טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

מטרת הליך זה היא לטהר את התחום התוך-תאי של חלבון מבשר העמילואיד, הידוע גם בשם ICD, ולהציג פרוטוקול לצבירה תרמית ואפיון של ה-ICD A על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. זה מושג על ידי ביטוי ראשון של היתוך GST של ICD בחיידקים. לאחר מכן, החלבון G-S-T-A-I-C-D מטוהר עם תרומבין כדי להפריד את ה-GST מ-ICD וה-GST מוסר.

ואז מושרה הצבירה התרמית של ICD. לבסוף, אגרגטים A ICD מצולמים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כי ניתן לטהר את ה-ICD להומוגניות בכמות המספיקה לניתוח ביוכימי וביופיזיקלי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות, הדורשות שלבי כרומטוגרפיה מורכבים הוא זה טהור ומסיס מאוד. ניתן לבודד ICD על השולחן באמצעות ריאגנטים וציוד סטנדרטיים. ICD המיוצר על ידי פרוטוקול זה מתאים לאפיון ביוכימי וביופיזיקלי נוסף.

מי שתדגים את ההליך תהיה אמינה טי. פוסט-דוקטורנט לשעבר במעבדה שלי, ד"ר אנדרס אוברר, ידגים כיצד לבצע הדמיית מיקרוסקופ כוח אטומי של ICD כדי לבטא את התחום התוך-תאי הרקומביננטי A PP או A ICD. התחל עם תאי BL 21 שעברו טרנספורמציה עם וקטור pgx 41, המכילים את ה-ICD האנושי שהתמזג לקצה C של GST עם מושבה אחת לחסן 10 מיליליטר של מרק LB עם אמפיצילין ולדגור למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול נמרץ למחרת בבוקר.

דגרו 400 מיליליטר של אמפיצילין LB בבקבוק ליטר אחד עם חמישה מיליליטר מתרבית הלילה. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול נמרץ עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-0.4 עד 0.6. זה בדרך כלל ייקח שעתיים עד 2.5 שעות לגרום לביטוי של G-S-T-A-I-C-D.

אנו מוסיפים 0.4 מילימולר של IPTG ומדגרים 37 מעלות צלזיוס עם ניעור נמרץ במשך חמש שעות. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 6,000 פעמים G למשך 15 דקות של ארבע מעלות צלזיוס ואחסנו את הכדור במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הכנת ליזה, חיץ וזריקת חיידקים על קרח, הוסף 20 מיליליטר של חיץ לכדור והשתמש בשילוב של מערבולת וטאטציה על קרח עם פיפטה ביסודיות.

ריס משהה את הגלולה החיידקית מעבירה את הליזאט החיידקי התלוי של ריס דרך מתחלב מקורר מראש או מכבש צרפתי. ב-30,000 PSI העבירו את הליזאט דרך המתחלב בפעם השנייה ואספו את הליזאט בצינור מקורר מראש של 50 מיליליטר. צנטריפוגה הליזאט של 15, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הפרד והעביר את הסופינטה לצינור מקורר מראש של 50 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר של 50% slurry של גלוטתיון. סובב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בזמן שהדגימה מסתובבת.

הכינו מאגר פליטה טרי לאחר הדגירה. יוצקים את הליזאט והslurry לעמודת כרומטוגרפיה חד פעמית מפוליסטירן בגודל 5 אינץ' עם מסנני קורס. שוטפים את העמוד חמש פעמים עם שלושה מיליליטר PBS.

מכסה את תחתית העמוד והוסף 500 מיקרוליטר טמפרטורת החדר, מאגר פליטה. מכסים את החלק העליון של העמוד וסובבו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אוספים את המשקל המוקדם לצינור אשפה מיקרו צונן של 1.5 מיליליטר.

חזור על הפליטה פעמיים נוספות. דיאליזה של האלואט בקרום דיאליזה במשקל מולקולרי של 10,000 בארבעה ליטר PBS למשך הלילה של ארבע מעלות צלזיוס למחרת. יש לבצע דיאליזה כנגד ארבעה ליטרים נוספים של PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

הסר את החלבון מקלטת הדיאליזה ובצע בדיקת כימות חלבון כדי לקבוע את התשואה של G-S-T-A-I-C-D. טיהור טיפוסי מ-400 מיליליטר תרבית יביא לתשואות של יותר מ-20 מיליגרם חלבון מטוהר בריכוזים של 10 עד 20 מיליגרם למיליליטר. מכניסים את החלבון ל-200 מיקרוליטר, אליקוטים, ומקפיאים של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי לשחרר את ה-A ICD מהפשרת GST, 200 מיקרוליטר של G-S-T-A-I-C-D מטוהר ולהוסיף 20 מיקרו-שחרורים של יחידה אחת למיקרוליטר של תרומבין בדגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת, לנקות כל חומר מצטבר על ידי צנטריפוגה ב-20,000 פעמים G למשך 30 דקות של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את ה-SUPINATE לתוך צינור מיקרו מקורר מראש כדי להסיר GST וטרומבין. הוסף 50 מיקרוליטר של 50% גלוטתיון ו-50 מיקרוליטר, 50% p ו-wino zaine slurry בהתאמה.

דגירה עם סיבוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה לזמן קצר כדי לשקוע את חרוזי האגרו ולהסיר את הסופינט לתוך צינור טרי. יש לחלץ את ה-GST ארבע פעמים נוספות עם גלוטתיון.

Aros מבצעים בדיקת כימות חלבון על חמישה מיקרוליטרים של ה-ICD המטוהר. תפוקות אופייניות מתרבית של 400 מיליליטר הן 50 עד 100 מיקרוגרם בריכוז של 0.2 עד 0.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר דילול ה-ICD הטרי ב-PBS לריכוז של 0.1 מיליגרם למיליליטר גרם לצבירה תרמית על ידי דגירה של הדגימות ב-43 מעלות צלזיוס ב-800 סל"ד בשייקר מחומם למשך 48 שעות.

יש לדלל את הדגימה פי 20 במים נטולי יונים ולאתר שני מיקרוליטרים על גבי שסעים טריים. נציץ ייבש את הדגימה בייבוש למשך הלילה כדי לדמיין את ה-ICD המצטבר משתמש במיקרוסקופ כוח אטומי במצב הקשה עם זהב. שלוחות מיקרו חדות ניטריד ברדיוס קצה נומינלי של שני ננומטרים.

אמפליטודות הקשה אופייניות במהלך ההדמיה, 10 עד 20 ננומטר בתדר התהודה של השלוחות. הביטוי וההעשרה היחסית של G-S-T-A-I-C-D מוצגים כאן. לאחר ליזה, רוב חלבון ההיתוך קיים בחלק המסיס, ולכן אין צורך במיצוי מגופי הכללה.

החומר הנרמז מעמודת הגלוטתיון הוא יותר מ-95% טהור. בתכשיר המוצג כאן, ריכוז החלבון הנרמז מהעמודה היה 14.5 מיליגרם למיליליטר, והתשואה הייתה 22 מיליגרם. מחשוף של 200 מיקרוליטר של תכשיר זה בן לילה עם 20 יחידות תרומבין הביא לכמעט 100% פיצול של חלבון ההיתוך.

כמות התרומבין בשימוש נמוכה מספיק כדי שלא ניתן יהיה לזהות אותה על ידי קומאסי. כתמים כחולים, הסרת התרומבין ו-GST גרמו לאובדן מסוים של חומר. עם זאת, הוא היה גדול מ-90% טהור עם תשואה בהכנה זו של 70 מיקרוגרם של ICD בריכוז של 0.35 מיליגרם למיליליטר.

אגרגטים של ICD, המצולמים על ידי FM הם בדרך כלל אמורפיים סטרואידים וגודלם נע בין 50 ל-100 ננומטר. חומר מצטבר אינו ניתן לזיהוי כאשר מתווספת כמות שווה ערך של המלווה UBI Quillin לתגובת הצבירה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר את EICD לגרום לצבירה ולמפרץ צבירת התמונות A-F-M-E-I-C-D.

ניתן ליישם טיהור בטכניקה זו בשיטות אחרות כגון פיזור אור ומבחני מלכודת סינון כדי לענות על שאלות הנוגעות להשפעה של מלווים מולקולריים על צבירת EACD.