הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעניק תכונות דבקות לחיידקים על מנת להקל על הפרדתם ממדיה נוזלית. זה מושג על ידי תכנון תחילה של תלתלים סינתטיים כדי לעקוף את הוויסות הגנטי המורכב ולאפשר ייצור קל ומסיבי של פולימרים דביקים. כשלב שני, חיידק דבק מדמיין ומכומת על פוליסטירן, מה שמאפשר הערכה מהירה של יעילות המכשיר הסינתטי.

לאחר מכן, חיידק נדבק מומחש על זכוכית על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. על מנת לצפות ישירות בביופילם ולקבל מידע על מבנהו, מתקבלות תוצאות המראות עלייה משמעותית בהיצמדות לזן המכיל את המכשיר הסינתטי על סמך היצמדות, מדידת אחוזים ותצפיות מיקרוסקופיות. היתרון העיקרי של גישת הביולוגיה הסינתטית על פני שיטות קיימות כמו שיבוט קונבנציונלי, הוא שניתן להשיג במהירות רבה מבנה המכיל רק את הגנים הנדרשים הברורים לחלוטין עם אותות מתאימים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הביו-מדיטציה, כגון התמודדות עם האתגר של הסרת חיידקים טעוני מתכת מפסולת רדיואקטיבית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו מתקשים מכיוון שנדרש ידע בסיסי על אותות ויסות גנטיים וטיפול במאגרי מידע. הדגמה חזותית תתמקד בכימות ובהדמיה של סרט ביולוגי מכיוון שקשה מאוד ללמוד את שני השלבים הללו בגלל השבריריות של ביו-פריימים.

הצעד הראשון לתכנון הקרון הסינתטי הוא לקבוע את הארגון הגנטי של הגנים המתולתלים ולמקם את האותות האנדוגניים, השעתוק והתרגום שלהם. זה מושג באמצעות מסדי נתונים מיוחדים כגון REON DB או eco gene. השלב הבא הוא לבחור את חמשת הגנים הנדרשים לחלוטין לסינתזה מתולתלת, CSGB ו-CSGA ולקודד את מונומרי הסיבים ו-C-S-G-E-C-S-G-F ו-CSGG מקודדים את קומפלקס ההפרשה המסתלסל, לחלץ את הרצפים שנבחרו ממסד הנתונים בניהול נתונים בפורמט מהיר יותר ובסיליקו ניתוח מקדים יבוצע עם תוכנת מנהל שיבוט מכיוון שאשכול C-S-G-G-F-E הוא אנטי-סנס בגנום ה-e coli.

יש להמיר רצף זה למקבילו המשלים ההפוך. השתמש בכלי מנהל השיבוט פעולות תהליך מולקולה היפוך מולקולה, הדבק את רצף C-S-G-E-F-G מאחורי C-S-G-B-A באמצעות הפונקציה. לאחר מכן, הוסף את PRCN המקדם המתאים מול רצף ה-C-S-G-B-A-E-F-G iCal.

לוקוס ה-RCN מקודד משאבת FLX RCNA, האחראית על ניקוי רעלים מניקל וקובלט, ומווסת המטאלו המקביל שלה RCNR. בהיעדר קובלט או ניקל, המדכא RCNR נקשר לתיבת ה-RCNR ב-DNA ומונע את הפעלת השעתוק המלאה של הגנים במורד הזרם. אם הריכוז התוך-תאי של קובלט או ניקל עולה, הקישור של קובלט או ניקל לחלבון RCNR מונע את קיבוע המדכא למקדם ופעילות השעתוק של P-R-C-N-A עולה על ידי הצבת חמשת הגנים המתולתלים שנבחרו תחת שליטת המקדם.

מתולתל PRCN צפוי להיות מיוצר יתר על המידה בנוכחות קובלט וניקל. לאחר מכן בצע אופטימיזציה של אותות השעתוק על ידי הוספת אתר קשירת ריבוזום מושלם או RBS מול ה-A TG הראשון של CS gba, רצף DNA ו-RBS מושלם שני מול רצף C-S-G-E-F-G. כדי להתאים לתקני I GMs, המכשיר חייב להיות מוקף בקידומת לבנים ביולוגית סטנדרטית המכילה אתרי הגבלה עבור ECO R one ו-X-bar one, וסיומת המכילה אתרי הגבלה עבור SPE one ו-PST אחד כדי להקל על הרכבה נוספת.

חלק הלבנים הביולוגיות עצמו עשוי שלא להכיל אתרי זיהוי ECO R אחד, PST אחד SPE אחד ו-X-bar R אחד. לפיכך, אתרים אלה בוטלו על ידי שינויי מוטציה שקטים בניתוח הגבלת הסיליקון של המכשיר חשף PST אחד, אתר אחד ברצף CSGA, PST אחד אתר אחד ברצף RCNR ואחד ECO R אחד בגן CSGE. אתרים אלה שונו על ידי מוטציות שקטות.

לאחר השלמת התכנון של האופור הסינתטי, הפעל סימולציית תרגום באמצעות תוכנת מנהל השיבוט. השתמש בפיצוץ תוכנית יישור הרצף כדי לאמת הומולוגיה מושלמת בין החלבונים המתולתלים מסוג הבר לבין החלבונים המקודדים על ידי הסינתטי כדי להתחיל בהליך זה עבור כל באר של צלחת פוליסטירן של 24 בארות עם שני מיליליטר של M 63, מדיום מינימלי עם 0.2% גלוקוז לחסן כל באר עם 10 עד שישה תאים של תרבית חיידקים בלילה. לגדל את החיידקים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 48 שעות מבלי לנער כל עמוד בצלחת 24 הבארות מייצג שיטה.

הכמות הנכונה של קובלט ואנטיביוטיקה מתווספת בעת הצורך. שלוש השורות הראשונות משמשות לכימות החיידקים הדבקים ב-A על ידי חישוב ממוצע של שלוש החזרות. השורה האחרונה שנותרה משמשת להדמיית הביופילם על ידי צביעה סגולה קריסטלית לאחר 18 עד 48 שעות, לשחזר את הסופינט המכיל את התאים הפלנקטוניים מכל באר משלוש השורות הראשונות של צלחת 24 הבארות ולהעביר את הסופינט לצינור המוליזה.

יש לשטוף בזהירות כל באר עם מיליליטר אחד של מדיום M 63 ולמשוך את הכביסה בצינור ההמוליזה עם הספינט הראשוני. בריכה זו מכונה תאי שחייה בשם S.קרקעית הבארות במיקרופלייט מכוסה בתאי הדבקה. כדי לשחזר את הביופילם, הוסף מיליליטר אחד של M 63 לכל אחד.

מגרדים היטב עם קצה הפיפטה ואז משנים את הפיפטה למעלה ולמטה ומעבירים את שבר הביופילם לצינור המוליזה חדש. מערבולת את הצינור למשך 15 שניות. אסוף את שבר הביופילם בצינורות המוליזה.

מאגר זה מייצג את התאים המחוברים לפני השטח הנקראים B מעבירים 200 מיקרוליטר של הסופינט ושבר הביופילם מצינורות ההמוליזה לצלחת של 96 בארות. העריכו את מספר החיידקים המחוברים למשטח ושוחים מהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר. אחוז ההיצמדות לכל שיטה מחושב על ידי שימוש בנוסחה B כפול 100 חלקי שלוש פעמים S ועוד B.To לדמיין את הביופילם רק עבור השורה האחרונה של 24, צלחת הבאר השליכו את תאי הפלנקטון מבארות אלה.

הוסף מיליליטר אחד של M 63 לכל באר כדי לשטוף את הביופילם שהתפתח בתחתית הצלחת. יבש את הצלחת החשופה למשך שעה בחום של 80 מעלות צלזיוס לאחר שעה, הוסף 100 מיקרוליטר של 20% סגול קריסטל לשניים לכל באר ואחריו שטיפות נרחבות במים. נדרשת שלדה פלואורסצנטית לפרוטוקול זה.

מארח מתאים לפלסמיד הנושא את הסלסול הסינטטי הוא הזן האחד e coli SCC, המבטא באופן מכונן חלבון פלואורסצנטי ירוק ללא הבדל ניכר מזן האב MG 1 16 55. שנה את הזן המארח עם פלסמיד פאק 57 הנושא את התלתלים הסינתטיים כדי להשיג את זן S 23. הפוך את מתח המארח עם פאק פלסמיד בקרה 18 כדי להשיג את מתח הבקרה.

S 24 מגדל תרביות טרום בן לילה של הזנים S 23 ו-S 24 ב-30 מעלות צלזיוס. במדיום M 63 בתוספת גלוקוז ואמפיצילין למחרת, הוסף 20 מיליליטר של מדיום M 63 לצלחת פטרי ולאחר מכן חסן 15 מיליליטר של M 63 בצלחות פטרי עם 100 מיקרוליטר של תרביות קדם. הוסף את הריכוז המתאים של קובלט ואל תשכח את השליטה השלילית ללא קובלט.

הכניסו שלושה פתקי כיסוי זכוכית מלבניים לכל צלחת פטרי. דגרו את הכלים למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. ניתן לדמיין חיידקים ישירות תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי בימים הבאים.

חשוב להימנע מייבוש הדגימה, ולכן יש לבצע את השלבים הבאים בזהירות אך במהירות. הסר כל פתק כיסוי מכלי הפטרי ורוקן אותו בזהירות. נקו בזהירות את הפנים התחתונות עם צמר גפן קטן ספוג באתנול 70% כדי לנגב את כל שאריות החיידקים להשגחה קונפוקלית.

הנח את פתק הכיסוי על מגלשת זכוכית כאשר הפנים העליונות מכוסות על ידי הביופילם מונחות עם הפנים כלפי מעלה. לאחר מכן מכוסה הביופילם בהחלקת כיסוי גדולה יותר, המקובעת לזכוכית. החלק עם לכה.

הפוך את ההגדרה כך שהביופילם יהיה כעת על הפנים התחתונות. הנח את ההתקנה מתחת למיקרוסקופ הלייזר הקונפוקלי בניסוי זה. מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי של Zeiss LSM חמש 10 מטא קונפוקלי משמש בתוך פלטפורמת המיקרו CT.

בחר את יעד טבילת השמן פי 40. השתמש בהגדרות הבאות, עורר GFP ב-4 88 ננומטר ואסוף את הקרינה החיידקית בטווח של 500 עד 600 ננומטר. השתמש במטרת טבילת השמן פי 40 לרכישת תמונות.

במצב קונפוקלי של סריקת לייזר. סרוק את המבנים התלת-ממדיים הכוללים של הביופילמים מהמשטח המוצק ועד לממשק עם מצע הגידול. באמצעות צעד של מיקרון אחד.

בצע הקרנות תלת מימדיות עם תוכנת maus, קבע את עובי הביופילם על ידי ניתוח ערך C הממוצע לאורך קטעי אורך סטטיסטיים. כימות של ביופילם, ניתן לחלץ נפחי ביו מערימות Z קונפוקליות. ניתן להעריך את יכולות ההיצמדות של אי קולי המהונדסים לייצר יתר על המידה מתולתל בתגובה למתכת בשיטות פשוטות.

לדוגמה, צביעה סגולה קריסטלית על 24 לוחות איירין מלוטשים היטב מאפשרת הדמיה מהירה של היווצרות ביופילם בתחתית כל באר, כפי שמוצג על ידי ההבדל בעוצמת הצבע הסגול. נראה כי הזן מסוג הבר הוא פחות דבק מהזן המהונדס. שיטה כמותית היא למדוד את אחוזי ההיצמדות לפוליסטירן מסוג הבר והזנים המהונדסים עם ריכוזים שונים של קובלט.

התוצאות המוצגות בגרף זה מגלות כי אחוז ההיצמדות של הזן המהונדס גבוה פי 1.5 מזה של זן הבר בהיעדר קובלט. בנוסף, חיזוק משמעותי של היצמדות בנוכחות ריכוזים הולכים וגדלים של קובלט נצפתה במדיה עם ריכוזי קובלט של 25 מיקרומולר או 50 אחוזים מיקרומולריים של תאים מהונדסים היצמדות מגיעים ל-30% ו-40% בהתאמה. ניתן להשוות את יכולות ההיצמדות גם באמצעות מיקרוסקופיה עם חיידקים מתויגים GFP הגדלים על שקופיות זכוכית, תצפיות מיקרוסקופ פלואורסצנטיות של חיידקים ירוקים על רקע שחור מגלות כי הזן המהונדס יוצר ביופילם, בעוד שזן הטריפ הפראי יוצר רק מושבות מיקרו המסומנות על ידי החצים.

ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית מספק מבט כולל על המבנה התלת מימדי של הביופילם. שחזורי תצוגה עליונה מוצגים בפאנלים A ושחזורי מבט מהצד מוצגים בפאנלים B.התוצאות מאשרות כי הזן המהונדס הוא דבק יותר ויוצר ביופילם צפוף ועבה יותר מהסוג הפראי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לבדוק שוב את תכנון הפעולה, למשל, כדי לחקור את פוטנציאל התיווך הביולוגי של אי קולי או נמלים כובשות בהקשר של שפכים רדיואקטיביים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעצב פתוח סינתטי באמצעות תוכנת מנהל שיבוטים וכיצד לכמת במהירות את הביטוי של זני חיידקים. אל תשכח שעבודה עם גנים סינתטיים ואורגניזמים מהונדסים גנטית יכולה להיות מסוכנת ביותר. הם חייבים להיות כפופים לחוקים הנוכחיים ואמצעי זהירות כגון חיטוי חיידקים שעברו טרנספורמציה תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.