נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק אוכלוסייה של תאי מקור עצביים (neuronal progenitors) מומחצים מגנגליונים של מערכת העצבים ההיקפית. זאת על ידי נתיחה ראשונית של האיבר או של גנגליונים ספציפיים רלוונטיים מעכברי עובר. לאחר מכן, הרקמות מופרדות באופן חלקי כדי לשחרר את התאים הבודדים אל המצע הסביבתי.

בשלב הבא, תרחיף התאים מסונן כדי להסיר גושי רקמה שנותרו או צברים גדולים. לבסוף, תרחיף התאים עובר מיון באמצעות זרימה (flow sorting) כדי לבודד את האוכלוסייה הרצויה, בהתבסס על ביטוי של מדד פלואורסצנטי באותה אוכלוסיית תאים. בסופו של דבר, ניתן להשוות תבניות של ביטוי גנים בין תאי פרוגניטור, שבודדו בשלבים שונים של ההתפתחות, או בין אוכלוסיות מטוהרות של סוגי תאים עצביים שונים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני בידוד של אוכלוסיות תאים המבוסס על סימון בנוגדנים הוא ש sıמון תאים המבטאים גן מסוים באמצעות ריאגנטים אימונולוגיים אינו זמין לעיתים קרובות. קווי עכברים מהונדסים גנטית המייצרים חלבון פלואורסצנטי בתתי-אוכלוסיות נוירונליות מוגדרות מאפשרים את בידודן של אוכלוסיות תאים אלו. בעוד שאנו מדגימים שיטה זו לבידוד של תאי מוצא עצביים מהמעי ומהמסלול הנוירוגני של הפה, ניתן ליישמה גם במערכות מודל אחרות המבטאות רפורטרים פלואורסצנטיים.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנוטה להתרחש עיכול יתר של רקמות המקור, מה שמוביל לאובדן חיוניות התאים. לפני תחילת הדיסקציה, יש לבחון את העוברים תחת תאורת שדה בהיר (brightfield) כדי לוודא שהמבנים הרלוונטיים נמצאים במיקוד. לאחר מכן, זהו את העוברים החיוביים לטרנסגן על ידי סריקה של ביטוי reporter פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי.

לאחר ההמתה, התחילו את העבודה עם העוברים על ידי הוספה של כמות מינימלית של PBS לצלוחית הניתוח, כדי שהעובר לא יצוף בזמן השליפה של הרקמות. פתחו את עורו של העובר לאורך דפנות הגוף וברוחב הבטן בגובה הכבד. גלו את העובר על גבו והשתמשו בפינצטה עדינה כדי לקבע אותו במקומו.

בגובה הגפה הקדמית, הכניסו זוג פינצטות נוסף בגובה הסרעפת, ולאחר מכן משכו במהירות את האיברים הפנימיים כלפי מטה לכיוון הזנב והרחוקו מדופן הגוף הגבית כדי להוציא את האיברים הפנימיים מהכבד ועד לפגנת המין. אם איברים כלשהם מחלל החזה, כגון הלב או הריאות, יוצאים כשהם מחוברים לאיברים הפנימיים, הסירו אותם לפני ההמשך.

לאחר הפרדת האיברים הפנימיים של הבטן מהגוף, הכניסו פינצטה מתחת לכבד, בקרבת הקיבה, והפרידו בעדינות את הכבד מהמעי. לאחר מכן, נתקו בזהירות את המעי האחורי מהשקת הגב והסירו את המעי ממהלך מערכת השתן והמין. לבסוף, הפכו את המעי כך שהטחול יהיה גלוי מתחת לקיבה.

הסיר את הטחול ואת הלבלב. הרחק את לולאות המעי זו מזו על ידי אחיזה במזוֹגסטריום (mesentery). לאחר מכן, הסר את המזוֹגסטריום ואת כלי הדם הנלווים מהמעי באמצעות משיכה עדינה של המזוֹגסטריום.

הימנעו מאחיזה ישירה של המעי באמצעות הפינצטה. אם המעי נקרע, פשוט איספו את החלקים הנפרדים בשלב הדיסוציאציה. איספו כל סוג רקמה יחד בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter המכילה HBSS קר מאוד, בהתאם לסוג הרקמה ולסוג הפנוטיפ של העובר.

לאחר השקיעה (pelleting), יש לשאוב מהרקמות החתוךים כמה שיותר HBSS. לאחר מכן, יש להשעות מחדש את משקע הרקמה במיליליטר אחד או יותר של ACU max. יש להחליף את טיפי הפפיטה בין כל דגימה.

כדי למנוע זיהום צולב של סוגי רקמות, הנח את המבחנות במקבץ מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 45 דקות. בהתאם לשלב של בידוד הרקמה, הדיסוציאציה והסינון של הרקמה הם החלקים המורכבים ביותר בפרוצדורה, וזאת כדי למנוע דיסוציאציה מוגברת של הרקמה, אשר תוביל כתוצאה מכך לחיוניות תאים נמוכה.

הגבילו את זמן הדיסוציאציה ואל תנסו לפרק לחלוטין את כל חתיכות הרקמה באמצע התהליך. ובסיום זמן הדיסוציאציה, פרקו את הרקמה באופן ידני על ידי הקשה חזקה של המבחנה בדופן אמבט המים ותנועת שורש יד חדה כלפי מטה. כעת העבירו את הדגימות שעברו דיסוציאציה לקרח והוסיפו מיד 1 mL של תמיסת quench שהוכנה טרי לכל מבחנה, תוך שימוש בקצה פיפט חדש לכל דגימה, ובצעו פיפטאז (pipetting) של הדגימה עד שהרקמה תהיה כמעט מפורקת לחלוטין.

כעת, בעזרת זוג פינצטות שעผ่านมา עיקר ב-ethanol, הניחו ריבוע של 3 ס"מ של ממבנה רשת ניילון ברוחב 38 micron מעל פיו של מבחנה קונית חדשה בנפח 15 milliliter. לאחר מכן, השתמשו בקצות טיפים בעלות קוטר צר כדי לסנן את תמיסת התאים שהושעו באופן פרטני דרך הרשת, על ידי פיפטור לתוך מרכז הממברנה. לאחר סינון ת сусפנזיית התאים, שטפו את מבחנת הדגימה עם 1 milliliter של quench one to five וסננו את התאים שנותרו.

לאחר מכן, הסירו את הממברנה תוך הקפדה למנוע מדגימות רקמה שלא עברו סינון להיכנס למבחנה. לאחר סבב הצנטריפוגה (pelleting), שאבו את הנוזל העליון (supernatant) מתרחיפי התאים ושחזרו את המשקע (pellet) ב-1 mL של quench one to five. לאחר מכן, סננו כל תרחיף תאים דרך רשת ניילון לתוך מבחנות פוליסטירן של 5 mL, כפי שהודגם כעת.

התחילו בהפרדת מנה קטנה (aliquot) מדגם הפלואורסצנציה עבור בקרת הפיצוי ל-EGFP בלבד. לאחר מכן, חלקו את דגימת הרקמה מסוג הפרא לשני חלקים, כאשר אחד מסומן כסוג פרא בלבד והשני כ-seven A a d.Only. כעת מלאו את כל מבחנות הדגימות ב-quench 1-5, ולאחר השקיעה של הדגימות, שאבו את כל העלייה (supernatant) פרט ל-200 µL האחרונים בכל מבחנה.

לבסוף, הוסיפו 7-AAD לדגימות המיועדות למיון ולביקורת ה-7-AAD בלבד. לאחר מכן, הוסיפו 0.75 מיליליטר של triazole LS לתוך מבחנות איסוף דגימות במיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. התחילו בשימוש בדגימות הביקורת כדי לקבוע את פרמטרי הפיצוי והשערים (gates), במטרה למנוע הכללה של תאים מתים חיוביים ל-7-AAD ולאסוף תאים המראים עצימות גבוהה של פלואורסצנציית GFP.

לאחר קביעת פרמטרי הפיצוי, התחילו במיון בלחץ הנמוך ביותר האפשרי עם נחיר בעל קוטר רחב וקצב זרימה נמוך. אספו מקסימום 25,000 תאים לכל מבחנה של מיקרו-צנטריפוגה כדי ש-triol LS לא ייהיה מהול מדי. מיד לאחר המיון, בצעו וורטקס לכל מבחנה של תאים שנלכדו ב-triol ls.

באיור ראשון זה מוצג מסלול רבייה נקבי של עכבר בשיטת whole mount ביום ה-15.5 לאחר ההפריה, כפי שנצפה ממבט ונטרלי תחת תאורה בשדה בהיר. אותה דגימה נצפית תחת תאורה פלואורסצנטית כדי להדגים את התפלגות התאים החיוביים ל-EGFP בבלוטת האדרנל ובגנגליונים הצליאקיים הממוקמים מדיאלית, כפי שזוהו על ידי ביטוי הטרנסגן TH EGFP שלהם. מבט לטרלי זה של שלפוחית שתן שבוצעה לה הפרדה מיקרוכירורגית ביום ה-15.5 לאחר ההפריה ב-TH EGFP מראה פלואורסצנציה מביטוי הטרנסגן בגנגליונים הפלביים, בדופן שלפוחית השתן ובשופכה.

במבט גבי זה של אותו דגם, תאי EGFP חיוביים ניכרים ברקמת השופכה הגבית הקדמית; פירוק רקמות להפקת תרחיפי תאים לצורך מיון באמצעות זרימה הוא איזון עדין בין עיכול אנזימטי מספיק לבין הימנעות מעיכול יתר, שעלול להוביל לשונות נמוכה בתאים. מיקרוגרפיות אלו מציגות רקמות של דרכי השתן התחתונות ושל המעי בחצי מזמן הפירוק. כפי שניתן לראות בתמונות אלו של רקמה שעוכלה כראוי לפני ואחרי טיפול ידני, ניתן עדיין להבחין בבירור בחתיכות קטנות של איברים שפוּרקו באופן חלקי ברקמות שעברו טיפול אנזימטי זמן רב מדי או בריכוז גבוה מדי של אנזים.

עם זאת, התרחיף שהתקבל אינו מכיל שרידים של חתיכות רקמה גדולות; דיסוציאציה נאותה וסינון ידני מניבים פרופילי ציטומטריה של זרימה המראים בדרך כלל יותר מ-90% תאים חיוניים, ובאותם תאים המבטאים את הרפורטר באוכלוסייה חיונית זו, התאים שומרים על ביטוי EGFP בעוצמה גבוהה. האוכלוסייה השחורה מורכבת מתאים בודדים מתים המסומנים על ידי ספיגה של צבע הפלואורסצנציה 7-AAD. האוכלוסייה האפורה מורכבת מתאי סינגלט, על סמך פיזור קדמי וצידי, אשר דחו את ה-7-AAD ולכן הם חיוניים.

האוכלוסייה הירוקה מגיעה מהאזור הסגור החיובי ל-GFP ומורכבת מתאים בודדים חיוניים אשר הוציאו שבעה A a d, ומגלים פלואורסצנציית EGFP. באמצעות הליך זה, ניתן לבצע בידוד של תאי אב עצביים מרקמות פריפריאליות אחרות, כגון הש chain הסימפתטית, השורש הגבי, גנגליונים או הריאה, במטרה לענות על שאלות הנוגעות להבדלים בפרופילי ביטוי גנים בין אוכלוסיות או להתפתחות של שושלות תאים נבדלות.