Name: טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: למדו שיטה לטיהור AICD ולצבירתו תרמית באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. הפרוטוקול מאפשר ניתוח ביוכימי של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי במחקר מחלת אלצהיימר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר הואי ג&#39;נג (יילור לרפואה) לAPP cDNA. עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (עף), קרן ג&#39;ון סילי הזכרון הקרן למחקר ביו (עף), וז&#39;אן וג ויליאם ד ויליס Neuroscience Research קרן (ESS). JMB הוא חוקר בתכנית למלגת מחקר Translational וחבר באוניברסיטת טקסס רפואית סניף קלוד E. פלפל ישן יותר עצמאות מרכז האמריקנים (נתמך על ידי מענקי NIH UL1RR029876 וP30-AG-024832, בהתאמה).

<html> 1. ביטוי של רקומביננטי דומיין התאי APP (AICD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform E. coli להתאמץ BL21 עם AICD אדם (שאריות 649-695 של APP, עצבי איזופורם מספור) משובט לתוך וקטור pGEX-4T-1 (GE Healthcare). הווקטור הזה יבטא AICD כמחצית C-המסוף של חלבון היתוך של-transferase גלוטתיון S (GST). וקטור זה גם מקודד רצף מחשוף תרומבין כדי להקל על הסרת מחצית GST. פרטים של שיבוט AICD לpGEX-4T-1 ניתן למצוא בפרסום הקודם שלנו 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממושבה אחת, לחסן 10 מ&quot;ל של מרק LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ו דגירת הלילה בשעת 37 ° C עם רעד בגוף נמרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לחסן LB 400 מ&quot;ל / אמפיצילין בבקבוק 1 ליטר עם 5 מ&quot;ל של תרבות הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C עם הרעד הנמרץ עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הגיע 0.4-0.6. זה יהיה בדרך כלל לוקח 2-2.5 שעות. </li></ol>&gt; תוכן &quot;בשלב זה עשוי להיות רצוי להוציא מדגם קטן (~ 10 μl) לעקוב טיהור על ידי SDS-PAGE (ראה איור 1 א &#39;, ב&#39;). כל שלב טיהור הבאה צריך גם להסיר aliquot קטן לניתוח על ידי SDS-PAGE. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לביטוי GST-AICD ידי הוספת 0.4 מ&quot;מ של איזופרופיל-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). לדגור על 37 ° C עם הרעד נמרץ במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאי XG ב 6000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. תא הגלולה יכולה להיות מאוחסנת ב-80 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים, בשלב זה של ההליך. </li></ol> 2. טיהור של GST-AICD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ תמוגה מ&quot;ל 50 כדלקמן: 1 המ&quot;מ dithiothreitol, 1mm ethylenediaminetetraacetic החומצה (EDTA), 0.1% Triton-x100, פלואוריד 1 מ&quot;מ phenylmethylsulfonyl (PMSF), קוקטייל מעכב פרוטאז שלם (רוש מדע יישומים), ונאגר מלוח פוספט. צ&#39;יל על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר גלולת חיידקים (אם הוקפא בעבר) עלקרח. </li></ol> בשלב זה, זה קריטי, כי כל הצעדים נעשים ב 4 ° C כדי להגביל proteolysis. כל הצינורות, חוצצים, ומגיב אחרים צריכים להיות מראש מצוננים. אם באמצעות עיתונות או מתחלב לתמוגה צרפתית, אלה צריכים להיות מראש מצוננים גם. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יסודיות resuspend גלולת חיידקים ב20 מ&quot;ל של חיץ תמוגה. שילוב של vortexing וטחינה דקה עם פיפטה 10 מ&quot;ל על קרח יבטיח resuspension המלא של הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים חיידקיים באמצעות resuspended מתחלב (לדוגמה, Avestin EmulsiFlex-C3) או תא לחץ צרפתי, מראש מצוננים ל4 מעלות צלזיוס ב30,000 psi. תעבור דרך lysate מתחלב בפעם שנייה. איסוף lysate לתוך צינור מראש מקורר 50 מ&quot;ל. </li></ol> היתרון העיקרי של שני המכשירים האלה הוא שהם למזער חימום של המדגם. הטכניקה הנפוצה של sonication מפיק חום משמעותי בקצה של החללית וsonicationיכול לגרום לצבירה של חלבונים רקומביננטיים. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב15000 XG למשך 30 דקות. להפריד ולשמור את supernatant לתוך צינור מראש מקורר 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של slurry 50% מגלוטתיון-agarose (סיגמא אולדריץ). סובב למשך 30 דקות ב 4 ° C. בעוד המדגם מסתובב, לעשות חיץ elution טרי: 50 mM טריס 7.8, 0.1% Triton-x100, 0.5 המ&quot;מ dithiothreitol, 10 מ&quot;מ גלוטתיון המופחת. </li></ol> הצעד היחיד של הפרוטוקול שמתבצע בטמפרטורת חדר הוא צעד elution. לכן, חיץ elution נשמר בטמפרטורת חדר. חיץ elution צריך להיות מוכן טרי. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק lysate ותרחיף ל&quot; עמודת כרומטוגרפיה פנויה 5 עם קלקר (90-130 מיקרומטר) מסננים גסים (מדעי אוורגרין). לשטוף את העמודה 5 פעמים עם 3 מ&quot;ל של פוספט נאגר מלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את החלק התחתון של העמודה ולהוסיף 500 μl של חיץ elution טמפרטורת חדר. מכסה את החלק העליון שלטור ולסובב למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. איסוף eluate לתוך צינור microfuge מצונן 1.5 מ&quot;ל. חזור elution עוד פעמים (1.5 eluate הכולל מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזת eluate בקרום 10,000 משקל מולקולרי הפסקת דיאליזה (למשל, Thermo Scientific קלטות Slide-A-Lyzer דיאליזה) ב 4 ליטר של פוספט נאגרה מלוחה הלילה ב 4 ° C. הדיאליזה כנגד 4 ליטר נוסף של פוספט נאגרה מלוחה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ביום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלבון מקלטת הדיאליזה ולבצע בדיקת חלבון כימות לקביעת תשואה של GST-AICD. טיהור טיפוסית מ400 מ&quot;ל של התרבות תגרום לתשואות של&gt; 20 מ&quot;ג של חלבון מטוהר בריכוזים של 10-20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. Aliquot החלבון לתוך 200 aliquots והקפאה μl ב -80 ° C. </li></ol> 3. מחשוף של תרומבין GST-AICD וטיהור AICD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl ההפשרה של מטוהרי GST-AICD ולהוסיף 20 μl של thromb 1 U / μlפנימה דגירת הלילה בשעת 37 ° C. </li></ol> האיכות והטוהר של תרומבין משתנים באופן ניכר בין יצרנים, ויכולות להיות מקור משמעותי של זיהום. אנו משתמשים בתרומבין מGE Healthcare (ראה טבלה של חומרים כימיים). לאחר דגירת הלילה,&gt; 95% מחלבון ההיתוך יש בקע (1B איור). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הלילה עם מחשוף תרומבין, סביר להניח שחלק של AICD המשוחרר עבר צבירה והפתרון יכול להופיע מעונן. נקה את החומר מצטבר ידי צנטריפוגה ב20000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant לתוך צינור microfuge מראש מצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של 50% גלוטתיון-agarose slurry ו50% μl 50 p-aminobenzamidine-agarose slurry להסיר GST ותרומבין, בהתאמה. דגירה עם רוטציה למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה למשקעים את חרוזי agarose, ולהסיר את supernatant לתוך צינור טרי. חלץ tהוא GST ארבע פעמים יותר עם גלוטתיון-agarose. חילוץ יחיד עם p-aminobenzamidine-agarose מספיק כדי להסיר את 20 U של תרומבין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בדיקת quantitation חלבון על 5 μl של AICD המטוהרים. תשואות אופייניות מתרבות מ&quot;ל 400 הן 50-100 מיקרוגרם בריכוז של 0.2-0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. תשואות גבוהות יותר הן אפשריות על ידי ביקוע בכמויות גדולות של GST-AICD. </li></ol> המטוהר AICD צריך להיות מוכן טרי לאפיון ביוכימי / biophysical. חומרים שאינם בשימוש אמורים להיות מושלכים. אפשר גם להתרכז AICD ידי lyophilizing המדגם וresuspending בנפח קטן יותר של 6 חיץ. אם גילוי AICD דורש סופגים (כגון לאחר מלכודת מסנן או assay כתם הנקודה), אחזור אנטיגן על הקרום צריך להתבצע כפי שמתואר על ידי Pimplikar ו12 Suryanarayana. 4. צבירת AICD למיקרוסקופי כוח אטומי (AFM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל טרי AICD בעמ<html> hosphate נאגר מלוח לריכוז של 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בנפח סופי של 15 μl. בשלב זה, תרכובות שונות ו / או חלבונים ניתן להוסיף על מנת לקבוע אם הם מעכבים צבירת AICD. לדוגמה, יש לנו הראינו כי ריכוזי equimolar של ubiquilin-1 למנוע צבירה של AICD בassay 4 זה. </li></ol> אפשר גם לאמצעי תגובה גדולה יותר הכולל לניסויים ביוכימיים כגון מבחני מלכודת סינון ופיזור אור 4. היינו לנו הצלחה בביצוע מבחני מלכודת סינון על תערובות תגובה גדולה כמו 400 μl עם AICD דילול לריכוזים נמוכים כמו 1 מיקרומטר. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להצטברות תרמית על ידי דוגר את הדגימות ב 43 ° C עם הרעד ב800 סל&quot;ד באפנדורף Thermomixer עבור 48 שעות. טמפרטורה זו נבחרה על בסיס מבחנים שבוחנים מלווה צבירת התרמית של synthase מודל מלווה מצע ציטראט 4,13. </li></ol>&gt; צבירה תרמית היא שיטה נפוצה לגרום למעבר המבני של חלבון מילידי מבנה שאינו ילידים (שהיא בדרך כלל גיליון ביתא עשיר) אשר גורם להיווצרות של אגרגטים מולקולאריים. צבירה תרמית משמשת גם כדי לבחון את תפקודו של מלווים מולקולריים, שגוננו מגזרים הידרופובי מ טביעת אינטראקציות מולקולאריים בלתי הולמות (ובכך לעכב או למנוע צבירת תרמית). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את המדגם 20-לקפל במי deionized ו2 μl המקום אל תציץ טרי בקע. ייבש את הדגימה בdessicator בן לילה. יהיה צורך לקבוע באופן אמפירי הדילול האופטימלי להדמיה, וכך כמה דילולים נעים בין 10 - ל 100-קיפול יהיו זהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו AICD מצטבר באמצעות הפעלת AFM במצב הקשה 14. את cantilevers משמש הם מנופים מצופים זהב מייקר חד ניטריד (MSNL, ברוקר) עם רדיוס קצה נומינלי של 2 ננומטר. טיפוסי קשה אמפליטודות durבאמצעות הדמיה היא 10-20 ננומטר בתדר התהודה של cantilevers (30-50 קילוהרץ). </li></ol> מצאנו כי איכות תמונה וחדות של אגרגטים חלבון שונים תלויה בכח המופעל ואת משך הניסוי. כדי למזער את הפרעות מדגם על ידי הקצה, שמרנו את הכח המופעל נמוך יחסית על ידי שמירה על יחס קבוע של מעל 95% והגבלת הסריקה של כל דגימה לדקות 5-10. עיבוד תמונה בוצע עם WSxM תוכנה (Nanotec). עיבוד תמונה סטנדרטי הורכב ממטוס החיסור והשטחה. המעבדות שלנו משתמשות ב&quot; הבית נבנה &quot;15 AFM interfaced למערכת מסחרית סריקת בדיקת מיקרוסקופ שליטה (Nanotec). 5. נציג תוצאות הביטוי וההעשרה יחסית של GST-AICD מוצג באיור 1 א. לאחר תמוגה, רוב חלבון ההיתוך נמצא בחלק המסיס, ולכן חילוץ מinclusiעל גופו לא נדרש. חומר eluted מעמודת agarose גלוטתיון הוא&gt; 95% טהורים. בהכנה מוצגת באיור 1, הריכוז של חלבון eluted מהעמודה היה 14.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל, והתשואה הייתה 22 מ&quot;ג (מתרבות מוצא של 400 מ&quot;ל). מחשוף של 200 μl הכנת הלילה עם 20 U של תרומבין זה הביא לכמעט 100% ממחשוף חלבון ההיתוך (1B איור). הסכום של תרומבין המשמש הוא נמוך מספיק כדי לא להתגלות על ידי צביעה הכחולה Coomassie (ראה מסלול, 1B &quot;בקע&quot; איור). הסרת תרומבין וGST ביאה לירידה בחלק מחומר, אולם זה היה&gt; 90% טהור עם תשואה בהכנת השיעורים של 70 מיקרוגרם של AICD בריכוז של 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל. התרשים 1C מציג את תרשים הזרימה לצבירה של AICD וניתוח שלאחר מכן. אגרגטים AICD צפו בי ידי AFM הם בדרך כלל אליפטית / אמורפי, וטווח בגודל 50-100 ננומטר (1D איור, F). מצטברחומר הוא לא ניתן לגילוי כאשר סכום equimolar של מלווה ubiquilin-1 מתווסף לתגובת הצבירה (האיור 1E) 4. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> איור 1. טיהור וצבירה של AICD.) מכתימה Coomassie כחול של דגימות שנאספו בכל שלב של תהליך הטיהור. לדגימות uninduced ומושרות, 20 μl של חיידקים כלל היה לרוץ על ג&#39;ל. לשבריר supernatant, 5 μl של lysate (מנפח כולל של 20 מ&quot;ל) היה לרוץ על ג&#39;ל. לשבריר הגלול, הגלולה הייתה resuspended ב 20 מ&quot;ל של חיץ תמוגה, ו 5 μl של חומר זה היה sonicated בsonicator אמבט מים למשך 30 דקות ב 4 ° C לפני העמיס על ג&#39;ל. לflowthrough, 5 μl היה לרוץ על ג&#39;ל. סכומי eluate הועמסו על ג&#39;ל מצוינים. B) ג&#39;ל הצבעוני הכחול Coomassie של uncleaved ובקע GST-AICD (2 μl) ו1 ו 5 &amp; מ &#39;u; l מטוהרי AICD. ג) תרשים זרימה של טיהור AICD, צבירה, וניתוח. D, E) תמונה של נציג AFM מצטבר תרמית AICD בהעדר (ד &#39;) והנוכחות (ה) של המלווה המולקולרי ubiquilin-1. F) היסטוגרמה של התפלגות הגודל של אגרגטים AICD.

<ol><li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretases%3A+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li>
<li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+reports%22%5BJournal%5D)">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li>
<li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FE65+proteins+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li>
<li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li>
<li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li>
<li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li>
<li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li>
<li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li>
<li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li>
<li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li>
<li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866(2010).</li>
<li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li>
<li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li>
<li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li>
<li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasi-simultaneous+imaging%2Fpulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707(2007).</li>
<li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction%2C+purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+F+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li>
<li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1%2C+a+lipid+raft+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li>
<li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li>
<li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport%2C+amyloid+precursor+protein%2C+kinesin-1%2C+and+the+processing+apparatus%3A+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li>
<li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li>
<li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+under+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בפרוטוקול זה גבשנו הליך לקבלת AICD הטהור ביותר עבור ניתוחים מבניים, biophysical, וביוכימיים. הליך זה אינו דורש ציוד מתוחכם כרומטוגרפיה ולכן הוא נגיש לרוב המעבדות. קבוצות אחרות לא מטוהרות AICD 5-7,16, כולל GST-AICD 17-19, לניתוחים ביוכימיים / מבניים. חסרונות לפרוטוקולים קודמים כוללים מסיסות ירודה של 16 AICD, פחות מטוהר אידיאלי 17, ודרישה להרחקת גודל 16 או הפוך שלב כרומטוגרפיה 6,20. כך, הפרוטוקול המתואר כאן צריך מאוד ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> תרומבין </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> אמפיצילין </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> מגיב assay חלבון ברדפורד </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie כחול </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (thiogalactopyranoside איזופרופיל-beta-D) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> גלוטתיון-agarose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agarose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> קוקטייל מעכב פרוטאז מלא </td><td> רוש </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> קלטות דיאליזת Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> עמודות כרומטוגרפיה </td><td> מדעי אוורגרין </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> מתחלב </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> מומלץ ביותר </td></tr><tr><td> אפנדורף Thermomixer </td><td> אפנדורף </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> דיסקים יציצו </td><td> טד פלה </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> cantilevers AFM </td><td> ברוקר </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM תוכנה </td><td> Nanotec </td><td> N / </td><td> Free הורדה </td></tr></tbody></table>

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

חלבון מבשר עמילואיד (APP) הוא חלבון הטרנסממברני אני סוג קשור בפתוגנזה של המחלה (לספירה) אלצהיימר. APP מאופיין בתחום תאי גדול ותחום cytosolic קצר כינה התחום התאי APP (AICD). במהלך התבגרות דרך מסלול ההפרשה, APP ניתן בקע ידי פרוטאזות המכונות α, β, וγ-secretases 1. מחשוף פרוטאוליטי רציף של APP עם β-γ וsecretases מוביל לייצור של פפטיד קטן פרוטאוליטי, Aβ כינה, שהוא amyloidogenic ומרכיב הליבה של פלאק סנילי. AICD גם משוחרר מהקרום לאחר עיבוד סקרטאז, ובאמצעות אינטראקציות עם Fe65 וTip60, יכולה translocate לגרעין להשתתף בויסות שעתוק של גני המטרה מרובים 2,3. אינטראקציות בין חלבונים המעורבים AICD עשויות להשפיע על סחר, עיבוד, ופונקציות סלולריות של הולוגרמות APP וC-terminברי al. אנחנו הראינו לאחרונה שAICD יכול המצרפי במבחנה, ותהליך זה מעוכב על ידי ubiquilin-1 מלווה AD-מעורב מולקולרי 4. באופן עקבי עם ממצאים אלה, AICD חשף תחומים הידרופובי והוא מהותי מופרע במבחנת 5,6, אולם זה מקבל מבנה שניוני יציב כאשר חייב Fe65 7. אנחנו הצענו שubiquilin-1 מונע אינטראקציות בין intramolecular ולא תקינות של AICD, מניעת צבירה במבחנה בתאים שלמים 4. בעוד שרוב המחקרים מתמקדים בתפקידו של APP בפתוגנזה של ספירה, את התפקיד של AICD בתהליך זה אינו ברור. ביטוי של AICD הוכח לגרום לאפופטוזיס 8, לווסת את מסלולי איתות 9, ולהסדיר סיד איתות 10. על הביטוי של AICD וFe65 במודל עכבר מהונדס גורם אלצהיימר כמו 11 פתולוגיה, ולאחרונה AICD זוהה בחזייהבlysates ידי מערבי סופג בעת שימוש בטכניקות אחזור אנטיגן מתאימות 12. כדי להקל על מחקרים מבניים, ביוכימי, וbiophysical של AICD, פתח הליך כדי לייצר כמויות גדולות של חלבון recombinantly AICD הטהור ביותר. בנוסף, אנו מתארים שיטה לזירוז בצבירת תרמית מבחנה של AICD וניתוח על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי, biophysical, ומבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על צבירת AICD.

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי לגרום<em&gt; במבחנה</em&gt; צבירת AICD והדמיה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי / המבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על הצבירה שלו.

חלבון מוצא העמילואיד (APP) הוא חלבון קשתי-קרום (transmembrane) מסוג I הקשור לפתוגנזה של מחלת אלצהיימר (AD). APP מאופיין על ידי...

מטרת הליך זה היא לטהר את הדומיין התו-תאי של חלבון המקדימה לאמילואיד, הידוע גם כ-A ICD, ולהציג פרוטוקול לצבירה תרמית ולאפיון של A ICD באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. הדבר מושג תחילה על ידי ביטוי של איחוי A GST של A ICD בחיידקים. לאחר מכן, חלבון ה-G-S-T-A-I-C-D מטהר ונחתוך באמצעות תרומבין כדי להפריד את ה-GST מה-A ICD, וה-GST מוסר.לאחר מכן, מושרה אגרגציה תרמית של A ICD. לבסוף, המצבורים של A ICD מדויקים באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי ניתן לטהר את A ICD להומוגניות בכמות המספיקה לניתוח ביוכימי וביופיזיקלי.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, הדורשות שלבי כרומטוגרפיה מורכבים, הוא קבלת תוצר טהור ומסיס מאוד. ניתן לבודד ICD על גבי ספת המעבדה תוך שימוש בריאגנטים ובציוד סטנדרטיים. ICD המופק באמצעות פרוטוקול זה מתאים לאפיון ביוכימי וביופיזיקלי נוסף.אמינה טי תדגים את הפרוצדורה. ד"ר אנדרס אוברר, פוסט-דוקטור לשעבר במעבדתי, ידגים כיצד לבצע דימות באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי של A ICD. כדי לבטא את הדומיין התוך-תאי הרקומביננטי של A PP או A ICD, התחילו עם תאי BL 21 שעברו טרנספורמציה עם וקטור pgx 41, הנושא את A ICD האנושי המחובר לקצה ה-C של GST; עם מושבה בודדת, חדיעו 10 milliliters של תרשוף LB עם אמפיצילין והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם ניעור חזק למחרת בבוקר.דגרו 400 milliliters של LB ampicillin בבקבוק של one liter יחד עם five milliliters של תרבית הלילה. דגרו ב-37 degrees Celsius עם ניעור חזק עד שהצפיפות האופטית ב-600 nanometers תגיע ל-0.4 עד 0.6. תהליך זה יארך בדרך כלל two עד 2.5 hours כדי להשרות את הביטוי של G-S-T-A-I-C-D.הוספנו 0.4 millimolar של IPTG והדגרנו בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור חזק למשך חמש שעות. סבבנו את התאים בצנטריפוגה ב-6,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C ואחסנו את המשקע במינוס 80 °C. לאחר הכנת באפר ליזיס והנחת הבקטריות על קרח, הוספנו 20 milliliters של באפר למשקע וערבבנו ביסודיות באמצעות שילוב של וורטקס וערבוב עם פיפטה על קרח.שעלק את משקע החיידקים והעבר את הליזט החיידקי השעולק דרך אמולסייזר או מכבש פרנץ' (French press) שקוררו מראש. בלחץ של 30,000 PSI העבר את הליזט דרך האמולסייזר פעם שנייה ואסוף את הליזט למבחנה של 50 milliliter שקוררה מראש. סבב את הליזט בצנטריפוגה ב-15,000 ×g ובטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.הפרידו והעבירו את העליון למבחנה של 50 milliliter שקולל מראש. הוסיפו 500 microliters של slurry בריכוז 50% של glutathione agarose. סובבו במשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius בזמן שהדגימה מסתובבת.הכינו תמיסת אלוציה טרייה לאחר הדגירה. שפכו את הליזט והסלרי (slurry) לתוך עמודת כרומטוגרפיה חד-פעמית מפוליסטירן בגודל חמישה אינץ' עם מסננים גסים. שטפו את העמודה חמש פעמים עם 3 mL של PBS.סגרו את תחתית העמודה והוסיפו 500 µL של תמיסת אלוציה (elution buffer) בטמפרטורת החדר. סגרו את חלקו העליון של העמודה וסובבו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אספו את התסננת הראשונית לתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית מקוררת בנפח 1.5 mL.חזור על תהליך האלוציה פעמיים נוספות. בצע דיאליזה לתמיסת האלוט בעזרת ממбраנת דיאליזה עם סף חיתוך של 10,000 משקל מולקולרי בארבעה ליטרים של PBS למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. למחרת, בצע דיאליזה כנגד ארבעה ליטרים נוספים של PBS בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.הוצא את החלבון מקסטת הדיאליזה ובצע בדיקת כימות חלבון כדי לקבוע את התבלה של G-S-T-A-I-C-D. טיהור טיפוסי מ-400 milliliters של תרבית יניב תבלה של יותר מ-20 milligrams של חלבון מטוהר בריכוזים של 10 עד 20 milligrams per milliliter. חלק את החלבון לאליקווטים של 200 microliter, והקפא בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.כדי לשחרר את ה-A ICD ממיזוג ה-GST, קחו 200 µL של G-S-T-A-I-C-D מטוהר והוסיפו 20 µL של thrombin בריכוז של יחידה אחת ל-µL; דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, הסירו חומרים מצברים באמצעות סנטריפוגציה ב-20,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את העליליות (supernatant) למבחנה מיקרו-צוננת כדי להסיר את ה-GST וה-thrombin. הוסיפו 50 µL של glutathione aro slurry בריכוז של 50% ו-50 µL של p and wino zaine aro slurry בריכוז של 50%, בהתאמה.דגרו עם סיבוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. סובבו בצנטריפוגה למשך זמן קצר כדי לשקע את ה-agro beads והעבירו את הנוזל העליון למבחנה נקייה. חלצו את ה-GST ארבע פעמים נוספות באמצעות glutathione.בצעו בדיקה לכימות חלבון על חמישה מיקרוליטרים של A ICD מטוהר. תנובות טיפוסיות מתוך תרבית של 400 מיליליטר מניבות 50 עד 100 מיקרוגרמים בריכוז של 0.2 עד 0.5 מיליגרם למילליטר. לאחר דילול של A ICD שהוכן טרי ב-PBS לריכוז של 0.1 מיליגרם למילליטר, הושרה אגרגציה תרמית על ידי דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 43 °C במהירות של 800 RPM בשייקר מחומם למשך 48 שעות.דללו את הדגימה פי 20 במים דה-יוניזציה והניחו שתי מיקרוליטרים על מיקה ששודפה לאחרונה. ייבשו את הדגימה בתוך דסיקטור למשך לילה כדי להנמיח את ה-Aβ ICD המצטבר. השתמשו במיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) במצב tapping עם קנטילברים של nitride עם ציפוי זהב ורדיוס קצה נומינלי של 2 ננומטרים.משרעי נקישה טיפוסיים במהלך הדמיה, 10 עד 20 nanometers בתדר התהודה של הזרועות. הביטוי וההעשרה היחסיים של G-S-T-A-I-C-D מוצגים כאן. לאחר ליזיס, רוב חלבון היתוך נמצא בחלק המומס, ולכן אין צורך בחילוץ מגופי הכללה (inclusion bodies).החומר שסנפח מעמודת ה-glutathione היה בטוהר של מעל 95%. בהכנה המוצגת כאן, ריכוז החלבון שסנפח מהעמודה היה 14.5 milligrams per milliliter, והתנובה הייתה 22 milligrams. שבירה של 200 microliters מהכנה זו למשך לילה עם 20 units של thrombin הביאה לשבירה של כמעט 100% מחלבון היתוך (fusion protein).כמות הטורבין שבה נעשה שימוש נמוכה מספיק כדי שלא תהיה ניתנת לגילוי באמצעות kumasi. צביעה בכחול, והסרה של הטורבין וה-GST, הובילו לאובדן מסוים של חומר. עם זאת, רמת הטוהר הייתה גבוהה מ-90% עם תפוקה בהכנה זו של 70 micrograms של A ICD בריכוז של 0.35 milligrams per milliliter.מקבצי A ICD, שצולמו באמצעות FM, הם בדרך כלל סטרואידים אמורפיים וגודלם נע בין 50 ל-100 ננומטרים. חומר מצבר אינו ניתן לזיהוי כאשר מתווספת כמות שוות-מולרית של השפראון UBI Quillin one לתגובת ההצטברות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד לטהר EICD, להשרות את הצטברותו ולדמות את המקבצים באמצעות A-F-M-E-I-C-D.חומרים שזוהו וטוהרו בטכניקה זו יכולים להיות מיושמים בשיטות אחרות, כגון פיזור אור ומבד hoped-filter trap, כדי לענות על שאלות בנוגע להשפעתם של מלווים מולקולריים (molecular chaperones) על אגרגציה של EACD.

purification-aggregation-amyloid-precursor-protein-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה...

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

בעוד התחבורה של חלבונים בתא שטח נלמדת בקלות יחסית, לדמיין את הסחר של חלבונים תאיים הוא הרבה יותר קשה. כאן, אנו משתמשים בשילוב מבני GFP photoactivatable ולהפגין שיטה לעקוב במדויק את החלבון המוצא לעמילואיד מהמערכה גולג'י לתאים למטה זרם ועיקבו אחרי שחרורה.

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

שיטה כרומטוגרפית דו-שלבית מתוארת לטיהור חלבון Shadoo רקומביננטי המתבטא כגופי הכללה ב-Escherichia coli, כמו גם פרוטוקול לסיבית Shadoo מטוהר למבני עמילואיד.

טיהור וקפל שוב לעמילואיד סיבים של (שלו)<sub&gt; 6</sub&gt; חלבון רקומביננטי Shadoo -tagged מבוטא גופי הכללה ב<em&gt; חיידק</em

בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

בתנאי זה הוא פרוטוקול לחקירת האינטראקציות בין הצורה הטבעית, prefibrillar, ו-עמילואיד בוגרים של פפטידים וחלבונים שונים עם המיטו, מבודדים מרקמות שונות ואזורים שונים של המוח.

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

למדו שיטה לטיהור AICD ולצבירתו תרמית באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. הפרוטוקול מאפשר ניתוח ביוכימי של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי במחקר מחלת אלצהיימר.

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

גלה סרטונים נוספים