטף פעמיים נוספות ולאחר מכן יצופה במדיום חידוש עצמי. אני אליס גרף ממעבדת בוסקי באוניברסיטת ונדרבילט. היום אדגים כיצד לבודד את הפסגה העצבית מהצינור העצבי בתרבית אקספלן.

טכניקה זו תאפשר לך ללמוד את המאפיינים של הפסגה העצבית במבחנה. בואו נתחיל. התחל בדילול 100 מיקרוליטר של מ"ג אחד למיל פיברונקטין ל-3.2 מיליליטר של DPBS סטרילי.

מניחים מספיק מתמיסת פיברונקטין של 30 מיקרוגרם למיליליטר כדי לכסות את החלק התחתון של כל באר של צלחת ארבע בארות. הקש בעדינות על פינות צלחת ארבע הבארות כדי להבטיח שכל באר מכוסה באופן שווה. הניחו לצלחת לשבת בצד בזמן שאתם מכינים ומסננים את המדיה שלכם.

הצלחת צריכה לשבת לפחות 15 דקות. אסוף את הריאגנטים הבאים כדי להכין את המדיה שלך. המדיה מורכבת בארון בטיחות ביולוגית טרי לפני השימוש.

הקפד להשתמש בטכניקה סטרילית בכל עת. הסר את הסיבים נין מכלי ארבע הבארות והניח לו להתייבש כשהמכסה סגור בחלק האחורי של מכסה המנוע. לוקח בערך 15 דקות עד שהסיבים נין מתייבשים.

לאחר שהצלחת יבשה, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום לחידוש עצמי לכל אחד. ובכן, הניחו את הצלחת של 37 מעלות בחממת פחמן דו חמצני לחה של 5% מיד לפני תחילת החיתוך מערבבים 50 מיקרוליטר שטח דיסק קולגנאז לחמישה מיליליטר של DPBS. הקפידו להוסיף את כל הקולגנאז דיספא כדי להבטיח עיכול יעיל.

השתמש במסנן מזרק של 0.2 מיקרון כדי לסנן את תמיסת הקולגנאז דיספה לשלוש בארות של צלחת 12 בארות. כל באר צריכה לקבל שליש מתמיסת חמישה מיליליטר פיפטה כמיליליטר אחד של מדיום כביסה לכל אחת מהבארות הנותרות. הניחו את הצלחת על קרח עד שתהיו מוכנים לעכל את הרקמה המבודדת שלכם.

לאחר מכן, חתכו את קצה הפיפטה P 20 ממש מתחת לקצה המשופע בעזרת סכין גילוח סטרילי. טובלים את הקצה במדיום כביסה כך שעוברים וחתיכות רקמה מבודדת. אל תיצמד לטיפים בזמן ההעברה בין תמיסות.

עשו את אותו הדבר לקצה של P 1000 מהזדווגות מתוזמנת. הסר את הרחם מהסכר. השלם את הדיסקציה ב-DPBS סטרילי.

עקר את כלי החיתוך שלך בכל שיטה כגון עיקור בחום. אם ה-DPBS הופך עכור, העבירו את העובר עם ה-P 1000 החתוך לתוך צלחת טרייה של DPBS סטרילי החל מהרקמה החתוכה. הקניטו בעדינות את רקמת הרחם הרחק מהדצידואה.

לאחר מכן, הסר בעדינות את העובר מתוך הדצידואה. מיקום העובר מצוין כאן עם קריקטורה. לאחר בידוד עובר 9.5 ימים לאחר קום, הסר בעדינות את שק החלמון בעזרת מחטי אינסולין.

אם גנוטיפ הוא חלק הכרחי מהפרוטוקול שלך, שטוף את שק החלמון וכל הרקמה העוברית שנותרה ב-DPBS נקי וסטרילי. הנח את הרקמה בשפופרת של 1.5 מיליליטר ואחסן את השפופרת בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכן לבודד DNA. התמצאו באנטומיה של העובר.

אתה תחתוך באמצע קוד ה-OTIC PLA ב-SOMITES 4 16 ו-22. תצטרך להתאים את המיקוד של המיקרוסקופ שלך כדי לספור את הסומיטים. בצע את החיתוך הראשון באמצע קוד ה- PLA של Otic.

השתמשו במחטים כמו להבי מספריים מבלי לפגוע בשאר הצינור העצבי. בצע את החיתוך השני אחרי כל כך קרדית ארבע. לאחר מכן חותכים לקרדית 15 וחותכים מיד אחריו.

בצע את החיתוך הסופי אחרי כל כך קרדית 22 או האחרונה, אז קרדית. אם העובר מוקדם יותר מבחינה התפתחותית. רקמה זו מכילה את הצינור העצבי של תא המטען כדי לבודד את הרקמה המכילה את הצינור העצבי הנרתיק.

חתוך את הלב מהרקמה בין הרמה האוטית האמצעית לקרדית הרביעית. שימו לב להבדל בגודל בין חתיכות הרקמה המבודדת. החלק המכיל את הצינור העצבי הנרתיק רחב יותר מהשני.

הבחנה פיזית זו מאפשרת לך לעבד את שני החלקים יחד. השתמש בחתך P 20 כדי להעביר את הצינור העצבי לחלל הקולגנאז. ניתן לשמור את הרקמה הנותרת לצורך גנוטיפ.

כפי שצוין קודם לכן, הנח את פיסות הרקמה המבודדת באחת הבארות עם חלל קולגנאז. עכשיו בטמפרטורת החדר. תן לזה לשבת 10 דקות.

במהלך הדגירה של 10 דקות, אתה יכול להתחיל לנתח את העובר הבא. לאחר 10 דקות, הסר את הרקמה המבודדת מחלל הקולגנאז ושטוף על ידי פיפטינג למעלה ולמטה במדיום כביסה, הנח את הרקמה המעוכלת ב-DPBS. כך צריכה להיראות הרקמה לאחר העיכול.

השלב הבא כולל הסרת העור הלא עצבי והמזודרם. ראשית, העור הלא עצבי מורם הרחק מהצינור העצבי. לאחר מכן, ניתן להסיר את המזודרם מהצינור העצבי.

כדי להדגים את ההסרה של עור ומזודרם לא עצביים, נתמקד בצינור העצבי הנרתיק. ניתן לבצע את אותו תהליך עם הצינור העצבי של תא המטען. התחל בהחזקת הרקמה הלא עצבית עם מחט אחת.

השתמש בשני כדי להסיר בעדינות את העור הלא עצבי. לאחר מכן, הסר בעדינות את הסומיטים הסמוכים לצינור העצבי כדי להסיר שאריות של כל רקמה שאינה עצבית. חזור בעדינות עם קצה הפיפטה החתך P 20.

שטפו את הצינור העצבי פעמיים עם מדיום Wash. הנח את הצינור העצבי למדיום חידוש עצמי, ולאחר מכן צלחת לארבע מוכן. ובכן צלחת.

הכניסו את צלחת ארבע הבארות לתא היפוקסיה. ודא שהתא אטום. חבר מנתח חמצן והפעל את מקור הגז המעורב.

השתמש בתערובת של 1% חמצן, 6% פחמן דו חמצני ו-93% חנקן. טען את תא ההיפוקסיה עד שהוא נמצא ב-3% חמצן. כבה את הגז המעורב והנח את תא ההיפוקסיה על 37 מעלות צלזיוס.

24 שעות מאוחר יותר. תסתכל על ההסבר של הצינור העצבי. תאי פסגה עצבית היו צריכים לנדוד מהצינור העצבי המתואר בקו המוצק כדי למנוע זיהום ברקמת פסגה לא עצבית שנחתכה סביב החלק החיצוני של הצינור העצבי עם מחט אינסולין.

לאחר מכן, הסר את הצינור העצבי מהאקספלן ואת כל תאי הפסגה הלא עצביים שנותרו. החלף את המדיום במדיום חידוש עצמי טרי והחזיר את הצלחות לתא ההיפוקסיה. טען אותו והנח אותו על 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 24 שעות בתרבית, הפסגה העצבית תנדוד הרחק מהצינור העצבי. היקף הצמיחה מוצג בקו מקווקו. צמיחת הפסגה העצבית הזו המודגשת על ידי חיצים היא בערך 96% טהורה והתאים מבטאים P 75 SOX 10 ופוקס D שלושה.

ניסויים שניתן לערוך עם תאי פסגה מתורבתים אלה כוללים, אך אינם מוגבלים לדברים הבאים. לפעמים תרבויות פחות אידיאליות לא יניבו צמיחה יעילה אם זה קורה. בדוק שוב מצבים היפוקסיים, ריכוזי פיברונקטין ומשך הזמן שהרקמה התעכלה בחלל DYS קולגנאז היום הדגמתי את היסודות מאחורי תרבית הפסגה העצבית מהצינור העצבי.

בהצלחה בניסויים שלך.