Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

מטרת פרוצדורה זו היא לייצר פיגומים biodegradable שנוצרו בשיטת electro spinning, שניתן לעקר אותם ולהפוך אותם לעבים מספיק ובעלי חוזק מכני מתאים להנדסת רקמות קלינית. הדבר מושג תחילה על ידי electro spinning של פולימרים biodegradable למבנים ראשוניים, שיהיו אקראיים או תלויים ומכוונים, או שכבות עוקבות. השלב השני הוא ביצוע מודיפיקציות לאחר השזירה (post spinning) לפיגומים, על ידי חיבור של מספר שכבות יחד ועקירה שלהן.

בשלב הבא מוחדרים תאים אל הפיגומים וביצועיהם במהלך ואחרי התרבית מוערכים. השלב הסופי הוא החשפת התאים למשטר אימונים כדי לדמות את העקה הפיזיולוגית שהתאים יפגשו בגוף, במטרה להכינם להשתלה. לבסוף, ניתן להעריך את תגובת התאים לאימון על ידי מדידת המטריצה החוץ-תאית שהם מייצרים בתגובה למתח דינמי.

טכניקה זו היא ורסטילית וגמישה, ומאפשרת ייצור של מגוון רחב של פיגומים (scaffolds) עם תכונות ששופרו במיוחד עבור היישום הנדרש. לדוגמה, ניתן לתכנן פיגומים לטיפול במצבים מורכבים הדורשים תיקון רקמה, כגון החלפת אובדן עור נרחב בחולים עם כוויות קשות או תיקון של רירית הפה פגועה בעקבות סרטן או טראומה. למרות שסרטון זה מראה ייצור מתמשך של תאים כסמן למאמץ דינמי, ניתן לבחון גם מגוון של חלבונים של המטריצה החוץ-תאית, וכן להעריך היבטים רבים אחרים של ביולוגיה של התא באמצעות תאים שעברו אימון או תאים שלא עברו אימון.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו להשיג פיגומים בעלי תוצאות הדירות, מכיוון שתהליך האלקטרוספינינג מושפע ממשתנים רבים. הדגמה חזותית של עיבוד הפיגומים שעברו אלקטרוספינינג לאחר השלב הראשוני היא חשובה, אך היא נדונה לעיתים רחוקות.

הבנה של התהליך נחוצה כדי שניתן יהיה ליישם את הטכניקה בהצלחה בקליניקה. התחילו בציפוי של אספן ציר מסתובב בעזרת נייר אלומיניום, כאשר הצד המבריק פונה החוצה. לאחר מכן, הניחו ארבעה מזרקים של 5 mL טעונים ב-5 mL של הפולימר הרלוונטי.

כאן נעשה שימוש בחומצה פולילקטית באמצעות משאבת מזרקים. הגדירו את קצב הזרימה ל-40 µL לדקה לכל מזרק, ואת מרחק העבודה ל-17 cm מקצה המחט למנדריל. לאחר מכן, טענו את מחטי המזרקים למתח של 17,000+ וולט ובצעו אלקטרוספינינג מהמרחק המתאים אל המנדריל המצופה בנייר אלומיניום לקבלת סיבים מיושרים.

סובבו את המנדרין במהירות של 1000 RPM לקבלת סיבים אקראיים. סובבו את המנדרין במהירות של 200 RPM. ניתן לאחסן פיגומים של Electro bun על נייר אלומיניום בתוך מיכל אטום בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius בנוכחות חומר מיבש למשך ארבעה חודשים לפחות לאחר ביצוע electro spinning של פולימר PHBV Lotus השני.

כאן שוב. ה-PLA הראה שכבה מעל ה-PHBV, תוך שימוש בפרמטרים ובתנאים רגילים עבור סבב פולימר זה. שוב, תהליך תוסיף זה בונה שכבה כפולה של פיגום, היוצרת בישלוש (bilayer) כדי לייצר פיגום רב-שכבתי באמצעות מחמם.

בשלב הניפוח, הניחו ארבעה גיליונות של PLGA זה על גבי זה, ולאחר מכן חממו את הגיליונות בטמפרטורה של 60 °C למשך שלוש שעות כדי להפיק פיגום רב-שכבתי באמצעות ניפוח באדים. שפכו 10 milliliters של DILU methane או DCM לתוך מכל בגודל מתאים. לאחר מכן, הניחו ארבעה גיליונות של PLGA זה על גבי זה ותלה אותם בגובה של שני סנטימטרים מעל ה-DCM.

לבסוף, אטמו את המכל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להשיג ייצור אספטי של פיגום באמצעות אלקטרו-ספינינג; המיסו פולימרים בדרגה רפואית שעומסטרילו על ידי אינקובציה ב-DCM ולאחר מכן בצעו אלקטרו-ספינינג של תמיסת הפולימר על רדיד סטרילי העוטף מנדריל שעבר סטריליזציה. לאחר מכן, בתוך מנדף זרימה למינרית סטרילי, דגרו את הפיגום במצע גידול נטול אנטיביוטיקה למשך התקופה המתאימה כדי לוודא את סטריליות הדגימות בהתאם לחיטוי באתנול ניסויי.

הניחו את הפיגומים בתמיסה של אתנול ומים מזוקקים למשך 15 דקות. לצורך עיקור בחומצה פראסטית, טבלו את הפיגומים בתמיסה של חומצה פראסטית ו-PBS למשך שלוש שעות.

בטמפרטורת החדר עבור סטריליזציה בגמא, הקרינו את הפיגומים במינון של 3 kGy באמצעות מקור Caesium, ולאחר מכן גזרו את הפיגומים למלבנים בגודל של 5 mm על 20 mm. לאחר מכן, השתמשו במיקרומטר למדידת עובי הפיגומים. לבסוף, הכניסו את המלבנים למכשיר Bose ElectroForce 3100.

חשב את מודול יאנג ואת הגמישות מתוך העומס לעומת ההעתקה כעקומת מאמץ-מעיכה המופקת על ידי המכשיר. התחל בסימון התאים בצבע פלואורסצנטי לפני זריעת התאים. לאחר מכן, דגרי תרבויות של פיברובלסטים עוריים אנושיים שהגיעו למצב של התמזגות (confluence) בטריפסין ו-EDTA למשך חמש דקות ב-37 °C.

לאחר מכן, סובבו את התאים שהופרדו למשך 10 דקות ב-150 ×g בטמפרטורת החדר, ושחזרו את המשקע ב-5 מיליליטר של DMEM. לאחר ספירה, התאימו את ריכוז התאים לזריעה וזרועו את התאים על הפיגומים. כעת, דגמו את פני השטח של הפיגומים המסומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לבחון את חדירות התאים; כדי לבחון חדירה עמוקה יותר לתוך הפיגומים, ניתן להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי רב-פוטוני.

ניתן להשיג חדירה של כ-200 מיקרון לתוך מרבית הפיגומים, עם או ללא תאים. לאחר גידול הפיגומים הזריעים, קבעו את הדגימות במיליליטר אחד של formaldehyde ב-PBS למשך 20 דקות ב-37 °C. לאחר הקיבוע, שטפו את הדגימות שלוש פעמים במיליליטר אחד של PBS, ולאחר מכן דגרו כל אחת מהדגימות ב-200 µL של נוגדי elastin ראשוניים למשך 30 דקות ב-37 °C.

שטפו את הדגימות שלוש פעמים נוספות ב-1 mL של PBS ולאחר מכן דגרו את הדגימות בתמיסה של נוגדן שני ב-PBS המכילה DPI למשך 30 דקות. לבסוף, לאחר שטיפה אחרונה של הדגימות ב-PBS, צלמו את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנציה תוך שימוש בעירור של 365 nanometer ופליטה של 460 nanometer עבור ה-DPI, ובעירור של 480 nanometer ופליטה של 533 nanometer עבור הנוגדן השני. ראשית, בצעו אוטוקלאב למערכת ויסות הזרימה ולבלון, ולאחר מכן, בחדר נקי, הוציאו את המערכת מאריזתה תחת מ깻 זרימה למינרית במנח המתאים לאלקטרו-ספינינג.

בשלב הבא, חברו מזרק של 50 milliliter מלא ב-PBS לצינור הענף של ברז תלת-כיווני ונפחו את הבלון באמצעות ה-PBS עד שיהיה תפוח. כעת, בצעו אלקטרו-ספינינג של הפולימר הרצוי על הבלון. תוך שימוש בתנאי ספינינג רגילים ובמרחק עבודה של 10 centimeters, הסיבים הרטובים דביקים מספיק כדי להיצמד לפני השטח של הבלון מבלי להיפרד ממנו לאחר מכן.

לאחר שהפיגום התייבש, הכניסו את הבלון לכלי סטרילי והעבירו את הכלי למתקן זרימה למינרית המתאים לתרביות תאים. תרבית של תאים על פיגום המונח על בלון מנופח, במטרה להעבידם התניה ביומכנית, היא החלק המורכב ביותר בפרוצדורה זו. חיוני להרטיב את הבלון שוב ושוב בתמיסת התאים על מנת להצמיד מספר מרבי של תאים לפיגום.

מצאנו שפעולה זו אורכת כ-20 דקות. בתוך מ !='')ה מנדף, הסירו את הבלון מהכלי והניחו אותו על משטח סטרילי, כגון צלחת הפטרי המשמשת כאן, וטפטפו באמצעות פיפט תרחיף תאים על הבלון המצופה מדי 20 שניות למשך 20 דקות, כדי לנסות לפרוס את התאים באופן שווה על פני שטח הבלון. לאחר מכן, החזירו את הבלון לכלי התרבית והוסיפו מצע תרבית שחומם מראש ומתאים לסוג התאים.

לבסוף, חברו את מכשיר הניפוח למשאבת מזרקים נפחו והשביחו את הבלון כנדרש כדי להביא למתיחה דו-צירית. ניתן להשתמש במשאבת מזרקים מנוהגת על ידי מחשב כדי להשיג משטר מתיחה מורכב יותר. ניתן להשתמש בטכניקת אלקטרו-ספינינג (Electro spinning) ליצירת פיגומים בעלי ארכיטקטורה אקראית או מסודרת.

תהליך זה הוא הדיר והסיבים הם אחידים. לדוגמה, ניתן ליצור סיבים ניצבים על ידי ביצוע אלקטרוספינינג של קבוצה של סיבים מיושרים על גבי נייר אלומיניום תוך סיבוב הנייר ב-90 מעלות, ולאחר מכן ביצוע אלקטרוספינינג מיידי של קבוצה שנייה של סיבים מיושרים מעליהם. ניתן לבצע אלקטרוספינינג לסוגים רבים של פולימרים עם מאפיינים שיכולים להשתנות במידה ניכרת, כפי שמוצג כאן עבור P-L-A-P-H-B-V-P-C-L ו-PLGA; שימו לב כי P-L-A-P-C-L ו-PLGA הם כולם פיגומים מיקרו-סיביים אחידים.

PHBV נטווה במבנה של מחרוזת פנינים, שבה סיבים ננומטריים מחברים חרוזים בגודל של 5 עד 20 מיקרון. במקרה זה, הפיגומים נטווו בתחילה באמצעות PHBV, ולאחר מכן המזרקים מולאו ב-PLA אשר נטווה מעל פיגומי ה-PHBV. תמונות אלו מציגות שכבות מייצגות בודדות של PHBV ו-PLA.

תמונה זו ממחישה כיצד עשוי להיראות חתך רוחבי של שכבה כפולה של A-P-H-B-V-P-L-A עם שרוך ננו-סיבי דחוס, שכבת PHBV ושכבת PLA מיקרו-סיבית פתוחה יותר; שלושת סוגי הפיגומים מקלים על היצמדות תאים והתרבותם. אם נדרשים פיגומים עבים יותר, ניתן להשתמש בחימום ובאידוי כדי להמיס שכבות של פיגומים יחד, כפי שמוצג במספר התמונות הבאות. שכבות פיגום מומסות אינן נפרדות, וייתכן שיהיה קשה מאוד למצוא את נקודת החיבור בין השכבות.

תמונה זו מציגה חתך של פיגום PLA שעבר אידוי וכיפוף (kneeled), שבו הוצבו יחדיו פיגומים סיביים ראשוניים בעובי של כ-150 מיקרון. לאחר מכן, נעשה שימוש באדי DCM כדי ליצור פיגומים עבים הרבה יותר, עד 500 מיקרון. תמונה זו מציגה את אותו החתך של השכבה הכפולה (bilayer) שעברה אידוי, בכשירות של פי שניים מההגדלה הקודמת. בתמונה זו ניתן להבחין כי הפיגום מורכב משכבות של סיבים עבים הרבה יותר, המפוזרות בין שכבות של סיבים דקים שנוצרו על ידי חימום; שכבות של סיבים דקים ועבים יחד מייצרות פיגומים בעלי תכונות מכניות מורכבות.

שוב, תמונה זו מציגה את אותו פיגום של מחמם כרוע בארבע פעמים. ניתן לבצע את ההגדלה הקודמת באמצעות ממברנות בשכבות עם סוגי תאים שונים, כאשר כל אחד מהם תורבת על ממברנה נפרדת ללא ערבוב, כפי שמוצג בתמונות אלו של פיברובלסטים עוריים אנושיים הצבועים בשני צבעי מעקב פלואורסצנטיים שונים לתאים. התמונה הראשונה היא של פיברובלסטים על PLA אלקטרו-סבוב.

התאים קובעו ונצבעו; כאן הפיברובלסטים הצבועים הוחדרו על גבי PHBV מולכתר. בניסוי זה, הפיברובלסטים נצבעו מראש בצבע החיוני cell tracker green. שימו לב כי התאים נמצאים בצד ה-PLA של השכבה הכפולה.

תמונה זו מציגה חתך מייצג של שכבה כפולה עם פיברובלסטים בצבע אדום על פני השטח התחתונים של ה-PHBV ופיברובלסטים בצבע ירוק על פני השטח העליונים של ה-PLA. בתמונה זו, הפיברובלסטים צבעו מראש ב-cell tracker red בזמן שגדלו על פני השטח של A-P-H-B-V. לפיכך, שימוש בצבעים פלואורסצנטיים חיים מספק מתודולוגיה נוחה לבחינת התפלגות התאים על פיגום בעוד התאים עדיין גדלים.

שיטת העיקור משפיעה על הפיגום ועל תרבית התאים העוקבת. גרף קווי זה ממחיש את ההשפעות של חומצה פראצטית, הקרנת גמא ואתנול על חוזק המתיחה הסופי ומודול יאנג של פיגום PLG.

כל אחת משיטות העיקור משנה את חוזק המתיחה המקסימלי ואת הגמישות של הפיגומים. גידול תאים על פיגומים אלה מפחית עוד יותר את מאמץ המתיחה המקסימלי שלהם, אך מגביר את הגמישות. תרשים עמודות זה ממחיש את ההשפעה של שיטת העיקור על קוטר הסיב של פיגום בודד.

להקרנה בגמא אין השפעה משמעותית על קוטר הסיבים, בעוד שחומצה פראצטית ואתנול מפחיתים את קוטר הסיבים בכ-50%. לפיכך, הדרך הטובה ביותר להשיג פיגומים סטריליים היא לייצר אותם בתנאים אספטיים. סדרת התמונות האחרונה זו מדגימה כי התאים נותרים חיוניים במהלך התרחבות דינמית וכן מייצרים כמויות מוגברות של אלסטין. שימו לב להתפתחות הצבע הכחול הכהה שנוצר על ידי התאים הגדלים, כפי שזוהה באמצעות האינדיקטור המטבולי MTT.

כאן, התאים בכחול שגודלו על בלון והוכפפו למתיחה דו-צירית פיתחו סיבי אלסטין, כפי שמעיד הצביעה הירוקה. זאת בניגוד מובהק להיעדר אלסטין כאשר אותם תאים נשמרים בתנאים סטטיים על פיגום בלון זהה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון תרבית סטטית וזרימה של נוזלים של התאים בפיגומים, כדי לבחון כיצד התאים מגיבים לתנאי תרבית שונים.

פיתוחם של תרביות תאים על פיגום המותקן על בלון הניתן להתרחבות הוכח כשימושי מאוד, שכן הוא סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום הנדסת הרקמות לבחון כעת את ההשפעה של התנייה דינמית של תאים במבני הנדסת רקמה. זכרו כי עבודה עם ספקי כוח במתח גבוה, ממסים, לייזרים ותאים אנושיים עלולה להיות מסוכנת, ויש להקפיד תמיד על הכשרה נאותה ונקיטת אמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.