Microdialysis של אתנול במהלך אתנול נחישות ממשל עצמי ואתנול אופרנטית על ידי גז כרומטוגרפיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר את רמות האתנול בדיאליזה במוח במהלך מפגש ניהול עצמי של אתנול. על מנת להשוות מדד זה להתנהגויות ניהול עצמי סינכרוניות, זה מושג תחילה על ידי השתלה כירורגית של מדריך מיקרודיאליזה, צינורית ובורג קשירה, ולאחר מכן אימון חולדות למתן אתנול עצמי באופן אופרטיבי. השלב השני הוא להרגיל את החולדות לקשירה בשלב הראש כך שהיא לא תעכב מתן עצמי של אתנול במהלך מיקרודיאליזה.

לאחר מכן מבוצעת מיקרודיאליזה במהלך מפגש ניהול עצמי של אתנול במהלכו מכינים חלק מהדיאלאטיקה לניתוח אתנול. לאחר מכן, דגימות הדיאלט מנותחות לריכוז אתנול באמצעות כרומטוגרף גז עם זיהוי יינון להבה. בסופו של דבר, התוצאות שהתקבלו מראות את מהלך הזמן של אתנול שהגיע לאזור המוח המעניין במהלך מפגש ניהול עצמי של אתנול.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ניקוב זנב או וריד ספנוס הוא שהליך זה מפריע באופן מינימלי בזמן איסוף הדגימה ומאפשר מדידת תרופות לאורך זמן באזור המוח המעניין בזמן שהחיה מבצעת משימה התנהגותית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיא דורשת מספר מיומנויות מיוחדות, שרבות מהן ניתנות לרכישה רק באמצעות תרגול או ניסיון חוזרים. כמו כן ידגים את ההליך ג'פרי דילי, עוזר מחקר לתואר ראשון במעבדה שלנו.

כל ההליכים המוצגים בבעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טקסס ועוקבים אחר כל ההנחיות לטיפול ושימוש בתקנות חיות מעבדה. אוניברסיטת טקסס באוסטין היא מתקן מוסמך ALAC חולדות אוונס ארוכות המטופלות היטב שהושתלו בניתוח עם צינורית בגודל 21 מעל אזור המוח המעניין משמשות לניסויי מיקרודיאליזה התנהגותיים אלה. כל בעלי החיים צריכים לקבל לפחות שבוע אחד של טיפול והחלמה לאחר הניתוח והם בריאים לפני תחילת ההליכים הבאים.

הנח את החולדה בתא אופרנטי של רפואה, המצויד בידית נשלפת של ליכטר וצינור טיפר ואמן אותה ללחוץ על הידית לגישה לתמיסת סוכרוז של 10%. לאחר שהחולדה מאומנת להגיב לתמיסת הסוכרוז, התחל אותה בלוח זמנים מתאים שבמהלכו מתווסף אתנול בהדרגה לתמיסה במהלך מפגשי שתייה מרובים בלילה שלפני הפגישה האופרנטית השנייה עד האחרונה. לאחר הרדמת החיה ובדיקת רמת ההרגעה, חבר את קפיץ הקשירה לבורג הקשירה בראש החולדה stage כדי להרגיל אותו למנגנון המורכב מידית איזון, זרוע, קשירה מסתובבת, קפיץ ומעמד טבעות.

אפשרו לחולדה לבלות את הלילה בחדר הניתוח בכלוב הביתי שלה עם אד לידו, מזון ומים, ולאחר מכן השלימו את האימון של היום למחרת עם הקשירה והציוד הנלווה במקום יום לפני ניסוי המיקרודיאליזה. לאחר הרדמת החולדה עם איזוף פלואור, בדוק אם יש טשטוש על ידי ביצוע צביטה בבוהן והכנס בדיקת מיקרודיאליזה עם נוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה. אבטח את הגשושית כראוי ולאחר מכן התאם את קצב זרימת הבדיקה ל-0.2 מיקרוליטר לדקה.

הניחו את החולדה בכלוב הביתי שלה בחדר הניתוח כדי לבלות את הלילה עם כל ציוד הדיאליזה במקום והוסיפו ליב, אוכל ומים. יום לאחר החדרת הגשושית לפחות שעתיים לפני תחילת הניסוי, העלה את הגשושית לקצב זרימת העבודה שלה. באמצעות מזרק המילטון, בדוק שקצב זרימת הבדיקה עקבי ומהווה לפחות 90% מקצב הזרימה שנקבע.

אם מעריכים נוירוטרנסמיטורים בדגימות הדיאליזה, קחו דגימות במהלך כל שלבי הניסוי. התחל באיסוף דגימות דיאליזה בזמן שהחיה נמצאת בכלוב הביתי שלה. אחסן את הדגימות בצורה מתאימה לניתוח מאוחר יותר.

העבירו בזהירות את החולדה לתא האופרנטי והתחילו את התוכנית האופרנטית השולטת בתא. המשיכו לקחת דגימות בזמן שהחולדה מחכה שהידית תתרחב לתוך התא שתי דגימות לפני שהידית מתרחבת. התחל לאסוף חלק מכל דגימת דיאליזה לניתוח אתנול על ידי פיפטינג של מנה מתאימה של דיאליזה לתוך בקבוקון זכוכית של שני מיליליטר ואיטום הבקבוקון עם מחיצה אטומה, פיפטה, ואטום את דגימות האתנול במהירות.

מכיוון שאתנול נדיף ונפח הדגימה קטן, הכנת דגימה לא עקבית או איטית תוביל לתוצאות לא מדויקות. אחסן את השאר לניתוח נוירוטרנסמיטרים. תקופת השתייה של 20 דקות מתחילה לאחר שתוכנת המחשב Med Associates מרחיבה את הידית לתוך התא והחולדה לוחצת עליה כדי לקבל גישה לבקבוק תמיסת שתייה.

המשך לקחת דגימות לאורך כל תקופת השתייה לאחר תקופת השתייה, תוכנת המחשב מושכת את הבקבוק מהתא. שמור את החיה בתא למשך 20 דקות נוספות לאחר השתייה בתום ניסוי המיקרודיאליזה. לאחר הרדמת החולדה, הסר את הבדיקה.

אם החיה לא מורדמת באופן מיידי באופן הומני, החלף את האובטרטור כדי להבטיח הדמיה של מערכת הבדיקה. אסוף את המוח תוך שלושה ימים מהניסוי. נתח את הדגימות יחד עם תקני אתנול חיצוניים באמצעות כרומטוגרף גז עם גלאי יינון להבה, דגימת רכב מרווח ראש, המחוממת ל-50 מעלות צלזיוס, ועמוד נימי עם הליום כשלב הנייד.

לרישום וניתוח הכרומטוגרמות השתמש בתוכנת תחנת עבודה כרומטוגרפיה להכנת המערכת לניתוח אתנול. השתמש באמבט מים מחזורי כדי לחמם את צלחת הדגימה האוטומטית ולפתוח את מיכלי האוויר והמימן. לאחר מכן, התחל את תוכנית ההפעלה.

כשהוא מוכן, התחל צריבה של 20 דקות, אשר מטהרת את הסיבים. בצע סטנדרטים באמצעות בקבוק נפח של 100 מיליליטר כדי לדלל 238 מיקרוליטר של 95% אתנול במים לנפח סופי של 100 מיליליטר. השתמש בדילול סדרתי אחד לאחד כדי ליצור תקנים.

פיפטו את הסטנדרטים לבקבוקוני זכוכית ואטמו אותם בדיוק כפי שהוכנו הדגימות. הקפד להפעיל ריק מים יחד עם הסטנדרטים שלך. הנח את התקנים והדגימות במגש דגימת הרכב, וחמם אותם עד שכל הנוזל התאדה.

כדי להפעיל את התקנים והדוגמאות, צור רשימה לדוגמה המציינת איזו דגימה נמצאת באיזה חריץ דגימה אוטומטית, ושים לב שיש לנקב כל דגימה. לאחר ניתוב קבצי הנתונים לתיקיה שנבחרה, בחר שיטה לבחירה עבור הדוגמאות והתחל בהפעלה. לאחר שהמערכת עברה על הדגימות, בדוק שהתוכנית שילבה כהלכה כל שיא.

Plot, גובה השיא כפונקציה של כל תקן חיצוני ידוע. ריכוז אתנול. השתמש בפונקציה הליניארית הניתנת על ידי הנקודות כדי להפנים את ריכוז האתנול של כל דגימת דיאליזה.

איור זה מציג כרומטוגרמות לדוגמה עבור שלושה ריכוזים של תקני אתנול ואחד עבור דגימת דיאליזה של חולדה שנאספה בסוף מפגש הניהול העצמי של אתנול. שיאי אתנול צריכים להיות סימטריים יחסית, בעלי זמני שמירה עקביים ויחס אות לרעש גדול מ-10. אי עמידה בקריטריונים אלה פירושה שהמערכת דורשת תחזוקה, כרומטוגרפיה איכותית ותקנים נכונים מייצרים עקומה סטנדרטית ליניארית המשמשת לחישוב ריכוז האתנול של דגימות דיאליזה שנאספו מבעלי חיים במתן עצמי של אתנול במהלך הניהול העצמי שלהם.

ריכוזי האתנול הנגזרים בדיאליזה אינם מתוקנים להתאוששות בדיקה in vivo ומהווים רק חלק קטן מריכוז רקמת האתנול במוח. אם נדרשת מיקרודיאליזה כמותית של אתנול, נקבע בניסוי חלק המיצוי של אתנול המתפזר מהחלל החוץ-תאי לתוך הגשושית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כארבע עד חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

זה ישתנה בהתאם לאורך הפגישה ההתנהגותית. סיום מוצלח של שלב המיקרודיאליזה של הניסוי תלוי מאוד באיכות שלבי ההכנה. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לוודא שהחולדות שלך מטופלות היטב וכי הרגלת אותן לכל גירוי שעלול להסיח את הדעת שעלול להתרחש במהלך ניסוי הדיאליזה, כך שהתנהגות הניהול העצמי של החיה לא תושפע.