נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק אוכלוסייה של אבות עצביים מטוהרים מגרעיני מערכת העצבים ההיקפית. זה מושג תחילה על ידי ניתוח האיבר או הגרעינים הספציפיים המעניינים מעכברים עובריים. לאחר מכן הרקמות מנותקות חלקית כדי לשחרר את התאים הבודדים למדיה שמסביב.

לאחר מכן, תרחיף התאים מסונן כדי להסיר שאריות של גושי רקמה או אגרגטים גדולים. לבסוף, תרחיף התא ממוין בזרימה כדי לבודד את אוכלוסיית העניין על סמך ביטוי של מדווח פלואורסצנטי באותה אוכלוסיית תאים. בסופו של דבר, ניתן להשוות דפוסי ביטוי גנים בין אבות, מבודדים בשלבי התפתחות שונים, או בין אוכלוסיות מטוהרות של סוגי תאים עצביים שונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני בידוד אוכלוסיות תאים על סמך תיוג נוגדנים הוא שלעתים קרובות ריאגנטים חיסוניים אינם זמינים. תאים המבטאים גן מסוים, קווים מהונדסים גנטית של עכברים המייצרים חלבון פלואורסצנטי בתת-קבוצות עצביות נפרדות מאפשרים בידוד של אוכלוסיות תאים אלה. בעוד שאנו מדגימים שיטה זו לבידוד אבות עצביים ממסלול המעי והנוירוגנים של הפה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות מודל אחרות המבטאות מדווחים פלואורסצנטיים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם נוטים לעכל יתר על המידה את רקמות המקור וכתוצאה מכך לאבד את כדאיות התאים. לפני תחילת הדיסקציה, הצג את העוברים על ידי תאורת שדה בהיר כדי לוודא שהמבנים הרלוונטיים נמצאים בפוקוס. לאחר מכן זהה את העוברים החיוביים הטרנסגנים על ידי סינון ביטוי המדווח הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.

לאחר המתת חסד, העוברים מתחילים בהוספת כמות מינימלית של PBS לצלחת הדיסקציה, כך שהעובר לא צף בזמן ניתוח הרקמות. פתח את עור העובר לאורך צידי הגוף ולרוחב הבטן בגובה הכבד. גלגל את העובר על גבו והשתמש במלקחיים עדינים כדי להצמיד אותו למקומו.

ברמת הגפה הקדמית, הכנס זוג מלקחיים נוסף בגובה הסרעפת, ולאחר מכן במהירות. משוך את האיברים הפנימיים כלפי מטה לכיוון הזנב והרחק מדופן הגוף הגבי כדי להסיר את הקרביים מהכבד עד לפקעת איברי המין. אם איברים כלשהם מחלל בית החזה, כגון הלב או הריאות, יוצאים מחוברים לקרביים, הסר אותם לפני שתמשיך הלאה.

לאחר הפרדת קרבי הבטן מהפגר, הכנס זוג מלקחיים מתחת לכבד, ליד הקיבה, והקניט בעדינות את הכבד הרחק מהמעי. לאחר מכן נתח בזהירות את המעי האחורי הרחק מהשופכה הגבית והסר את המעי ממערכת השתן. לבסוף, הפוך את המעי כך שהטחול נראה מתחת לקיבה.

הסר את הטחול והלבלב. משוך את לולאות המעיים על ידי אחיזה במזנטריה. לאחר מכן הפשיטו את המזנטריה וכלי הדם הנלווים מהמעי על ידי משיכה עדינה של המזנטריה.

הימנע מהחזקת המעי ישירות עם המלקחיים. אם המעי נשבר, פשוט אסוף את החלקים הנפרדים בשלב הדיסוציאציה. אסוף כל סוג רקמה יחד בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל HBSS קר כקרח לפי סוג הרקמה וסוג הפנוטיפ של העובר.

לאחר הגלולה, הרקמות המנותחות שואבות כמה שיותר HBSS. לאחר מכן השעו מחדש את כדור הרקמה במיליליטר אחד עד כמה מיליליטר של ACU מקסימום. החלפת קצות פיפטה בין כל דגימה.

כדי למנוע זיהום צולב של סוגי רקמות, הכניסו את הצינורות לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 45 דקות. בהתאם לשלב הרקמה המבודדת, דיסוציאציה וסינון של הרקמה הם החלק המסובך ביותר בהליך למניעת דיסוציאציה גלויה של הרקמה. וכתוצאה מכך, כדאיות תאים נמוכה.

הגבילו את זמן הדיסוציאציה ואל תנסו לנתק לחלוטין את כל חלקי הרקמה באמצע הדרך. ובסוף זמן הדיסוציאציה, פרק את הרקמה באופן ידני על ידי דפיקות נמרצות של הצינור על דופן אמבט המים והשלכת הצינור כלפי מטה בתנועת פרק כף היד. כעת העבירו את הדגימות המנותקות לקרח והוסיפו מיד מיליליטר אחד של מרווה טרי מוכן לכל צינור באמצעות קצה פיפטה חדש לכל דגימה, שלשו את הדגימה למעלה ולמטה עד שהרקמה מתנתקת כמעט לחלוטין.

כעת באמצעות זוג מלקחיים מעוקרים באתנול, הניחו ריבוע של שלושה סנטימטרים של קרום רשת ניילון 38 מיקרון מעל פיו של צינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן השתמש בקצות קידוח צרות כדי לסנן את תמיסת התא המרחף הבודדת דרך הרשת על ידי פיפטינג למרכז הממברנה. לאחר סינון תרחיף התאים, שטפו את צינור הדגימה במיליליטר אחד של מרווה אחד עד חמישה וסנן את כל התאים שנותרו.

לאחר מכן הסר את הממברנה תוך הקפדה על מניעת כניסת דגימות רקמה לא מסוננות לצינור. לאחר הגלולה, תרחיפי התאים שואבים את הסופרנטנט ומשהים את הגלולה במיליליטר אחד של מרווה אחד עד חמש. לאחר מכן סנן כל מתלה תאים דרך רשת ניילון לצינורות פוליסטירן של חמישה מיליליטר כפי שהוצג זה עתה.

התחל בשמירת מנה קטנה של דגימת הקרינה לבקרת הפיצוי של EGFP בלבד. לאחר מכן חלקו את דגימת הרקמה מסוג הבר לשתי מנות המסמנות סוג בר אחד בלבד ושבע האחרות A a d.Only. כעת מלאו את כל צינורות הדגימה במרווה אחת עד חמש, ולאחר הגלולה הדגימות שואבות את כל 200 המיקרוליטרים האחרונים של סופרנטנט בכל שפופרת.

לבסוף, הוסף שבע a a d לדגימות שיש למיין ואת שבע a a d בלבד. לאחר מכן הוסף 0.75 מיליליטר טריאזול LS למיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צינורות איסוף דגימות מתחילים בשימוש בדגימות הבקרה כדי להגדיר את פרמטרי הפיצוי והשערים כדי למנוע שבעה תאים מתים חיוביים A a D ולאסוף תאים המציגים עוצמה גבוהה של פלואורסצנטיות GFP.

לאחר קביעת פרמטרי הפיצוי, התחל למיין בלחץ הנמוך ביותר האפשרי עם זרבובית קדח רחבה וקצב זרימה נמוך. אסוף מקסימום 25,000 תאים לכל צינור מיקרו צנטריפוגה כך שהטריול LS לא ידולל יתר על המידה. מיד לאחר מיון המערבולת, כל צינור של תאים נלכד בטריול ls.

באיור הראשון הזה, מערכת איברי מין שלמה של הר אירו ב-15.5 ימים לאחר קיום יחסי מין נראית בגחון תחת תאורת שדה בהיר. אותה דגימה נצפית תחת תאורה פלואורסצנטית כדי להדגים את התפלגות התאים החיוביים של EGFP בגרעיני הצליאק של יותרת הכליה והמדיאלית כפי שזוהו על ידי ביטוי הטרנסגן TH EGFP שלהם. מבט רוחבי זה של 15.5 ימים לאחר ניתוח שלפוחית השתן TH EGFP מראה פלואורסצנטיות מביטוי טרנסגנים בגרעיני האגן, דופן שלפוחית השתן והשופכה.

במבט גבי זה של אותו EGFP, תאים חיוביים ניכרים בשופכה הגבית הקדמית, דיסוציאציה לייצור תרחיפי תאים למיון זרימה הוא איזון עדין בין עיכול אנזימטי הולם והימנעות מעיכול יתר שעלול לגרום לשונות תאים נמוכה. מיקרוגרפי צילום אלה מראים רקמות דרכי השתן והמעי התחתונות באמצע זמן הדיסוציאציה. כפי שניתן לראות בתמונות אלה של רקמות מעוכלות כראוי לפני ואחרי ההדרכה, שלושה חלקים של איברים מנותחים עדיין ניכרים בבירור ברקמות המטופלות אנזימטית במשך זמן רב מדי או בריכוז גבוה מדי של אנזים.

עם זאת, המתלה המתקבל חסר כל שאריות של פיסות גדולות של דיסוציאציה מתאימה לרקמה וסינון ידני מייצר פרופילי ציטומטריית זרימה המציגים בדרך כלל יותר מ-90% תאים ברי קיימא ותאים אלה המבטאים את המדווח באוכלוסייה בת קיימא זו, תאים שומרים על ביטוי EGFP בעוצמה גבוהה. האוכלוסייה השחורה מורכבת מתאים בודדים שמתים ומסומנים על ידי ספיגה של שבעה מתים פלואורסצנטיים. האוכלוסייה האפורה מורכבת מתאי סינגל המבוססים על פיזור קדימה וצדדי שלא כללו 7 a a d, ולכן הם ברי קיימא.

האוכלוסייה הירוקה היא מהאזור החיובי ל-GFP מגודר ומורכבת מתאים ברי קיימא בודדים שלא כללו שבעה A a d, ומציגים פלואורסצנטיות EGFP. בהליך זה ניתן לבצע בידוד של אבות עצביים מרקמות היקפיות אחרות כמו השרשרת הסימפתטית, שורש הגב, הגרעינים או הריאה על מנת לענות על שאלות לגבי הבדלים בפרופילי ביטוי גנים בין אוכלוסיות או לגבי התפתחות שושלות מובחנות.