על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל
21 ביולי 2012
חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.
מטרת הסרטון הזה היא להדגים מעבדה על טכניקת שבב לאפיון המצב הדלקתי של תאי אנדותל. בתור התחלה, תאי אנדותל אבי העורקים האנושיים גדלים למפגש על מצע תרבית רקמות, ולאחר מכן מוכנסים למכשיר גזירת צלחת קונאן. התאים מטופלים בציטוקין הפרו-דלקתי, TNF אלפא, ונחשפים בו זמנית לתנאי מתח גזירה דיפרנציאלי למשך ארבע שעות על ידי שליטה מדויקת בסיבוב החרוט מעל מתח הגזירה של הסובסטרט מווסת תגובה דלקתית מאופיינת היטב לציטוקין.
זה כולל ויסות מוגבר של מולקולות הידבקות כגון VCA one ו-ICAM one. המצע מועבר לשלב מיקרוסקופ שבו מכשיר מיקרופלואידית A-P-D-M-S אטום בוואקום ישירות לשכבה החד-שכבתית ויוצר תעלות זרימה. מונוציטים מופעלים, תאי THP אחד מוטסים מעל ה-hs המותנה מראש, שם הם נקשרים ביחס לרמת ביטוי מולקולת הידבקות התאים.
המצב הדלקתי של האנדותל נקבע על ידי כימות המספר הכולל של תאי THP אחד שנעצרים היטב. היי, שמי היא D Diverse, ואני גרג פוסטר. ואני קית' ביילי.
אנו נמצאים במעבדות של פרופסורים, כומר וסיימון במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קליפורניה בדייוויס. היום אנו הולכים לתאר את השימוש במעבדה בגישה מבוססת שבב לבחינה כמותית של תפקוד לקוי ודלקת אנדותל. כלים אלה מספקים לנו פלטפורמה לביצוע מחקרים הקשורים לסופרפוזיציה של מתח מטבולי עם גורמים הידרודינמיים ולוויסות פנוטיפ דלקתי אנדותל ורגישות לטרשת עורקים.
לכן אנו מתייחסים למכשירים שלנו כחיקוי כלי דם, תאים מיקרופלואידיים או vmmc. מכשירים אלה מאפשרים לנו לכמת תוצאות דלקתיות בתאי אנדותל ובמונוציטים בתנאים המחקים את אלה בכלי דם אטרוגניים. ה-VMMC מקל על השימוש בכמויות קטנות של ריאגנטים או חומרים שעשויים להיות באספקה מוגבלת.
ניתן לבנות אותם גם במספר פריסות וגיאומטריות הניתנות להתאמה אישית, מה שהופך אותם למתאימים מאוד למגוון עצום של יישומים. היום נדגים ניסוי מייצג באמצעות המעבדה שלנו בגישת שבב. חד-שכבות אנדותל אנושיות ייחשפו להפעלת ציטוקינים תחת מאמצי גזירה מוגדרים היטב.
נדגים את השימוש ב-VMC כדי לכמת גיוס תאים מונוציטים אנושיים לשכבה החד-שכבתית בזמן אמת כקריאה פונקציונלית של הפעלת אנדותל באמצעות מחרטה, מצעים עגולים בגודל 3 אינץ' נטחנים מכלי תרבית רקמה של 100 מילימטר. המצעים בגודל שלושה אינץ' נשטפים במים מזוקקים, ולאחר מכן מעוקרים על ידי השריית אתנול 70%. מצעים סטריליים מונחים בצלחות פטרי של 100 מילימטר ומניחים להם להתייבש.
לאחר מכן הם מודגרים עם קולגן מסוג 1 בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר למשך שעה בטמפרטורת החדר ונשטפים עם PBS. תאי אנדותל אבי העורקים האנושי או HA מושעים בריכוז של 650,000 תאים למיליליטר. מיליליטר אחד של תרחיף תאים מונח בטיפות על מצע מצופה קולגן מיובש ומתפשט לתרחיף אחיד.
מצעים יושבים לאחר מכן מונחים בחממה של 37 מעלות 5% CO2 ומאפשרים להם להיצמד למשטח המצע. לאחר שעה אחת תשעה מיליליטר של E GM שני גידול, מתווסף מדיום והתאים מורשים לגדול לחד-שכבות בכ-90% Co fluency חד-שכבות מוכנות לשימוש לניסויים שקופים הבאים. תאים מיקרופלואידיים מחקים כלי דם נבנים על ידי יציקת תבנית A-P-D-M-S על צורת מאסטר הכוללת את התעלה הרצויה. גיאומטריה.
בסיס סיליקון מוזג לסירת דרך מפלסטיק, ואחריו חומר הריפוי מסיליקון ביחס של 10 לאחד לפי משקל. לאחר מכן מערבבים היטב את ג'ל ה-PDMS, מקפידים לא לגרד את דפנות הסירה, ובכך להכניס שבבי פלסטיק לתערובת. מאסטרים של Photoresist מנוקים עם הקסאן ומוכנים לעצב את ה-VMMC.
לאחר מכן יוצקים את תערובת ה-PDMS על צורת המאסטר, ואז מניחים אותה בתא ואקום. בתא. אוויר מוסר מתערובת ה-PDMS ועולה אל פני השטח לאחר 15 דקות.
התבנית מוסרת מהתא ואוויר נושף בעדינות על פני משטח ה-PDMS כדי לטהר את בועות האוויר שנותרו מהתבנית. לאחר מכן מכסים את התבנית ומכניסים לתנור של 37 מעלות למשך שעה שבה מותר ל-PMS להתרפא. הוציאו את ג'ל ה-PDMS המוצק מהתנור ובצעו חתכים עגולים סביב החדר באמצעות אזמל קטן.
חיוני לעשות זאת בהדרגה כדי למנוע מגע עם החומר העמיד לצילום מכיוון שהדבר יפגע בתבנית המאסטר. הסר את התא המיקרופלואידי מיציאות הכניסה והיציאה של אגרוף התבנית עבור כל תעלה באמצעות מחט נעילת פיתוי בגודל 19. בנוסף נקב חורים לצינורות הוואקום הרחק מהתעלות.
ההכנה ל-VMMC הושלמה כעת. הכניסו את הציטוקין הפרו-דלקתי TNF אלפא לשישה מיליליטר של מדיה L 15 כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 ננוגרם למיליליטר. מדיה L 15 משמשת כאן כנוזל הגזירה בשל יכולת חציצה של pH בהיעדר 5% CO2.
לאחר מכן המדיה נשאבת למזרק סטרילי של 10 מיליליטר, המשמש לטעינת מכשיר הגזירה. לאחר מכן מועברת החד-שכבתית של Confluent למכשיר גזירת התאים, שעבר עיקור עם אתנול מפולס וגובה פער החרוט נקבע. המצע מוסר מצלחת הפטרי ומונח על גוש מד הזכוכית במרכזו ומוכנס בזהירות לתחתית תא הדיור, כך שהחרוט נמצא ישירות מעל התאים.
המצע מאובטח על ידי הידוק אחיד של ברגי נירוסטה סביב בלוק המד. לאחר מכן מועמס אמצעי הגזירה לתוך החדר, תוך הקפדה לא להכניס בועות אוויר. לאחר מכן, מחשב משמש להזנת תוכנית מתח הגזירה הרצויה והמנוע המיקרו נפרד מופעל.
כאן אנו משתמשים בגזירה תנודתית של אפס פלוס או מינוס חמישה דינים לסנטימטר בריבוע. לאחר ארבע שעות, תוכנית הגזירה מופסקת. בלוק המד מוסר והמצע מונח בזהירות בחזרה לתוך צלחת הפטרי.
התאים מוכנים כעת לבדיקת הידבקות מונוציטים. מיד לאחר הגזירה מועברות חד-שכבות HA לתחנת המיקרוסקופ להרכבת ה-VMMC. ה-VMMC מחובר לצינור הוואקום וטבול במי DI כדי להסיר בועות אוויר הכלואות בתוך התעלות.
כאשר שסתום הוואקום כבוי בתחילה, החדר נלחץ בזהירות על גבי החד-שכבה, ושסתום הוואקום מופעל. זה קריטי כאן לוודא שלא נלכדו בועות אוויר בתעלות החדר. כעת, 80 מיקרוליטר של HBSS עם סידן ומגנזיום מוזרמים למאגר העשוי מחיתוך הקצה של פיתוי 19 מד נוזל מחט נעילה נדחף החוצה מהקצה על ידי לחיצה חזקה על החלק העליון של המאגר, אשר מוחדר לאחר מכן ליציאת הכניסה של ה-VMMC.
כל המכלול מונח על במת המיקרוסקופ ומצלמת המיקרוסקופ וצג הווידיאו מופעלים. מזרק זכוכית של 10 מיליליטר נטען על משאבת המזרק. לאחר מכן, צינור המזרק מחובר ליציאת היציאה של ה-VMMC.
קצב הזרימה מוגדר כדי לגרום למתח מוחלט של סעודה אחת לסנטימטר בריבוע בתוך התעלה, ולאחר מכן לפעול במצב מילוי כך שהמזרק מושך נוזל מהמאגר דרך התעלה. תאי P אחד מגורים עם SDF אחד מושעים בריכוז של 2 מיליון תאים למיליליטר. תוך שתי דקות מהפעלת הזרימה, 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים מתווספים למאגר.
שוב, הקפדה לא להכניס בועות אוויר עם זרימה מתפתחת במלואה. הווידאו מצולם בשלוש פריימים לשנייה והנתונים נספרים באמצעות תוכנת Image J. חסיד. תאי THP אחד מוגדרים כנעים בקוטר של לא יותר מחצי תא תוך 10 שניות.
כאן אנו מדגימים נתונים המתארים THP הידבקות אחת לחד-שכבות ha מגורה עם TNF אלפא ומותנית תחת מתח גזירה גבוה קבוע של 15 דינס לסנטימטר מרובע או מתח גזירה תנודתי של אפס פלוס או מינוס חמישה דינים לסנטימטר רבוע ha חד-שכבות המותנות במתח גזירה תנודתי הראו גיוס תא אחד גדול פי שלושה בהשוואה לחד-שכבות שחוו מתח גזירה גבוה. כיום, אנו מדגימים את השימוש בטכניקות מבחנה הניתנות להתאמה אישית שניתן לשלב כדי לספק תובנה חשובה לגבי אירועים דלקתיים מוקדמים העומדים בבסיס טרשת עורקים. באופן ספציפי, אנו מכמתים תוצאות הקשורות לתפקוד לקוי של האנדותל ותאים שנחשפו לגירויים דלקתיים בתנאים הידרודינמיים מוגדרים היטב.
השימוש ב-VMM CS מאפשר לנו לבחון מנגנונים ספציפיים העומדים בבסיס אינטראקציות הידבקות אנדותל ולויקוציטים. למכשירים אלה יש גם יתרון בהיותם גמישים וזולים ומקלים על השימוש בחומרים שעשויים להיות מוגבלים באספקה, כגון רכיבים שמקורם בסרום מנבדקים אנושיים. המחקרים שלנו המיישמים מכשירים אלה כללו חקירות של ציטוקין, שומנים ודלקת הנגרמת על ידי זעם בתאי אנדותל.
פיתחנו גם בדיקות על השבב הבוחנות מנגנוני הידבקות במספר סוגי לויקוציטים כמו גם בדם מלא. בסופו של דבר, אנו צופים שטכנולוגיה זו תוביל לגישות ex vivo להערכת הסיכון של אדם למחלות לב וכלי דם בתיווך דלקת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מדגים טכניקת מעבדה על שבב לאפיון המצב הדלקתי של תאי אנדותל (ECs) באמצעות תאי זרימה מיקרופלואידיים. המחקר חוקר כיצד מתח גזירה דיפרנציאלי משפיע על הדבקה של תאים מונואציטיים למונוליט אנדותלי מופעל ציטוקינים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה תאית
- מיקרופלואידיקה
רקע
- תאי האנדותל ממלאים תפקיד מכריע בדלקת ובבריאות כלי הדם.
- ידוע כי מתח גזירה משפיע על תגובות תאיות במערכת כלי הדם.
- הבנת תפקוד לקוי של EC יכולה לספק תובנות לגבי מחלות לב וכלי דם שונות.
- מכשירים מיקרופלואידיים מאפשרים שליטה מדויקת בתנאי הניסוי.
מטרת המחקר
- לאפיין את התגובה הדלקתית של תאי אנדותל אבי העורקים האנושיים.
- לבחון את ההשפעות של מתח גזירה על הדבקה של תאים מונואציטיים.
- להשתמש בגישה מיקרופלואידית לשליטה ניסויית משופרת.
שיטות ששימשו
- תאי אנדותל אבי העורקים האנושיים טופחו עד להתמזגות.
- התאים טופלו ב-TNF אלפא כדי לגרום לדלקת.
- מתח גזירה דיפרנציאלי הופעל באמצעות מכשיר גזירה חרוטי-צלחת.
- תאי THP-1 מונואציטיים הוכנסו כדי להעריך את רמות ההדבקה.
תוצאות עיקריות
- מתח גזירה ויסת את ביטוי מולקולות הדבקה כמו VCAM-1 ו-ICAM-1.
- הדבקה של תאים מונואציטיים הייתה פרופורציונלית לרמת ביטוי מולקולות ההדבקה.
- ההתקן המיקרופלואידי אפשר תצפית בזמן אמת של אינטראקציות תאיות.
- התוצאות מדגישות את הקשר בין כוחות מכניים ותגובות דלקתיות.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי תפקידו של מתח גזירה בדלקת EC.
- מכשירים מיקרופלואידיים הם כלים יעילים לחקר דינמיקת הדבקה תאית.
- הממצאים עשויים להיות בעלי השלכות להבנת מנגנוני מחלות לב וכלי דם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This lab-on-a-chip approach enables quantitative assessment of endothelial inflammatory phenotypes under controlled hemodynamic conditions, addressing a critical gap in early cardiovascular risk stratification. By linking metabolic perturbations to leukocyte adhesion dynamics in a reproducible in vitro system, the method supports mechanistic de-risking of atherogenic pathways and informs target validation strategies in cardiovascular drug discovery. The platform’s ability to model physiologically relevant shear stress and cytokine interactions provides predictive value for evaluating therapeutic candidates targeting endothelial dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hemodynamic regulation of inflammatory pathways in human endothelial cells under defined shear stress conditions.
- Operational Value: Provides a quantitative readout of monocyte adhesion as a functional biomarker of endothelial activation state.
- Predictive Value: Supports target validation by linking shear-modulated adhesion molecule expression (e.g., VCAM-1, ICAM-1) to leukocyte recruitment under inflammatory stimuli.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a standardized microfluidic assay for measuring real-time leukocyte-endothelial interactions under physiological flow.
- Operational Value: Permits high-resolution imaging and automated quantification of adherent cells using image analysis tools.
- Assay Readiness: Delivers reproducible, shear-dependent inflammatory phenotypes suitable for compound screening and pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models early atherogenic events by coupling metabolic risk factors (e.g., TNF-α activation) with hemodynamic shear profiles relevant to arterial geometries.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo atherosclerotic susceptibility by quantifying functional endothelial responses under clinically relevant flow conditions.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of targets based on their modulation of shear-sensitive inflammatory phenotypes in human cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the cardiovascular discovery continuum, supporting hypothesis testing in early target validation, enabling assay development for leukocyte recruitment, and providing quantitative analytics for mechanistic de-risking before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic interrogation of how hemodynamic forces modulate cytokine-induced endothelial activation and leukocyte adhesion.
- Screening: Delivers a shear-dependent, quantitative assay for evaluating compound effects on endothelial inflammatory phenotypes under controlled flow.
- Analytics: Generates real-time, image-based quantification of firmly arrested monocytes as a functional readout of endothelial activation state.
- Translational Research: Connects endothelial dysfunction metrics to atherosclerotic risk by modeling physiologic shear stress and inflammatory priming in human aortic endothelial cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reconfigurable microfluidic platform adaptable to various leukocyte types, stimuli, and shear profiles across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in endothelial inflammation by decoupling hemodynamic and biochemical variables in a controlled system.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized microfluidic fabrication and precise shear stress application.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant data on target modulation of endothelial-leukocyte interactions under flow.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying candidates that attenuate shear-amplified inflammatory phenotypes in pathophysiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, cell culture under shear, and leukocyte isolation or handling.
- Depends on access to soft lithography equipment, vacuum sealing systems, and inverted microscopes with environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of shear protocols, cytokine dosing, and cell preparation for reproducible results across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending to different endothelial sources (e.g., coronary, microvascular) or leukocyte subtypes beyond THP-1.
- Practical limitations include device assembly complexity and the need for bubble-free microfluidic channel formation to ensure consistent shear profiles.
