הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד גרעיני תאי שריר לב (cardiomyocytes) מרקמה לאחר מוות. הדבר משיג תחילה על ידי הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגניזר עם פרוב ומוט זכוכית, ולאחריה מספר שלבי סינון. השלב השני הוא בידוד הפרקציה הגרעינית מהפרקציות התאיות האחרות באמצעות סבב צנטריפוגה לסדימנטציה לפי צפיפות.

בשלב הבא, גרעיני התאיים השריריים של הלב (cardiomyocyte nuclei) מסומנים אימונולוגית באמצעות נוגדן המופק נגד PCM1. השלב הסופי הוא בידוד גרעיני התאיים השריריים המסומנים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting). לבסוף, ממש לפני המשך המניפולציות, נבדקת טהורין גרעיני התאיים השריריים על ידי ניתוח חוזר של פракציות הגרעינים הממוינות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח גרעיני תאי שריר לב (cardiomyocytes) באופן יעילC ובסביבתו גבוהה, הן מרקמה טרייה והן מרקמה קפואה בארכיון. מחקרים מבוססי DNA בתאי שריר לב הם מאתגרים במיוחד מכמה סיבות. ראשית, תאי שריר לב מהווים רק כ-20 30% מהתאים בלב.

יתרה מכך, הם בעלי גרעין במידה משמעותית. בנוסף, תאי שריר לב (cardiomyocytes) הם פוליפלואידיים במידה משמעותית. השיטה המתוארת כאן מתגברת על כל המכשולים הללו.

לפני תחילת הפרוצדורה, יש לצפות מבחנות אולטרה-צנטריפוז'ה ב-10 milliliters של תמיסת ציפוי המכילה 1%BSA בתוספת PBS. לאחר סיבוב המבחנות במשך 30 דקות, יש להסיר את תמיסת הציפוי ולהניח להן להתייבש באוויר.

התחילו את הליך בידוד הגרעינים מהלב על ידי שימוש בסקאלפל כדי להוציא את החדר השמאלי מלב עכבר שהוקפא בהקפאה מהירה. חתכו את הדגימה שהוצאה למקטעים קטנים, ולאחר מכן העבירו את חלקי הרקמה לנבובת קונית של 50 מיליליטר המולאת ב-15 מיליליטר של תמיסת ליזיס (lysis buffer). לאחר מכן, הומוגניזו את רקמת הלב באמצעות הומוגנייזר עם גשושית (probe homogenizer) במהירות של 24,000 RPM למשך 10 שניות, ואז דללו את ההומוגנאט בנפח שווה של תמיסת ליזיס עד לנפח של 30 מיליליטר. העבירו את ההומוגנאט להומוגנייזר זכוכית (glass down homogenizer) ובצעו שמונה תנועות דחיסה באמצעות פסטל בעל מרווח גדול כדי לשחרר את הגרעינים.

לאחר מכן סננו את הגרעינים הגולמיים. בודדו אותם תחילה באמצעות מסננת תאים של 100 micron, ולאחר מכן באמצעות מסננת תאים של 70 micron לתוך מבחנה קונית נקייה של 50 milliliter. כעת סובבו את ת isolate של הגרעינים הגולמיים למשך 10 דקות ב-700 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.

הפוך את המבחנה כדי להסיר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) ולאחר מכן נגב את פנים המבחנה בעזרת נייר סופג. הקפד שלא להפריע למשקע הגרעינים. העבר את התמיסה למעלה ולמטה עם פיפטה מספר פעמים כדי לתלה שוב את הגרעינים הגולמיים.

בצעו בידוד ב-5 milliliters של בופר סוכרוז, ולאחר מכן הוסיפו 25 milliliters נוספים של בופר סוכרוז לתמיחת הגרעינים. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של בופר סוכרוז שהוכן טרי לאחת מנבובות anltacentrifuge המצופות שהוכנו מראש. לאחר מכן, העבירו בזהירות את תמיסת משקע הגרעינים שהושחה מעל הבופר.

לאחר איזון המבחנה ברוטור בעל תנועה חופשית (free swinging rotor), מקרינו את הרוטור לצנטריפוגה במהירות גבוהה וסובבו את דגימת הגרעינים למשך 60 דקות ב-13,000 ×g ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. עם סיום הסבב, הוציאו בזהירות את המבחנות מהרוטור והפכו אותן שוב. כדי להסיר את העילוי, נגבו את השאריות שנותרו מדפנות המבחנה עם נייר סופג כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן השעו שוב את משקע הגרעינים במיליליטר אחד של תמיסת עיכוב (storage buffer) לגרעינים.

לפני תחילת הליך הצביעה האימונוהיסטוכימית, העבירו מנה של 20 µL מדגימת הגרעינים לשפופרת פקס. הוסיפו 980 µL של תחבירי אחסון גרעינים למנה וסמנו את השפופרת כביקורת שלילית. כעת הוסיפו נוגדן anti PCM one לדגימת הגרעינים ולשפופרות הביקורת השלילית בדילול של 1:500.

לאחר מכן, דגרו את שני המבחנות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, לאחר שטיפת המבחנות בבופר לאחסון גרעינים והשלכת הנוזל העליון, השעיקו את משקעי הגרעינים במיליליטר נוסף של בופר לאחסון גרעינים.

לאחר מכן, הוסיפו נוגדן משני פלואורסצנטי אנטי-ארנב לדגימות התאים בדילול של 1:100 והדגירו אותן בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת. לאחר שטיפת המבחנות עם באפר לשימור גרעינים, השביו את המשקעים ב-1 mL של באפר לשימור גרעינים לצורך מיון ואנליזה בציטומטריית זרימה. לאחר ציפוי מבחנות איסוף הגרעינים ב-BSA וב-PBS, כפי שבוצע בתחילת הסרטון, התחילו בסינון הדגימה והביקורת השלילית דרך מסנני תאים נפרדים של 30 micron. ממש לפני הטעינה, הוסיפו צבע DNA.

הוסיפו דילול של 1:500 לזיהוי אוכלוסיות הגרעינים. העמיסו את הביקורת השלילית למכשיר הסייטומטר הזורם (flow cytometer). השתמשו בפרמטרים של פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צידי (side scatter) כדי לקבוע את השער הראשון להגדרת הגרעינים הלבביים, באופן דומה לתרשים ה-DOT המוצג כאן.

לאחר מכן, השתמשו בפרמטרים של פיזור קדימה (forward scatter) ורוחב פולס של פיזור קדימה כדי ליצור שער (gate) שני סביב הגרעינים הבודדים (nuclei singlets), באופן דומה לתרשים ה-DOT המוצג כאן. כעת טענו את הדגימה המסומנת אימונולוגית והציבו את השער השלישי להבחנה בין גרעיני קרדיומיוציטים חיוביים ל-PCM 1 לבין גרעינים של תאים שאינם קרדיומיוציטים ושליליים ל-PCM 1. השתמשו בצביעת ה-DNA הגרעיני כדי לנתח את תכולת ה-DNA ולבצע ניתוח של מחזור התא, בדומה לניתוח המוצג בהיסטוגרמה זו.

לאחר מיון הגרעינים על סמך חיוביות ל-PCM one, הניחו את הגרעינים הממוינים על קרח ובצעו ניתוח חוזר של מנה (aliquot) מכל דגימה ממוינת כדי לקבוע את טוהר המיון. לבסוף, הריצו את הגרעינים הממוינים בצנטריפוגה בתוך מבחנות האיסוף למשך 15 דקות במהירות של 1500 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר השלכת העל-נוזל (supernatant), השעיקו מחדש את משקעי הגרעינים בבופר המתאים ליישום המשך הרצוי.

באיור ראשון זה, לב של עכבר בוגר נצבע בצבע גרעיני ובנוגדנים נגד PCM1, גורם השעתוק של לב העכבר NKX2.5, ושרשראות כבדות של מיוזין או MHC. כאן מוצג תקריב של החפיפה מהאיור הקודם. שימו לב כי הגרעינים המסומנים ב-PCM1 בלבן מבטאים את גורם השעתוק NKX2.5 באדום ומוקפים בציטופלזמה של תאי שריר הלב בירוק.

נתונים אלו מדגימים יחד את הדיוק שבו צביעת PCM one מזהה גרעינים של קרדיומיוציטים. התמונה המוקטנת מדגישה את דפוס הצביעה האפי-גרעיני (epi nuclear) של PCM one בגרעיני מיוציטים, כפי שמוצג בהמשך באמצעות החצים בניסוי המתואר בשלוש הדמויות הבאות; גרעיני לב מבודדים נצבעו בצבע ה-DNA DRAC five ובנוגדנים נגד PCM one. כאן, בהסמיכה (overlay) של שתי הדמויות הקודמות, החצים מדגישים שוב את דפוס הצביעה האפי-גרעיני של PCM one בגרעיני הקרדיומיוציטים המבודדים.

תרשים נקודות זה מדגים כי כ-30% מהגרעינים שבודדו בשיטה זו הם גרעיני קרדיומיוציטים, כפי שמעיד הסימון שלהם ב-PCM one. לבסוף, כפי שממחישות היסטוגרמות אלו, גרעיני קרדיומיוציטים של עכבר הם בעיקר דיפלואידיים, כפי שמעיד פיסגות ה-two N, ורק תת-קבוצה קטנה היא טטראפלואידית, כפי שמעיד פיסגות ה-four N הקטנות יותר. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא שניתן להתאימה בקלות למינים אחרים.

בדומה לבני אדם.