Name: Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למד את שיטת גלוונוטקסיס לניתוח נדידת תאי מקדם עצבי מוח מבוגרים בשדה חשמלי ישר. השיטה משלבת הכנת תאים מעכברים בוגרים, צילום טיים-לאפס וניתוח קינמטי להבנת התנהגות התאים ויישומיה בריפוי עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (מענק # 249669, ו# 482986) ולב ושבץ קרן של קנדה (מענק # 485508). המחברים מודים יוסוף אל האייק וואן ד&quot;ר צ&#39;י על סיועם בפיתוח פרוטוקולי הניסוי.

כל ההליכים כרוכים בטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת טורונטו ועדת טיפול בבעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיות (פרוטוקול לא. 20009387). השיטות הבאות יש לבצע באמצעות כלים וטכניקות סטריליות, במכסת מנוע זרימה למינרית היכן שאפשר. בטקסט הפרוטוקול להלן, הביטוי &quot;EFH-SFM&quot; מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת עם גורם צמיחה אפידרמיס, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי והפרין. EFH-SFM משמש כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs עבר התמיינות בגלל mitogens אלה לשמור NPCs ב4 המדינה המובחנות שלהם. כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs המושרה להתמיין לסוגי תאים בוגרים, &quot;FBS-SFM&quot; מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת סרום שור עוברי 1%. FBS מקדם את הבידול של NPCs לפנוטיפים בשלים עצביים 5. 1. בידוד ותרבות של מבשרים עצביים (לאשמוצג בסרטון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש CD1 עכבר (6-8 שבועות) עם isofluorane והקרבה באמצעות פריקת צוואר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את הראש באתנול 70% ולערוף את החיה במספריים חדים נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את הראש עם מלקחיים כירורגיים, הסר את העור על פני שטח הגבו לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל ולא. 11 להב, להבקיע את הגולגולת בסינוס המצח לאורך ציר mediolateral, וגם לאורך תפר sagittal בכיוון rostrocaudal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלף את העצמות הקודקודית מהראש ללא. 7 מלקחיים מעוגלים, נזהרים שלא לנקב את רקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מרית דקה מתחת למוח מתחיל מתחת למוח הקטן והתקדם לעבר נורות חוש הריח. בעוד מחזיק את הגולגולת במקום עם מלקחיים, משוך בעדינות את המוח מהגולגולת ולמקם אותו באופן מיידי בנוזל השדרתי מלאכותי קר כקרח (ראה מתכונים בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ נתיחה, באמצעות סטרילימספריים ומלקחי נתיחה יחתכו את המוח במחצית לאורך קו האמצע. סובב אונה כל כך שהמשטח המדיאלי (חתך) פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חצי כדור, ועם פני השטח המדיאלי פונים כלפי מעלה, אתר splenium של כפיס המוח (אזור אחורי של כפיס המוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך מפני השטח של קליפת המוח לsplenium של כפיס המוח לאורך ציר dorsoventral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולף את הקליפה החרוטה כלפי נורת הריח לחשוף את הקירות המדיאלי וצדדיים של חדר הצדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הכדור, כך שהמשטח הגבה פונה כלפי מעלה, ולהשתמש microscissors המעוגל לגזור ולאסוף את הקירות החשופים המדיאלי וצדדיים, שמכילים את האזור שבו periventricular NPCs מתגורר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.8-1.11 לאונה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הרקמות המבודדות ל7 מ&quot;ל של פתרון טריפסין (ראה מתכון בהמשך) בצינור סמ&quot;ק 15, ולמקם את הצינור על כיסא נדנדה ב37 מעלות צלזיוסחממה על 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ורקמות ב2 מ&quot;ל של תמיסת מעכב טריפסין (ראה מתכון בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות triturate רקמות עם 30-50 פעמי פיפטה קטנות קידוח פסטר בזהירות כדי להימנע מבועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend וב1-2 מ&quot;ל של SFM (ראה מתכון בהמשך) על ידי triturating הגלולה 3-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד ל3 דקות, לשאוב 1 מיליליטר supernatant ו resuspend בSFM + EFH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירה לחיות צפיפות תאים עם haemocytometer וצלחת התאים בבקבוק תרבות T25 בצפיפות של 10 תאים לμl בSFM + EFH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשה התרבות לצמוח במשך 7 ימים ללא הפרעה להניב neurospheres העיקרי צף מורכב מNPCs. </li></ol> 2. הכנת Galvanotaxis הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זכוכית מרובעת 3 לא. 1 תלושי כיסוי (22 x 22 x 0.17 מ&quot;מ) אניבקבוק na של 6N חומצה הידרוכלורית בן הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, השתמשו יהלום קצה של כוס מחתך לחתוך 6 רצועות מלבניות (22 X 5 X 0.17 מ&quot;מ) של זכוכית מלא מרובע. 1 תלושי עטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התלושים המרובעים חומצה השטופות וחוטרים מלבניים למכסת מנוע זרימה למינרית. שוטף את הרצועות הראשונות עם אתנול 70% המלבניות ומרובעות, עם מי autoclaved תרבות כיתת רקמות, ולאפשר לו להתייבש על קים נגב (על סטריליות הוסיפה, הזכוכית ניתן לאפשר לו להתייבש באוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח משחת ואקום להיקף של פני שטח באחת שקופיות הזכוכית המרובעות, ולאטום אותם לבסיס של 60 צלחות פטרי פלסטיק מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח משחת ואקום לאורך הציר הארוך של משטח אחד מרצועות הזכוכית המלבניות, ולאטום אותם לקצוות שונים של שקופיות הזכוכית המרובעות (כזה שהם מקבילים זה לזה) על מנת ליצור שוקת מרכזית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV-לעקר את התאים לפחות 15 דקות במכסת מנוע הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250-300 μl פיפטה של ​​פולי-L-lysiנה אל השוקת המרכזית של התאים ולדגור על טמפרטורת חדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 15 דקות לפני תום תקופת הדגירה, להכין פתרון Matrigel (ראה מתכון בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פולי-L-ליזין, לשטוף את השקתות המרכזיות עם 1 מיליליטר מי autoclaved, ו250-300 μl פיפטה של ​​פתרון Matrigel אל השקתות המרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון Matrigel ולשטוף בעדינות את השקתות המרכזיות עם 1-2 מ&quot;ל של SFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl פיפטה של ​​EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות ולהעביר את תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיליליטר פיפטה 3-4 מתרבות neurosphere המכילה לתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ ולהעביר את צלחת פטרי לבמה של המיקרוסקופ הספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במטרת צפייה של 5x, השתמש P10 פיפטה להעביר 5-8 neurospheres השלם (עד 4 בכל פעם) אל השוקת המרכזית של כל אחד galvanotaxisתא ללא dissociating, ולהפיץ את neurospheres סביב השוקת המרכזית בזהירות מבלי לשבש את מצע Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150-200 μl נוסף של EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי galvanotaxis ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 100% חממת humidified ל17-20 שעות (אם הניתוח עבר התמיינות NPCs) כדי לאפשר neurospheres לדבוק במצע Matrigel ולנתק לתאים בודדים, כפי שמוצג באיור 1 . אם ניתוח NPCs בדיל, תקופת הדגירה צריכה להיות מורחבת ל69-72 שעות כדי לאפשר ההתמיינות של התאים. </li></ol> 3. חי הדמית תא זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר למערכת הדמית התא החייה לאזן על 37 מעלות צלזיוס, CO 2 למינימום של 30 דקות לפני התחלת הקלטת זמן לשגות% 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך שתי חתיכות 12 סנטימטר של 1 מ&quot;מ קוטר חוט כסף, סלילם מקצה אחד, ולמקם אותם באקונומיקה ביץ ל20 דקות כדי ליצור אלקטרודות Ag / AgCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה ובחר שחדר ישמש לניתוח הגירת הדמיה חי תאים בהתבסס על הקריטריונים הבאים: א) את neurospheres צריכה להיות כמעט ניתק לחלוטין לתאים בודדים וii) התאים אמורים להחזיק מורפולוגיות עגולות עם מעט-to-אין תהליכים המשתרעות מגופי התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה הקאמרית galvanotaxis נבחר לתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, יחד עם כיכר לא נפרד. תלוש 1 מכסה זכוכית וגריז ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכיסוי להחליק ראשון עם אתנול 70%, ולאחר מכן במי autoclaved, ולהחיל רצועת גריז ואקום בשני קצוות מקבילים של תלוש הכיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את תקשורת התרבות מהשוקת המרכזית של החדר, ואז למקם את תגית הכיסוי (גריז בצד פונה כלפי מטה) במהירות על התא כזה ששאר רצועות השומן על שתי רצועות זכוכית המלבניות המקבילות, ביעילות יצירת גגלתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl פיפטה של ​​טרי EFH-SFM או FBS-SFM לתוך השוקת המרכזית באמצעות פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגריז ואקום כדי ליצור גבולות לברכות של מדיה תרבות בכל קצה של השוקת המרכזית, כפי שמוצג באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך שתי חתיכות 15 סנטימטרים של צינורות PVC, ולהשתמש במזרק סמ&quot;ק 10 עם מחט מד 18 להזריק בזהירות פתרון agarose לתוך הצינור, הבטחה ללא בועות נוצרות בצינורות, ולאפשר לג&#39;ל לביסוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה הקאמרית galvanotaxis למערכת הדמית התא החייה, יחד עם agarose ג&#39;ל צינורות, Ag / AgCl אלקטרודות, וזוג 60 מנות מ&quot;מ פטרי ריקות שתשמשנה כתרבות תקשורת והמאגרים יכילו Ag / AgCl אלקטרודות. אפשר הקאמרי galvanotaxis לנוח בתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 סביבה ל20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את המכסים של 2 צלחות פטרי הריקות והמכסה של צלחת פטרי של galvanotaxis הקאמרי על ידי קידוח חורהאליהם עם כלי Dremel או דומה כפי שמוצג באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1-1.5 מ&quot;ל של EFH-SFM או FBS-SFM על שני צדי התעלה המרכזית, ו7-8 מ&quot;ל של SFM לכל צלחת פטרי ריקה. מקום פטרי צלחת אחת בכל צד של שוקת של הקאמריים galvanotaxis המרכזית ומקום אלקטרודה אחת Ag / AgCl לכל מנה. לגשר על הפער בין הקאמרי galvanotaxis וצלחות פטרי להקים המשכיות חשמלית עם גשרי agarose ג&#39;ל, כפי שמוצג באיור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבור את האלקטרודות Ag / AgCl לאספקת כוח חיצונית, עם מד זרם בסדרה למדידת זרם חשמלי, ולהפעיל את אספקת החשמל. השתמש ולטמטר למדוד את עוצמתו של השדה החשמלי ישירות מול השוקת המרכזית, ולהתאים את הפלט של אספקת החשמל עד לעוצמת השדה החשמלית הרצויה מושגת (המבחנים שבוצעו במעבדה זו לנצל את כוח dcEF של 250 mV / מ&quot;מ עם זרם חשמלי בין 1 ל 1.5 mA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Initiaטה מודול זמן לשגות במערכת הדמית התא החייה, ולאפשר את הניסוי לרוץ לסכום הרצוי של זמן. לאחר השלים הבדיקה, לתקן את התאים בparaformaldehyde 4% לניתוח immunostaining סטנדרטי. </li></ol>

<ol><li>Borgens, R. B., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+histogenesis+from+morphogenesis+in+the+vertebrate+embryo+by+collapse+of+the+transneural+tube+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential.</a> Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).</li>
<li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cues+regulate+the+orientation+and+frequency+of+cell+division+and+the+rate+of+wound+healing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).</li>
<li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+regeneration+and+wound+healing+are+stimulated+and+directed+by+an+endogenous+electrical+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo.</a> Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li>
<li>Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mammalian+forebrain+ependymal+and+subependymal+cells+demonstrate+proliferative+potential%2C+but+only+subependymal+cells+have+neural+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).</li>
<li>Erickson, C. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+fibroblast+motility+and+orientation+can+be+influenced+by+physiological+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields.</a> J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).</li>
<li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+and+directed+migration+of+cultured+corneal+epithelial+cells+in+small+electric+fields+are+serum+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent.</a> J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).</li>
<li>Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-Current+Electrical+Field+Guides+Neuronal+Stem%2FProgenitor+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).</li>
<li>Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li>
<li>Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li>
<li>SATO, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-output+relationship+in+galvanotactic+response+of+Dictyostelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells.</a> Biosystems. 88, 261-272 (2007).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).</li>
<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li>
<li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li>
<li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Cell+Behavior+Electrically%3A+Current+Views+and+Future+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Subependymal+Neural+Precursors%2C+but+Not+Differentiated+Cells%2C+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808(2011).</li>
<li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li>
<li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה הותאם מהשיטות המבוססות היטב של מחקרים קודמים 7-9. תאי Galvanotactic ניתן לבנות תוך שימוש במגוון טכניקות שונות, כולל הבנייה של זכוכית נפרדת גם לכליאה של זריעת תא, או באמצעות אבלציה הליזר CO 2 לmicrofabrication של השוקת המרכזית 10,11. טכניקות מסוימות עשויות להיות מייגעות יותר או יקרות יותר מאחרים. כבר תארנו assay פשוט וחסכוני לבניית חדר NPC galvanotaxis שימוש בחומרים נפוצים ברוב מעבדות ביולוגיה של תא. הפרוטוקול שלנו כולל מחוממת, humidifie...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td height="44"> שמו של פריט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> בידוד תא מבשר עצבי </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S5886 </td><td> 11.688 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 7.456 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> M2393 </td><td> 20.33 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 155 המ&quot;מ 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td><td> 1.302 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> גלוקוז 0.5m </td><td> סיגמא </td><td> G6152 </td><td> 9.01 גר &#39;מומס ב100המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 108 המ&quot;מ CaCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> C7902 </td><td> 1.59 גר &#39;מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין לבלב שור </td><td> סיגמא </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> כבשי אשכי hyaluronidase </td><td> סיגמא </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת Kynurenic </td><td> סיגמא </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> מעכב טריפסין Ovomucoid </td><td> וורטינגטון </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> סיגמא </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> סיגמא </td><td> H3375 </td><td> 23.83 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> לשקם ב1 מ&quot;ל של תערובת הורמון וaliquot לתוך 20 יחידות μl. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> לשקם ב0.5 מ&quot;ל של תערובת הורמון וaliquot לתוך 20 יחידות μl. </td></tr><tr><td> הפארין </td><td> סיגמא </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-transferrin </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> 3188-AT </td><td> 0.1 גרם מומס ל 4 המ&quot;ל DH 2 0 </td></tr><tr><td> פוטרסין </td><td> סיגמא </td><td> P7505 </td><td> ממס 9.61 מ&quot;ג לApo-transferrin כךlution </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> סיגמא </td><td> I5500 </td><td> להמס 25 מ&quot;ג למ&quot;ל של 0.5 0.1N HCl ולהוסיף עד 3.5 מ&quot;ל של DH 2 0 </td></tr><tr><td> סלניום </td><td> סיגמא </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> פרוגסטרון </td><td> סיגמא </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> כלי נתיחה סטנדרטי </td><td> כלי מדע פיין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ נתיחה </td><td> Zeiss </td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> הכנת Galvanotaxis הקאמרית </td></tr><tr><td> מגלשות כיסוי זכוכית מרובעות </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> 6N חומצה הידרוכלורית </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> גריז ואקום גבוה </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 מנות מ&quot;מ פטרי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> הפשר וaliquot לתוך 150 יחידות μl </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> השתמש אך ורק אם תשכנע את בידול NPC, אחרת להשתמש SFM + תקשורת תרבות EFH כפי שצוינה לעיל </td></tr><tr><td> ספירת מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חי הדמית תא זמן לשגות </td></tr><tr><td> חוט כסף </td><td> אלפא Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> החום InactivFBS ated </td><td> סיגמא </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות PVC </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;מזהה x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> מלבין </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 סמ&quot;ק מזרק </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> מחט מד 18 </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> תרגיל Dremel </td><td> Dremel </td><td> דגם 750 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ ההפוך מצויד בתא humidified, דגר </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200 מ&#39; </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מתכונים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> 6.2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td>1M KCl </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0.32 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> קוטר 155 מ&quot;מ 3 NaHCO </td><td> 16.9 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 1M </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 108 המ&quot;מ CaCl 2 </td><td> 0.09256 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 74 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> נוזל השדרתי מלאכותי <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> נוזל השדרתי מלאכותי </td><td> 30 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריפסין לבלב שור </td><td> 40 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> כבשי אשכי hyaluronidase </td><td> 22.8 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> חומצת Kynurenic </td><td> 5 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> &lt;פתרון חזק&gt; טריפסין <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מעכב טריפסין Ovomucoid </td><td> 10 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> פתרון אינהיביטור טריפסין <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 37 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Transferrin, פתרון פוטרסין </td><td> 4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון אינסולין 25 מ&quot;ג </td><td> 4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סלניום </td><td> 100 &amp; mu, אני </td></tr><tr><td> פרוגסטרון </td><td> 100 μl </td></tr></tbody></table> מיקס הורמון (100 המ&quot;ל מוחלט, חנות ב -20 ° C) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 37.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X (3:1) </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> 0.75 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0.25 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תמהיל הורמון </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> הסרום חינם מדיה EFH-SFM: להוסיף 10 μl של EGF, 10 μl של FGF, ו3.66 μl של הפארין FBS-SFM: להוסיף 0.5 המ&quot;ל FBS <taגבול ble = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3.6 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> aliquot Matrigel Matrigel פתרון צריך להיות ממוקם בקופסא הקרח ואפשר להפשיר לאט במשך 4-5 שעות כדי ליצור נוזל צמיג לפני הערבוב עם SFM. זה יבטיח את היווצרות שכבה חלקה של מצע Matrigel. אם לא הופשר לאט, המצע וכתוצאה יכיל גושי Matrigel, אולי מעכב את נדידת תאים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> 300 מ&quot;ג ב10 המ&quot;ל DDH 2 0 </td></tr><tr><td> SFM FBS המומת חום </td><td> 8 מ&quot;ל 2 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> Matrigelפתרון מערבב 8 מ&quot;ל של SFM עם FBS המומת חום המ&quot;ל 2 בצינור 15 סמ&quot;ק בז. המיקס agarose עם 10 המ&quot;ל DDH 2 0 בבקבוק Erlenmeyer, וחום במיקרוגל למשך 30 שניות במרווחים 10-sec, הבטחה להסרת פתרון מהמיקרוגל אחרי כל מרווח 10-שניות וביסודיות לערבב. בעקבות התקופה האחרונה, 10-שניות במיקרוגל, לערבב עם פתרון agarose / פתרון SFM FBS וחנות ב° C 57 אמבט מים. </td></tr></tbody></table>

assay galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

הגילוי של גזע עצבי ותאי אב (תאים מבשרים עצביים המכונים באופן קולקטיבי) (NPCs) במוח של יונקי הבוגרים הוביל לגופו של מחקר שהמטרה תוך ניצול תכונות multipotent ושגשוג של תאים אלו לפיתוח אסטרטגיות neuroregenerative. צעד קריטי להצלחה של אסטרטגיות כאלו היא התגייסות NPCs לכיוון אתר נגע לאחר השתלת אקסוגני או כדי לשפר את התגובה של מבשרי אנדוגני הנמצאים באזור periventricular של מערכת העצבים המרכזיים. בהתאם לכך, הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים שמקדמים, להדריך, ולשפר את הגירת NPC. העבודה שלנו מתמקדת בניצול של שדות חשמליים של זרם ישירים (dcEFs) לקידום והגירת NPC ישירה - תופעה הידועה בgalvanotaxis. שדות חשמליים פיסיולוגיים אנדוגניים לתפקד כרמזים קריטיים לנדידת תאים במהלך התפתחות תקינה ותיקון פצע. שיבוש תרופתיפוטנציאל צינור טרנס עצבי בעוברי האמביסטומה גורם מומים התפתחותיים חמורים 1. בהקשר של ריפוי פצע, קצב התיקון של קרנית פגועה מתואם ישירות עם סדר הגודל של פוטנציאל פצע אפיתל שמתעורר לאחר פציעה, כפי שמוצג על ידי שיפור או שיבוש תרופתי של 2-3 dcEF זה. אנחנו הוכחנו כי NPCs subependymal המבוגר לעבור הגירת cathodal מהירה וביים במבחנה, כאשר נחשף לdcEF לשימוש חיצוני. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקות של המעבדה שלנו ליצירת assay galvanotaxis פשוט ויעיל לרזולוציה גבוהה, תצפית ארוכת הטווח של טרנסלוקציה ביימה תא בגוף (נדידה) ברמת תא בודד. assay זה יהיה מתאים לחוקר את המנגנונים המווסתים את תמרת dcEF לתנועתיות סלולרית באמצעות השימוש בעכברים מהונדסים או נוקאאוט, RNA התערבות הקצר, או אגוניסטים הקולטן ספציפיים / יריבים.

ניתוח kinematic מגלה כי בנוכחות dcEF 250 mV / מ&quot;מ, NPCs עבר התמיינות תערוכת galvanotaxis ביים והמהיר ביותר לכיוון הקתודה (האיור 5A, סרט 1). בהעדר dcEF, תנועה אקראית של התאים הוא ציין (5B איור, סרט 2). בשדה הכח הזה,&gt; 98% מNPCs עבר התמיינות להגר ל6-8 השעות כל שהם צלמו, ומאחר שתאים מתים לא נודדים זה מצביע על כך שהם נשארים קיימא בתקופה זו בהעדר או הנוכחות של dcEF. פנוטיפים בד...

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להמחיש את נדירתן של תאי אב עצביים מהמבוגר בנוכחות שדה חשמלי עם זרם ישר. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד וגידול של תאי אב עצביים סוב-אפנדימליים מעכבר בוגר. השלב הבא הוא הכנת תאי Galvan Axxis והעברת תאי האב העצביים אל התאים.השלב הסופי הוא הפעלת שדה חשמלי של זרם ישר על פני תא ה-Galvan Axxis וביצוע דימוי time-lapse כדי לצפות בנדידת התאי הקדמיים העצביים (neuro precursors). בסופו של דבר, מיקרוסקופיית ה-time-lapse לוכדת את תכונות הגלוואנטקסיס (Galvan tactic) של התאים הקדמיים העצביים במצבם המובהן והבלתי-מובהן. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גלוואנוטאקסיס של תאים קדמיים עצביים, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כגון מודל שבץ בעכברים לגיוס תאים קדמיים עצביים לאתרי נגעים כדי לשפר את השיקום העצבי.את הפרוצדורה יעמיד על כבודו Rob Pilley Post, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. עם תחילת הפרוצדורה, ה-NPCs חייבים להיות בתרבית במשך שבעה ימים, כך שכדוריות עצביות ראשוניות (primary neurospheres) צפות יהיו מוכנות לאספקה. בעת הצורך, התחילו בהכנת שלוש תאי Galvan Axxis על ידי הנחת שלוש זجاجות ריבועיות.ראשית, השקיעו זלגיות (cover slips) בבקבוק המכיל 6N hydrochloric acid למשך לילה. בשעות הבוקר המוקדמות למחרת, הניחו את ה-matra gel להפשרה איטית על קרח. לאחר ארבע שעות, הוא יהיה מוכן לשימוש לבניית התא.ראשית, השתמשו בחותך זכוכית בעל קצה יהלום כדי לחתוך שש רצועות זכוכית מלבניות מריבוע חדש. מספר אחת, כיסויי זכוכית (coverslips). העבירו את כיסויי הזכוכית הריבועיים והרצועות המלבניות, ששטופים בחומצה, אל מ 빠르게 זרימה למינרית (laminar flow hood).שטוף את רצועות הזכוכית ב-70% ethanol ולאחר מכן במים שעברו אוטוקלאב בדרגת תרבית רקמות. הנח להן להתייבש באוויר או ייבש אותן על נייר נקי מסדקים (lint-free).צלחות פטרי. מרחו גריז ואקום על צד אחד של רצועות הזכוכית המלבניות והדביקו אותן לקצוות הנגדיים של הריבוע. השתמשו בעגילות זכוכית כדי ליצור ריבועים עם תעלה מרכזית במרכז כל צלחת.בצעו סטריליזציה ב-UV לריבועי הזכוכית או לתאות המודעות הללו למשך 15 דקות לפחות תחת מנשף. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 250 עד 300 µL של polyol lysine אל תוך השקע המרכזי של התאות. לאחר מכן, הדגירו את התאות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, בערך 15 דקות לפני סיום ההדגרה.הכינו את תמיסת ה-matrigel לאחר שעתיים, שאבו את ה-poly-L-lysine ושטפו את התעלות המרכזיות עם 1 mL של מים שעברו אוטוקלאב. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפטה 250 עד 300 µL של תמיסת matrigel אל התעלות המרכזיות והדגרימו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה. לאחר ההדגרה, שאבו את תמיסת ה-matrigel.לאחר מכן, שטפו בעדינות את התעלות המרכזיות עם 1-2 milliliters של SFM. כעת, העבירו בפיפטה 100 microliters של E-F-H-S-F-M או F-B-S-S-F-M אל התעלות המרכזיות כהכנה לתאי התרבית. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 4-5 milliliters של תרבית המכילה neurospheres אל צלוחית פטרי חדשה בקוטר 60 millimeter.לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על הבמה של מיקרוסקופ הספירה תחת עדשת התצפית של 5x. השתמשו בפיפט P10 כדי להעביר בעדינות חמישה עד שמונה נוירוספרות שלמות אל התעלה המרכזית של כל תא. עד ארבעה.ניתן להעביר את הנוירוספירות בבת אחת, אך אין להפריד אותן מהנוירוספירות הנמצאות בתעלות המרכזיות. פזרו אותן בזהירות מסביב מבלי להפר את תשת המטריגל. לאחר מכן, הוסיפו 150 µL נוספים של E-F-H-S-F-M או F-B-S-S-F-M אל התעלות המרכזיות.כעת יש לגדל את התאים באינקובטור עם לחות. לאחר 17 עד 20 שעות של תרבית, NPC שאינם מובחנים יהיו זמינים לאחר 69 עד 72 שעות. בתרבית, NPC מובחנים יהיו זמינים.תחת מיקרוסקופ ספירה, בחרו את התא עם התאים הטובים ביותר לניתוח נדידה של דימוי תאים חיים. התאים צריכים להיות עגולים, כמעט מנותקים לחלוטין מהנוירוספירות שלהם, וכאלה שטרם החלו, או רק החלו, להוציא שלוחות תחת מנדף. הכינו כיסוי לתא.שטפו לבישת זכוכית ריבועית ב-70% ethanol, ולאחר מכן במים שעברו אוטוקלאב, ומריחו פס של גריז ואקום על שני קצוות מקבילים. כעת כסו את התא. ראשית, שאבו את מדיום התרבית מהתעלה המרכזית, ולאחר מכן סגרו במהירות את הלבישה על הדפנות המלבניות כגג.בשלב הבא, באמצעות פעולת נימיות, טענו 100 µL של מצע טרי אל תוך התעלה המרכזית. כעת השתמשו בגריז ואקום כדי ליצור גבולות לבריכות של מצע תרבית. בכל קצה של התעלה המרכזית במערכת הדימוי של תאים חיים, הכינו מראש מבחנות ג'ל agarose, אלקטרודות כסף/כסוף כלוריד ושתי צלחות פטרי בקוטר 60 מילימטר לשימוש.כדי שישמשו כמאגרי מצע גידול, השאירו את התאים לנוח בסביבה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 20 עד 30 דקות. במהלך זמן זה, הכינו את המכסים של שתי צלחות הפטרי הריקות ואת המכסה של צלחת הפטרי של תאי ה-Galvan Axxis על ידי קידוח חורים בהם באמצעות Dremel או כלי פיפט, שפכו 1.5 עד 2 mL של מצע לכל צד של התעלה המרכזית והוסיפו 7 עד 8 mL של SFM לכל צלחת פטרי ריקה. הניחו צלחת פטרי אחת בכל צד של התעלה המרכזית של התא והניחו אלקטרודה אחת בכל צלחת.גשרו על הרווח שבין התא לבין פטריות הפטרי כדי ליצור רצף חשמלי. באמצעות גשרי ג'ל של Agros, חברו את האלקטרודות לספק כוח חיצוני עם מד M בטור למדידת זרם חשמלי, והפעילו את ספק הכוח. השתמשו במד מתח כדי למדוד את עוצמת השדה החשמלי ישירות לרוחב התעלה המרכזית.כוון את פלט ספק הכוח לפי הצורך. כעת הפעל את מודול ה-time-lapse במערכת ההדמיה. בתוכנת Axio vision בחר ב-multidimensional acquisition ולחץ על see.עבור הערוצים, בחרו בערוץ שש, ולחצו על T עבור צילום במרווחי זמן (time lapse). הגדירו את הגדרות מרווח הזמן לדקה אחת, ואת משך הזמן לשמונה שעות בשדות ההגדרות לפני ואחרי נקודת הזמן; בחרו את נקודות הזמן שלפני ואחרי. כעת לחצו על start והמתינו עד להשלמת הניסוי למשך הזמן הרצוי. לאחר סיום הבדיקה, המשיכו לניתוח IHC.ניתוח קינמטי העלה כי בנוכחות DCEF בעוצמה של 250 millivolt per millimeter, NPCs לא מובחנים מראים ציר גלווני מכוון ומהיר מאוד לעבר הקתודה; בעוצמת שדה זו, יותר מ-98% מה-NPCs הלא מובחנים נדדו לאורך כל שש עד שמונה השעות שבהן הם דוגמו. בהיעדרו של A-D-C-E-F, נצפתה תנועה אקראית של התאים.מאחר שתאים מתים אינם נודדים, הדבר מרמז כי הם נותרים חיוניים במהלך תקופה זו. בהיעדר או בנוכחות של A-D-C-E-F, פנוטיפים מובחנים הראו נדידה זניחה, הן בנוכחות והן בהיעדר תתי-אוכלוסיות של תאים מובחנים מסוג A-D-C-E-F. נצפו תהליכים מוארכים שנטו להיסדר בניצב לכיוון ה-DCEF, אך לא נצפתה העתקה מורגשת של גוף התא.צביעה אימונולוגית איששה כי תאי NPCs שמרו על ביטוי חיובי של הסמן לתאי קדם עצביים nestin לאחר שש שעות של חשיפה ל-DC EF. בבדיקות שבהן הונחו NPCs להבדיל לפנוטיפים בוגרים, רוב התאים מבטאים את הסמן לאסטרוציטים בוגרים glial fibrillary acidic protein או GFAP לאחר שש שעות של חשיפה ל-DCEF. בעקבות הליך זה, ניתן להפיק תובנות לגבי המנגנונים התאיים המעורבים בהמרה של השדה החשמלי במזרם ישר לתנועתיות תאית באמצעות מודלים של נוק-אאוט גנטי.או אדון, לדוגמה.

a-galvanotaxis-assay-for-analysis-neural-precursor-cell-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

פרוטוקול זה מדגים שיטות להקים סביבות 2 ד ו 3D ב אישית מעוצבת חדרי electrotactic, אשר יכולים לעקוב אחר...

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

חוקרים יכולים להפעיל תנועה לפי דרישה ב-C. elegans על ידי הפעלת שדה חשמלי שתולעים חשות בו ומגיבות אליו. סרטון זה מציג התנהגות אלקטרוטקטית ומציג פרוטוקול דגימה שנעשה במכשיר מיקרופלואידי.

בדיקת Electrotaxis: שיטה לצפייה בתנועה ב- C. elegans

שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה...

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

אנו מציגים שיטה ליישום שדה חשמלי פיזיולוגי על תאי ערמונית נודדים ואימורטליים בתא גלוונוטקסיס מותאם אישית. באמצעות שיטה זו, אנו מדגימים כי 2 קווים של תאי ערמונית לא גידוליים מדגימים דרגות שונות של כיווניות נדידה בשדה.

ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

מכשירים מיקרופלואידיים רבים פותחו לשימוש בחקר אלקטרוטקסיס. עם זאת, אף אחד מהשבבים הללו אינו מאפשר מחקר יעיל של השפעות השדה הכימי והחשמלי בו-זמנית (EF) על התאים. פיתחנו מכשיר מבוסס פולימתיל-מתאקרילט המציע EF דו-קיום מבוקר טוב יותר וגירוי כימי לשימוש במחקר אלקטרוטקסיס.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבידול של גזע עצבי ותאי אב (NPCs) המושרה אך ורק על ידי גירוי דופק זרם ישיר (DC) במערכת מיקרופלואידית.

בידול תאי קודמן עצבי הנגרמת על ידי שדה חשמלי בהתקנים מיקרופלואידיים

למד את שיטת גלוונוטקסיס לניתוח נדידת תאי מקדם עצבי מוח מבוגרים בשדה חשמלי ישר. השיטה משלבת הכנת תאים מעכברים בוגרים, צילום טיים-לאפס וניתוח קינמטי להבנת התנהגות התאים ויישומיה בריפוי עצבי.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

גלה סרטונים נוספים