Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את הנדידה של תאי מבשר עצביים שמקורם במבוגרים בנוכחות שדה חשמלי של זרם ישר. זה מושג על ידי בידוד וטיפוח תאי מבשר עצביים תת-אפנדימליים מהעכבר הבוגר. השלב הבא הוא הכנת תאי Galvan Axxis והעברת תאי המבשר העצביים לתאים.

השלב האחרון הוא להפעיל שדה חשמלי זרם ישר על פני תא Galvan Axxis ולבצע הדמיית זמן-lapse כדי לצפות בנדידת מבשרי העצב. בסופו של דבר, מיקרוסקופ ההדמיה של זמן-lapse לוכד את תכונות טקטיקת ה-Galvan של מבשרי עצב במצבם המובחן והלא מובחן. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נווה מדבר של תאי מבשר עצבי, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון מודל שבץ עכבר לגיוס מבשרי עצב לאתרי נגע כדי לשפר את התיקון הנוירולוגי.

מי שידגים את ההליך יהיה רוב פילי פוסט, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כאשר מתחילים בהליך זה, NPCs חייבים להיות בתרבית במשך שבעה ימים, כך שנוירוספרות ראשוניות צפות חופשיות מוכנות לקציר. במידת הצורך, התחל להכין שלושה תאי Galvan Axxis על ידי הנחת שלוש זכוכית מרובעת.

ראשית, הכיסוי מחליק בבקבוק של שש חומצות הידרוכלוריות. מוקדם למחרת, הגדר את ג'ל המאטרה כדי להפשיר לאט על קרח. לאחר ארבע שעות הוא יהיה מוכן לשימוש לבניית החדר.

ראשית, השתמש בחותך זכוכית עם קצה יהלום כדי לחתוך שש רצועות זכוכית מלבניות מריבוע חדש. מספר אחד, תלושי כריכה. העבירו את החלקות המרובעות שטופות החומצה וההחלקות המלבניות למכסה המנוע הלמינר.

שטפו את רצועות הזכוכית עם 70% אתנול ואחריו מי חיטוי בדרגת תרבית רקמות. הניחו להם לייבש באוויר או לייבש אותם על נייר נטול מוך. לאחר מכן, מרחו גריז ואקום על היקף משטח אחד של כל מגלשת זכוכית מרובעת ואטמו אותם לבסיס פלסטיק של 60 מילימטר.

צלחות פטרי. מרחו שומן ואקום על צד אחד של רצועות הזכוכית המלבניות ואטמו אותן לקצוות מנוגדים של הריבוע. זכוכית מגלשת ליצירת ריבועים עם שוקת מרכזית במרכז כל מנה.

UV מעקר את ריבועי הזכוכית או תאי הזכוכית הללו למשך 15 דקות לפחות במכסה המנוע. לאחר מכן פיפטה 250 עד 300 מיקרוליטר פוליאול ליזין על השוקת המרכזית של התאים. לאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, כרבע שעה לפני סיום הדגירה.

הכינו את תמיסת הג'ל המטרי לאחר שעתיים, שאפו את הפוליאול ליזין ושטפו את השקתות המרכזיות במיליליטר אחד של מי חיטוי. לאחר מכן פיפטה 250 עד 300 מיקרוליטר של תמיסת ג'ל מאטרי על השקתות המרכזיות ודגירה על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה יש לשאוב את תמיסת המטריג'ל.

לאחר מכן שטפו בעדינות את השקתות המרכזיות עם מיליליטר עד שניים של SFM. כעת פיפטה 100 מיקרוליטר של E-F-H-S-F-M או F-B-S-S-F-M על השקתות המרכזיות כהכנה לתאים המתורבתים. לאחר מכן, פיפטה ארבעה עד חמישה מיליליטר של כדור הנוירוס המכיל תרבית לצלחת פטרי חדשה של 60 מילימטר.

לאחר מכן הנח את צלחת הפטרי על הבמה של מיקרוסקופ הספירה תחת יעד הצפייה של חמש פעמים. השתמש בפיפטה P 10 כדי להעביר בעדינות חמש עד שמונה נוירוספרות שלמות לשוקת המרכזית של כל תא. עד ארבעה.

נוירוספרות עשויות להיות מועברות בבת אחת, אך אל תנתקו אותן עם הנוירוספרות בשקתות המרכזיות. מורחים אותם בזהירות מבלי לשבש את מצע המטריגל. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר נוספים של E-F-H-S-F-M או F-B-S-S-F-M על השקתות המרכזיות.

עכשיו תרבית, התאים באינקובטור לח. לאחר 17 עד 20 שעות בתרבית, NPCs לא מובחנים יהיו זמינים לאחר 69 עד 72 שעות. בתרבות, NPCs מובחנים יהיו זמינים.

תחת מיקרוסקופ חשבונאי, בחר את החדר עם התאים הטובים ביותר לניתוח נדידת הדמיית תאים חיים. התאים צריכים להיות עגולים מנותקים כמעט לחלוטין מהנוירוספרה שלהם ועדיין לא, או רק התחילו ליצור תהליכים במכסה המנוע. הכן כיסוי תא.

שטפו תלוש כיסוי זכוכית מרובע עם אתנול 70%, ולאחר מכן עם מים חיטוי ומרחו רצועת שומן ואקום על שני קצוות מקבילים. עכשיו כסו את החדר. ראשית, שאפו את אמצעי התרבות מהשוקת המרכזית, ואז אטמו במהירות את הכיסוי, החליקו על הקירות המלבניים כמו גג.

לאחר מכן, באמצעות פעולה נימית, טען 100 מיקרוליטר של מדיה טרייה לשוקת המרכזית. כעת השתמש בשומן ואקום כדי ליצור גבולות לבריכות של מדיה תרבותית. בכל קצה של השוקת המרכזית במערכת הדמיית התאים החיים, הכינו שפופרות ג'ל אגרוס, אלקטרודות כסף, כסף כלוריד ושתי צלחות פטרי 60 מילימטר לשימוש.

כמאגרי מדיה תרבותית, אפשר לתאים לנוח בסביבת 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני למשך 20 עד 30 דקות. במהלך תקופה זו, הכינו את המכסים של שתי צלחות הפטרי הריקות ואת המכסה של צלחת הפטרי של תאי Galvan Axxis על ידי קידוח חורים לתוכם בעזרת דרמל או פיפטת כלים, 1.5 עד שני מיליליטר מדיה משני צידי השוקת המרכזית והוסיפו שבעה עד שמונה מיליליטר SFM לכל צלחת פטרי ריקה. מניחים צלחת פטרי אחת בכל צד של השוקת המרכזית של החדר ומניחים אלקטרודה אחת בכל צלחת.

גשר על הפער בין החדר לצלחות הפטרי כדי ליצור המשכיות חשמלית. בעזרת גשרי הג'ל של Agros, חבר את האלקטרודות לאספקת חשמל חיצונית עם מד M בסדרה כדי למדוד זרם חשמלי ולהפעיל את ספק הכוח. השתמש במד נפח כדי למדוד את חוזק השדה החשמלי ישירות על פני השוקת המרכזית.

התאם את הפלט של ספק הכוח לפי הצורך. כעת הפעל את מודול ה-time-lapse במערכת ההדמיה. בתוכנת Axio vision בחר רכישה רב-ממדית ולחץ לראות.

עבור ערוצים, בחר ערוץ 6, לחץ על T עבור קיטועי זמן. הגדר את הגדרות מרווח הזמן לדקה אחת, הגדר את משך הזמן לשמונה שעות בשדות ההגדרות לפני, אחרי נקודת זמן, בחר את נקודת הזמן לפני ואחרי. כעת לחץ על התחל ואפשר לניסוי לרוץ למשך הזמן הרצוי לאחר השלמת הבדיקה, המשך הלאה עם ניתוח IHC.

ניתוח קינמטי גילה כי בנוכחות 250 מילי-וולט למילימטר DCEF NPCs לא מובחנים מציגים, ציר גלוון מכוון ומהיר מאוד לעבר הקתודה בעוצמת שדה זו, יותר מ-98% מה-NPCs הבלתי מובחנים נדדו במשך כל שש עד שמונה השעות שבהן הם צולמו. בהיעדר A-D-C-E-F. נצפתה תנועה אקראית של התאים.

מאחר שתאים מתים אינם נודדים, הדבר מצביע על כך שהם נשארים ברי קיימא במהלך תקופה זו. בהיעדר או נוכחות של A-D-C-E-F, פנוטיפים מובחנים עברו נדידה זניחה, הן בנוכחות והן בהיעדר תת-קבוצות A-D-C-E-F של תאים מובחנים. תהליכים מורחבים שנטו להתיישר בניצב לכיוון ה-DCEF, אך לא נצפתה טרנסלוקציה ניכרת של גוף התא.

צביעה חיסונית אימתה כי NPCs שמרו על ביטוי חיובי של קן הסמן העצבי לאחר שש שעות של חשיפה ל-DC EF. במבחנים הכוללים NPCs המושרים להתמיין לפנוטיפים בוגרים, רוב התאים מבטאים את סמן האסטרוציטים הבוגר חלבון חומצי סיבי גליה או GFAP לאחר שש שעות של חשיפה ל-DCEF. בעקבות הליך זה, ניתן לרכוש תובנות לגבי המנגנונים התאיים המעורבים בהתמרת השדה החשמלי של הזרם הישר לתנועתיות התא באמצעות מודלים גנטיים של נוק-אאוט.

או אדוני, למשל.