שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להציג שיטת הכנה חזקה לשלפוחיות שומנים רלוונטיות מבחינה ביולוגית. זה מושג על ידי ערבוב והעברה של פוספוליפידים לבקבוקוני זכוכית ולחות שלהם עם בופר מימי ליצירת תרחיף SLE מרובה למלה. כשלב שני מבוצעת שיטת הקפאה והפשרה, מה שמביא לאחר מכן לייצור שלפוחיות אלה משלפוחיות מרובות למלה.

לאחר מכן, תרחיף הליפוזום מועבר דרך מכבש באמצעות הלחץ האופטימלי שנקבע לייצור שלפוחיות שומן הומוגניות בגודל הרצוי. התקבלו תוצאות המראות גדלי שלפוחיות תת-מיקרוניים עקביים המבוססים על פיזור אור דינמי וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו סוניקציה ושקיעה, הוא ששיטה זו משתמשת במערכת בקרת לחץ עם קצבי זרימת חנקן נקבעים אופטימליים להכנה יעילה של גודל שלפוחית השומן.

כדי להתחיל בהליך זה, שלפו בקבוקון זכוכית של 20 מיליליטר עם מכסה מרופד טפלון, נקו את כל כלי הזכוכית והמזרקים עם כלורופורם לפני השימוש כדי למנוע זיהום. העבירו 100 מיקרוליטר של כלורופורם בדרגת ריאגנט לבקבוקון הזכוכית באמצעות מזרק זכוכית אטום בנפח 250 מיקרוליטר. הוסף 30 מיקרוליטר של מתנול בדרגת ריאגנט לאותו בקבוקון זכוכית באמצעות מזרק זכוכית אטום של 100 מיקרוליטר.

הכן תמיסת שומנים של כולסטרול פרג פופ C של שני מילי-מולרית על ידי העברת 216 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר, פופ C 42 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר. פופ e ו -20 מיקרוליטר של 11 מיליגרם למיליליטר. תמיסות כולסטרול לבקבוקון הזכוכית של 20 מיליליטר מאדות את הממיסים האורגניים באמצעות ארגון זרימה איטית או גז חנקן עד שנצפה סרט דק של שומנים בתחתית הבקבוקון, מניחים את בקבוקון הזכוכית הלא מכוסה בייבוש ואקום למשך 30 דקות לפחות.

כדי להסיר שאריות ממס, העבירו שני מיליליטר של מאגר שהועברו בעבר דרך מסנן של 0.2 מיקרון לבקבוקון הזכוכית כדי להרטיב את השומנים. דגרו את התערובת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה והשתמשו תוך 48 שעות לגדלים של ליפוזומים של 30 עד 100 ננומטר. שחרר את תרחיף הליפוזום בחנקן נוזלי למשך 15 שניות.

לאחר מכן הפשירו את תרחיף הליפוזום באמצעות בלוק חימום בטמפרטורה של 42 מעלות SIU למשך כשלוש דקות. חזור על תהליך ההפשרה בהקפאה למשך חמישה מחזורים בסך הכל. הקפאה ולאחר מכן הפשרה מייצרת את אלה לס משלפוחיות מולטי למלה ומשפרת את יעילות לכידת השומנים במהלך האקסטרוזיה.

לאחר מכן, התכוננו לשחול על ידי ביצוע הוראות האווסטין כדי להרכיב בזהירות את הליפו כל כך מהר. הרכבה נכונה של מכבש LF 50 היא קריטית למניעת דליפת חנקן, המשפיעה על קצבי הזרימה הרצויים. כדי להבטיח הצלחה, בצע את השלבים הבאים בזהירות.

כדי לייצר אטימה אטומה. הנח את מסך תמיכת החורים הגדול בבסיס מסנן התמיכה ואחריו את הכלי המרכזי העגול, דיסק ניקוז אחד וממברנת פוליקרבונט אחת. הנח את טבעת ה-O השחורה הקטנה על גבי הממברנה ואבטח אותה לבסיס מסנן התמיכה.

חבר את מכבש המסנן העליון על ידי הידוק ארבעה ברגים בארבעת החורים המתאימים. הרכיבו את יחידת מכבש המסנן מתחת לקנה המכבש הגדול. הוסף את תמיסת הליפוזום לחבית הצילינדר על גבי חבית האקסטרוזיה.

הניחו טבעת O עגולה גדולה, כובע צר, טבעת O עגולה גדולה וכובע עגול. חבר את ווסת הגז לחלק העליון של חבית המכבש וסגור את כל השסתומים כדי למנוע דליפת אוויר, כולל שסתום שחרור הלחץ. הניחו בקבוקון זכוכית של 20 מיליליטר או בקבוק ארלנמאייר של 50 מיליליטר מתחת ליחידת המסנן של המכבש.

שסתום בטיחות מחובר לווסת וישתחרר אם הלחץ יעלה על 600 PS. אני מדליק את גז החנקן ופותח את שסתום הגז המחובר למכבש. הגדל את לחץ החנקן ל-25 PSI עבור ליפוזומים של 400 ננומטר ל-125 PSI עבור ליפוזומים של 100 ננומטר, ול-400 עד 500 PSI עבור ליפוזומים של 30 ננומטר. צפו בתרחיף הליפוזום עד שהוא נפלט לתוך המיכל תוך כדי דחיפה על ידי החנקן.

שמור על זרימת החנקן עד שלא נצפה נוזל. מעבר דרך מסנן המכבש לקובץ הזכוכית לביצוע ניתוח DLS. ראשית, הכינו 50 מיקרוליטר של תמיסת ליפוזום מיקרו-מולרית מדוללת במי מלח חוצצים פוספט או PBS.

לאחר מכן הפעל את מקור החשמל ואת מקור המנורה. המשך לפתיחת תוכנת dynapro. הגדר את התוכנה למודל האלגוריתם כדי לזהות ליפוזומים בגודל הרצוי.

לאחר חיבור לפיפטת החומרה 14 מיקרוליטר של דגימת ליפוזום לתוך הקוורץ והכנס למחזיק התא, לחץ על התחל לאחר כ-20 עד 30 רכישות, לחץ על עצור. נתח את פסגות קוטר הליפוזום הממוצעות שנרשמו בהיסטוגרמה. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים מתחיל בהכנת תמיסת ליפוזום מיקרו-מולרית של 500 מיקרוליטר 0.1 מסיס ב-PBS, שוטפים את תא הדגימה במים ואתנול.

לאחר מכן יבש את תא הדגימה במגבת נייר נטולת מוך. הפעל את מקור כוח הלייזר והמחשב יעביר 300 מיקרוליטר של תמיסת ליפוזום מולרית של 0.1 לתא הדגימה. פתח את בקרת הטמפרטורה ואת תוכנת ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים.

לחץ על לחצן הלכידה כדי להפעיל את הלייזר. השתמש בהתאמות האופקיות והאנכיות כדי להזיז את הבמה ולהתאים את מיקוד המיקרוסקופ. הגדר את הטמפרטורה וזמן ההקלטה הרצויים.

לחץ על לחצן ההקלטה כדי לצלם מסגרות תמונה מרובות של חלקיקי הליפוזום למשך פרק זמן מוגדר. נתח את הפסגות המתאימות לגדלי הליפוזום בקוטר בהיסטוגרמה מכיוון שהיא עוקבת אחר התנועה של כל חלקיק. DLS היא שיטה מבוססת שאוספת אור מפוזר כדי לקבוע את קוטר החלקיקים ובוצעה כדי לקבוע את גדלי הליפוזומים.

ליפוזומים מיובשים הוצאו דרך ממברנות פוליקרבונט בגדלים ולחצים שונים כמתואר בפרוטוקול הכתוב. קוטר הליפוזומים שנמדד על ידי DLS עבור גודל נקבוביות של 30 ננומטר היה 66 פלוס מינוס 28 ננומטר. עבור 100 ננומטר גודל הנקבוביות היה 138 פלוס מינוס 80 ננומטר, ועבור 400 ננומטר גודל הנקבוביות היה 360 פלוס מינוס 25 ננומטר.

תרחיף של חרוזי איירין מלוטשים של 50 ננומטר שימש כתקן כיול שבו הוא רשם קוטר של 47 פלוס מינוס 16 ננומטר. אחוז פיזור הפולי מראה שאין חפיפה בין גדלי הליפוזומים. אופייני לצפות בקטרים גבוהים מ-30 ננומטר בעת שימוש בניתוח DLS בשל ההטיה הידועה שיש למכשיר זה כלפי חלקיקים גדולים יותר.

למרות מגבלה אינסטרומנטלית זו, עקומת הכיול מתארת מתאם ליניארי. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים הוא טכנולוגיה חדשה המודדת את גודלו של כל חלקיק מתצפיות ישירות של דיפוזיה בתווך נוזלי ללא תלות במקדם השבירה או בצפיפות החלקיקים. ניתן להשתמש בטכניקה זו ברזולוציה גבוהה כדי להשלים את מדידת הליפוזומים עם DLS, ה-NTA רשמה קוטרים של 95 פלוס מינוס 48 ננומטר ו-356 פלוס או מינוס 51 ננומטר עבור שתי תמיסות פוליסטירן של 100 ננומטר ו-400 ננומטר שימשו לכיול.

לתמיסות ליפידים יש קוטר דומה יותר ביחס ל-DLS המייצרות גדלים ממוצעים של 29 פלוס מינוס 14 ננומטר עבור גודל נקבוביות של 30 ננומטר, 95 פלוס מינוס 17 ננומטר עבור גודל נקבוביות של 100 ננומטר ו-359 פלוס מינוס 73 ננומטר עבור גודל נקבוביות של 400 ננומטר. NTA עשויה להיות טכניקת אפיון כללית יותר לכימות חלקיקים מיקרוסקופיים מכיוון שהרגישות שלה מאפשרת מדידות של חלקיקים של 50 עד 1000 ננומטר. עקומת הכיול מציגה מתאם ליניארי בין הפסקת קרום הפוליקרבונט לעומת העברת הכתם השלילי בקוטר NTA שהוקלט תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים מציגות כל גודל ליפוזום בעקבות גדלי שחול 3, 100 ו-400 ננומטר נבדלים בבירור זה מזה.

ההגדלה הוגדרה ל-25,000 פעמים כאשר סרגל קנה המידה מייצג 0.5 מיקרון. ניסוי מהלך זמן נערך עם שלושה גדלי ליפוזומים. DLS נמדד עבור כל תמיסת ליפוזום מיד לאחר האקסטרוזיה.

כל תמיסות הליפוזומים אוחסנו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הקוטר שלהם נרשם שוב על ידי DLS לאחר דגירה של לילה. שינוי מועט עד לא נצפה לאחר תקופת דגירה של 60 שעות בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי מעברים מרובים דרך מסנן האקסטרוזיה ישפרו את ההומוגניות של תמיסת Vesco.

כמו כן, זכרו להשתמש בבקבוקוני זכוכית ומזרקים להכנת דגימות כדי למנוע זיהום באמצעות שטיפה על ידי צינורות פוליפרופילן מכלורופורם.