Name: הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למדו שיטה לבידוד גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות באמצעות הומוגניזציה, סנטיפוגה צפיפות ומיון תאים פלואורסצנטי. השיטה מספקת טוהר גבוה לניתוח ביולוגיה מולקולרית של הלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אוהבים להכיר מרסלו טורו לעזרה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי השוודי לב, ריאות וגם קרן, הנציבות של האיחוד האירופי FP7 &quot;CardioCell&quot;, שוודית מועצת המחקר, AFA ביטוחים ו ALF. OB נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft.

1. הבידוד של גרעינים לב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge המעיל צינורות (צינורות Beckman צנטריפוגות # 363664) עם 10 מ&quot;ל של תמיסת BSA / PBS 1% ציפוי. מכסה צינורות ולתת להם להסתובב למשך 30 דקות ב Rotator צינור. הסר את פתרון הציפוי ולתת צנטריפוגות צינורות אוויר יבש (1 צינור לכל הלב העכבר נדרש ניתוח לב עכבר אחת, לסירוגין עד 5 לבבות עכבר או 1 גרם של רקמת לב ממספר זנים שונים (למשל אדם) יכול להיות מעובד בצינור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל השלבים הבאים יש לבצע על הקרח. לנתח את החדר השמאלי של הלב העכבר טרי או קפוא הצמד עם אזמל. שים לב, פרוטוקול זה הוא מותאם במיוחד הלב העכבר אבל יכול גם להיות מותאם חולדה או לב אנושי. לחלופין, השתמש עד 1 גרם של רקמת לב מכמה מינים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הדגימה לתוך תאים קטנים עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות רקמה לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל 15 מ&quot;ל מלא של המאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenizeרקמת לב עם T-25-Ultra Turrax בדיקה homogenizer (איקא) בסל&quot;ד 24,000 עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את homogenate עם נפח שווה של חיץ תמוגה ל 30 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש כוס douncer (40 מ&quot;ל) כדי להמשיך homogenize רקמות גרעינים חינם. לבצע שמונה משיכות עם העלי אישור גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הגרעינים גולמי לבודד באמצעות 100 מיקרומטר ו 70 מיקרומטר רשת ניילון התא מסננת (BD Biosciences), ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את הגרעינים גולמי לבודד בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant בקפידה על ידי צינורות היפוך ולנגב את פנים הצינור עם מגבת נייר. להיזהר לא להפריע גרעינים גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הגרעינים גולמי לבודד ב 5 מ&quot;ל של חיץ סוכרוז על ידי pipetting הפתרון מספר פעמים למעלה ולמטה. הוסף עוד 25 מ&quot;ל של חיץ סוכרוז כדי גלולה המומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ סוכרוז מוכן טרי לצינור ultracentrifuge מצופה (ראה שלב 1.1). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות כיסוי מ&quot;ל מוסף 10 של המאגר סוכרוז עם גרעינים גלולה resuspended מומס חיץ סוכרוז משלב 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתרה צינורות צנטריפוגות לפני הצבתם לתוך הרוטור JS13.1 מתנדנד חופשי למקם את הרוטור לתוך הצנטריפוגות במהירות גבוהה (Beckman אוואנטי-S 25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין גרעיני מדגם XG ב 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ספין השלימה, להסיר את צינורות בקפידה מתוך הרוטור וזורקים supernatant ידי צינורות היפוך ומוחה את הפסולת שנותרה מבפנים של צינורות עם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הגרעינים גלולה ב 1ml של למאגר אחסון גרעינים (NSB בתוספת חיץ). הערה: NSB פלוס מכיל 1.5 מ&quot;מ spermine כמייצב DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם צעד 2.1, immunostaining של גרעיני cardiomyocyte. </li></ol> 2. Immunostaining עבור cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את השליטה שלילי immunostaining. קח את aliquot של 20 μl של המדגם גרעינים וdd 980 μl של NSB בתוספת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חומר אנטי pericentriolar 1 נוגדנים (הארנב נגד PCM-1, נוגדנים אטלס) מדגם גרעינים בדילול של 1:500 כדי גרעינים immunolabel cardiomyocyte. מוסיפים את הנוגדן isotype בדילול כמו נוגדנים נגד PCM-1 לשליטה שלילי, מוכן בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שליטה שלילי צינור דגימה ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השליטה מדגם שלילי לפחות פעם אחת עם NSB בתוספת חיץ (לסובב את הצינורות בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. מחק supernatant ו לפזר את הגרעינים גלולה ב 1 מ&quot;ל של NSB בתוספת חיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נגד ארנב נוגדנים משני ניאון (FITC או APC) לשליטה שלילי צינור דגימה בדילול של 1:1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שליטה שלילי צינור דגימה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השליטה מדגם שלילי לפחות פעם אחת עם NSB בתוספת חיץ (לסובב את הצינורות בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. מחק supernatant ו לפזר את הגרעינים גלולה ב 1 מ&quot;ל של NSB בתוספת חיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך ניתוח זרימת מיון cytometric ו. </li></ol> 3. תזרים Cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעינים המעיל איסוף צינורות פלקון (15 מ&quot;ל) עם פתרון BSA / PBS 1% לפני תחילת זרימת cytometry מיון כמתואר בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן מדגם הביקורת השלילית דרך מסננת 30 מיקרומטר תא המטען הראשון הביקורת השלילית cytometer את זרימת (זרם BD). הגדר את השער הראשון והשני להגדיר גרעינים ו singlets (גרעינים אחת), המבוססת על פיזור קדימה (FSC), פיזור קדימה רוחב הפולס (רוחב הדופק FS) ולפזר בצד (SSC) (איור 2 א &#39;וב&#39;). הוספת ה-DNA כתם (DRAQ5 (1:500)) המדגם יכול לעזור לזהות את האוכלוסייה גרעינים בתחילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם immunolabeled ולהגדיר את השער 3 לבודד גרעינים cardiomyocyte (PCM-1-positve) מן הגרעינים הלא cardiomyocyte (PCM-1-שלילי). להתחיל את המיון(איור 2 ג ו - ד). </li></ol> אופציונלי: כדי לנתח את תוכן ה-DNA הגרעיני (ploidy) ולבצע ניתוח מחזור התא להוסיף DNA המתאים כתם על גרעינים (למשל Hoechst 33342 או DRAQ5) (איור 2 ה). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מיון cytometry זרימה, הצב את הגרעינים על הקרח מחדש לנתח כדי לקבוע את טוהר מיון (איור 3 א &#39;וב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את הגרעינים למיין את צינורות לאיסוף XG 1500 בצנטריפוגה בקירור במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הגרעינים גלולה במאגר תואם יישום במורד הזרם. </li></ol> 4. נציג תוצאות מורפולוגיה גרעינים ויושרה ניתן להעריך על ידי כתמי דנ&quot;א דמיינו ידי מיקרוסקופ (איור 1). מוצלח PCM-1 תיוג ניתן להעריך על ידי מיקרוסקופ epifluorescence ועל ידי cytometry זרימה (איור 1, איור. 2C ו-D). PCM-1-positiיש ואוכלוסיות שליליות צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה (איור 2 ג ו - ד). ב החדר השמאלי Murine על 30% גרעינים כל צריך להיות cardiomyocyte גרעינים (איור 2). מיון טוהר אפשר להעריך מחדש על ידי ניתוח מיון גרעינים (איור 3 א &#39;וב&#39;). שתי אוכלוסיות גרעינים צריך טוהר מיון עולה על 95%. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> באיור 1. PCM-1 מזהה גרעינים cardiomyocyte. גרעינים לב (א) מגואלות נוגדנים ל PCM-1 (ב) ו Nkx2.5 (ג) בלב עכבר בוגר. (ד) PCM-1-שכותרתו גרעינים מוקפים בציטופלסמה cardiomyocyte (שרשרת כבדה שרירן (MHC)) ולהביע גורם שעתוק Nkx2.5, המתעד את זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte ידי מכתים-1 PCM (ברים בקנה מידה 20 ו -10 מיקרומטר מיקרומטר (ד, הבלעה)). (ה) מבודד גרעינים הלב דמיינו עם ה-DNA כתם DRAQ5. (F ו-G) Cardiomyocגרעינים yte מסומנים עם נוגדנים כנגד PCM-1 (מיקרומטר בהיקף 10 בר). שים לב, דפוס מכתים epinuclear של PCM-1 בגרעין myocyte בסעיף רקמות בגרעין מבודד (חיצים). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> איור 2. תזרים מיון cytometric של גרעיני cardiomyocyte. (א) גרעיני לב מזוהים פיזור קדימה (FSC) וצד פיזור (SSC). (ב) שער 2 מזהה גרעינים אחד על ידי FSC ו FS רוחב פולס 5. (ג, ד) gating פלורסנט מאפשר הפרדת הגרעינים cardiomyocyte (PCM-1-חיובי) ולא cardiomyocyte (PCM-1-שלילי) גרעינים של רקמת לב. (ה) עכבר cardiomyocyte הם ברובם (&gt; 80%) דיפלואידי (2n), רק קבוצה קטנה הוא tetraploid (4n) 6. שים לב, cardiomyocytes אדם להכיל תדירות גבוהה יותר של גרעינים polyploidy (&gt; 2n) 7,8. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <strong&gt; באיור 3. טוהר ניתוח של גרעיני cardiomyocyte ולא cardiomyocyte מיון. ניתוח מחדש של גרעינים שאינם cardiomyocyte (א) ו cardiomyocyte מיון (ב). שתי האוכלוסיות להראות טוהר מיון עולה על 99%.

<ol><li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li>
<li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li>
<li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content%2C+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li>
<li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content%2C+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts%3A+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li>
<li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li>
<li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li>
<li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2-5%28eGFP%2Fw%29+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li>
<li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28(2009).</li>
<li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li>
<li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li>
<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte הוא קריטי לניתוח תהליכי ההתחדשות של שריר הלב 2,3. טכניקות קונבנציונאלי לבודד מרקמות cardiomyocytes טרי מבוססים בעיקר על עיכול אנזימטי של חלבונים תאי מטריקס וטיהור הבאים מתאי ביניים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור נוסף של cardiomyocytes חיים מתאי גזע עובריים (ESC) יכול להתבצע על ידי immunolabeling עם סמנים פני השטח כגון SIRPA 9 או 10 צבעים המיטוכונדריה, cardiomyocytes קבועות ניתן לזהות על ידי סמנים cytoplasm...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1. מאגר תמוגה </td></tr><tr><td> שם מגיב </td></tr><tr><td> 0.32 מ &#39;סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 mM מגנזיום אצטט </td></tr><tr><td> 2.0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 מ&quot;מ EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2. סוכרוז חיץ </td></tr><tr><td> שם מגיב </td></tr><tr><td> 2.1 מ &#39;סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM מגנזיום אצטט </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 3. אחסון גרעינים חיץ (NSB פלוס) </td></tr><tR&gt; <td> שם מגיב </td></tr><tr><td> 0.44 מ &#39;סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;מ spermine </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומרים כימיים וציוד </td><td> חברה </td></tr><tr><td> Isotype ארנב IgG-Chip כיתה, # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> הארנב נגד PCM-1 נוגדנים, # HPA023374 </td><td> אטלס נוגדנים </td></tr><tr><td> החמור שניות. , נוגדנים נגד ארנב Alexa 488 פלואוריד, # 21206, או שווה ערך שניות. ניאון נוגדן </td><td> החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> תא מסננות 30 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> זכוכית douncer (40 מ&quot;ל) ובוכנה &quot;L&quot; </td><td> VWR (ויטון תעשיות בע&quot;מ) </td></tr><tr><td> T-25-Ultra Turrax Homogenizer </td><td> איקא גרמניה </td></tr><tr><td> פיזור S25 N-18 כלי G </td><td> איקא גרמניה </td></tr><tr><td> Beckman צנטריפוגה אוואנטי </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> פלקון צינורות 15 מ&quot;ל ו -50 מ&quot;ל </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman צינורות צנטריפוגות # 363664 </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> JS13.1 הרוטור מתנדנד חינם </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> גל cytometer </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> צינור Rotator </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

הבידוד של גרעיני cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

זיהוי של גרעיני cardiomyocyte כבר מאתגר בסעיפים רקמות כמו רוב אסטרטגיות לסמוך רק על חלבונים סמן cytoplasmic 1. אירועים נדירים מיוציטים לב כגון התפשטות אפופטוזיס מחייבים זיהוי מדויק של גרעיני myocyte לב לנתח חידוש הסלולר הומאוסטזיס ובתנאים פתולוגיות 2. כאן, אנו מספקים שיטה לבודד את הגרעינים cardiomyocyte מרקמות מורטם הודעה על ידי שקיעה צפיפות immunolabeling עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) ומיון לאחר cytometry הזרימה. אסטרטגיה זו מאפשרת ניתוח התפוקה בידוד גבוה עם יתרון של עובד באותה מידה על רקמות טרי חומר ארכיוני קפוא. זה מאפשר ללמוד החומר שנאסף כבר biobanks. טכניקה זו ישימה ונבדקו מגוון רחב של מינים מתאימים ליישומים רבים במורד הזרם כמו פחמן 14 תיארוך 3, תאים סיCLE ניתוח 4, ויזואליזציה של אנלוגים תימידין (למשל BrdU ו IdU) 4, ניתוח transcriptome ו epigenetic.

גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

זיהוי גרעינים של תאי שריר לב (cardiomyocytes) בחתכי רקמה היה מאתגר, שכן רוב האסטרטגיות מסתמכות אך ורק על חלבונים המסמנים את הציטופלזמה1. אירועים נדירים...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד גרעיני תאי שריר לב (cardiomyocytes) מרקמה לאחר מוות. הדבר משיג תחילה על ידי הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגניזר עם פרוב ומוט זכוכית, ולאחריה מספר שלבי סינון. השלב השני הוא בידוד הפרקציה הגרעינית מהפרקציות התאיות האחרות באמצעות סבב צנטריפוגה לסדימנטציה לפי צפיפות.בשלב הבא, גרעיני התאיים השריריים של הלב (cardiomyocyte nuclei) מסומנים אימונולוגית באמצעות נוגדן המופק נגד PCM1. השלב הסופי הוא בידוד גרעיני התאיים השריריים המסומנים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting). לבסוף, ממש לפני המשך המניפולציות, נבדקת טהורין גרעיני התאיים השריריים על ידי ניתוח חוזר של פракציות הגרעינים הממוינות.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח גרעיני תאי שריר לב (cardiomyocytes) באופן יעילC ובסביבתו גבוהה, הן מרקמה טרייה והן מרקמה קפואה בארכיון. מחקרים מבוססי DNA בתאי שריר לב הם מאתגרים במיוחד מכמה סיבות. ראשית, תאי שריר לב מהווים רק כ-20 30% מהתאים בלב.יתרה מכך, הם בעלי גרעין במידה משמעותית. בנוסף, תאי שריר לב (cardiomyocytes) הם פוליפלואידיים במידה משמעותית. השיטה המתוארת כאן מתגברת על כל המכשולים הללו.לפני תחילת הפרוצדורה, יש לצפות מבחנות אולטרה-צנטריפוז'ה ב-10 milliliters של תמיסת ציפוי המכילה 1%BSA בתוספת PBS. לאחר סיבוב המבחנות במשך 30 דקות, יש להסיר את תמיסת הציפוי ולהניח להן להתייבש באוויר.התחילו את הליך בידוד הגרעינים מהלב על ידי שימוש בסקאלפל כדי להוציא את החדר השמאלי מלב עכבר שהוקפא בהקפאה מהירה. חתכו את הדגימה שהוצאה למקטעים קטנים, ולאחר מכן העבירו את חלקי הרקמה לנבובת קונית של 50 מיליליטר המולאת ב-15 מיליליטר של תמיסת ליזיס (lysis buffer). לאחר מכן, הומוגניזו את רקמת הלב באמצעות הומוגנייזר עם גשושית (probe homogenizer) במהירות של 24,000 RPM למשך 10 שניות, ואז דללו את ההומוגנאט בנפח שווה של תמיסת ליזיס עד לנפח של 30 מיליליטר. העבירו את ההומוגנאט להומוגנייזר זכוכית (glass down homogenizer) ובצעו שמונה תנועות דחיסה באמצעות פסטל בעל מרווח גדול כדי לשחרר את הגרעינים.לאחר מכן סננו את הגרעינים הגולמיים. בודדו אותם תחילה באמצעות מסננת תאים של 100 micron, ולאחר מכן באמצעות מסננת תאים של 70 micron לתוך מבחנה קונית נקייה של 50 milliliter. כעת סובבו את ת isolate של הגרעינים הגולמיים למשך 10 דקות ב-700 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.הפוך את המבחנה כדי להסיר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) ולאחר מכן נגב את פנים המבחנה בעזרת נייר סופג. הקפד שלא להפריע למשקע הגרעינים. העבר את התמיסה למעלה ולמטה עם פיפטה מספר פעמים כדי לתלה שוב את הגרעינים הגולמיים.בצעו בידוד ב-5 milliliters של בופר סוכרוז, ולאחר מכן הוסיפו 25 milliliters נוספים של בופר סוכרוז לתמיחת הגרעינים. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של בופר סוכרוז שהוכן טרי לאחת מנבובות anltacentrifuge המצופות שהוכנו מראש. לאחר מכן, העבירו בזהירות את תמיסת משקע הגרעינים שהושחה מעל הבופר.לאחר איזון המבחנה ברוטור בעל תנועה חופשית (free swinging rotor), מקרינו את הרוטור לצנטריפוגה במהירות גבוהה וסובבו את דגימת הגרעינים למשך 60 דקות ב-13,000 ×g ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. עם סיום הסבב, הוציאו בזהירות את המבחנות מהרוטור והפכו אותן שוב. כדי להסיר את העילוי, נגבו את השאריות שנותרו מדפנות המבחנה עם נייר סופג כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן השעו שוב את משקע הגרעינים במיליליטר אחד של תמיסת עיכוב (storage buffer) לגרעינים.לפני תחילת הליך הצביעה האימונוהיסטוכימית, העבירו מנה של 20 µL מדגימת הגרעינים לשפופרת פקס. הוסיפו 980 µL של תחבירי אחסון גרעינים למנה וסמנו את השפופרת כביקורת שלילית. כעת הוסיפו נוגדן anti PCM one לדגימת הגרעינים ולשפופרות הביקורת השלילית בדילול של 1:500.לאחר מכן, דגרו את שני המבחנות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, לאחר שטיפת המבחנות בבופר לאחסון גרעינים והשלכת הנוזל העליון, השעיקו את משקעי הגרעינים במיליליטר נוסף של בופר לאחסון גרעינים.לאחר מכן, הוסיפו נוגדן משני פלואורסצנטי אנטי-ארנב לדגימות התאים בדילול של 1:100 והדגירו אותן בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת. לאחר שטיפת המבחנות עם באפר לשימור גרעינים, השביו את המשקעים ב-1 mL של באפר לשימור גרעינים לצורך מיון ואנליזה בציטומטריית זרימה. לאחר ציפוי מבחנות איסוף הגרעינים ב-BSA וב-PBS, כפי שבוצע בתחילת הסרטון, התחילו בסינון הדגימה והביקורת השלילית דרך מסנני תאים נפרדים של 30 micron. ממש לפני הטעינה, הוסיפו צבע DNA.הוסיפו דילול של 1:500 לזיהוי אוכלוסיות הגרעינים. העמיסו את הביקורת השלילית למכשיר הסייטומטר הזורם (flow cytometer). השתמשו בפרמטרים של פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צידי (side scatter) כדי לקבוע את השער הראשון להגדרת הגרעינים הלבביים, באופן דומה לתרשים ה-DOT המוצג כאן.לאחר מכן, השתמשו בפרמטרים של פיזור קדימה (forward scatter) ורוחב פולס של פיזור קדימה כדי ליצור שער (gate) שני סביב הגרעינים הבודדים (nuclei singlets), באופן דומה לתרשים ה-DOT המוצג כאן. כעת טענו את הדגימה המסומנת אימונולוגית והציבו את השער השלישי להבחנה בין גרעיני קרדיומיוציטים חיוביים ל-PCM 1 לבין גרעינים של תאים שאינם קרדיומיוציטים ושליליים ל-PCM 1. השתמשו בצביעת ה-DNA הגרעיני כדי לנתח את תכולת ה-DNA ולבצע ניתוח של מחזור התא, בדומה לניתוח המוצג בהיסטוגרמה זו.לאחר מיון הגרעינים על סמך חיוביות ל-PCM one, הניחו את הגרעינים הממוינים על קרח ובצעו ניתוח חוזר של מנה (aliquot) מכל דגימה ממוינת כדי לקבוע את טוהר המיון. לבסוף, הריצו את הגרעינים הממוינים בצנטריפוגה בתוך מבחנות האיסוף למשך 15 דקות במהירות של 1500 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר השלכת העל-נוזל (supernatant), השעיקו מחדש את משקעי הגרעינים בבופר המתאים ליישום המשך הרצוי.באיור ראשון זה, לב של עכבר בוגר נצבע בצבע גרעיני ובנוגדנים נגד PCM1, גורם השעתוק של לב העכבר NKX2.5, ושרשראות כבדות של מיוזין או MHC. כאן מוצג תקריב של החפיפה מהאיור הקודם. שימו לב כי הגרעינים המסומנים ב-PCM1 בלבן מבטאים את גורם השעתוק NKX2.5 באדום ומוקפים בציטופלזמה של תאי שריר הלב בירוק.נתונים אלו מדגימים יחד את הדיוק שבו צביעת PCM one מזהה גרעינים של קרדיומיוציטים. התמונה המוקטנת מדגישה את דפוס הצביעה האפי-גרעיני (epi nuclear) של PCM one בגרעיני מיוציטים, כפי שמוצג בהמשך באמצעות החצים בניסוי המתואר בשלוש הדמויות הבאות; גרעיני לב מבודדים נצבעו בצבע ה-DNA DRAC five ובנוגדנים נגד PCM one. כאן, בהסמיכה (overlay) של שתי הדמויות הקודמות, החצים מדגישים שוב את דפוס הצביעה האפי-גרעיני של PCM one בגרעיני הקרדיומיוציטים המבודדים.תרשים נקודות זה מדגים כי כ-30% מהגרעינים שבודדו בשיטה זו הם גרעיני קרדיומיוציטים, כפי שמעיד הסימון שלהם ב-PCM one. לבסוף, כפי שממחישות היסטוגרמות אלו, גרעיני קרדיומיוציטים של עכבר הם בעיקר דיפלואידיים, כפי שמעיד פיסגות ה-two N, ורק תת-קבוצה קטנה היא טטראפלואידית, כפי שמעיד פיסגות ה-four N הקטנות יותר. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא שניתן להתאימה בקלות למינים אחרים.בדומה לבני אדם.

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

כימות תחלופת הקרדיומיוציטים הוא מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן תורם תרומה חשובה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר כימות מדויק ורגיש של יצירת גרעיני ניאו-קרדיומיוציטים וגרעיני פלואידיה.

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

מטרת עבודה זו היא לפתח שיטה לבודד באופן רקרדיומיוקיטים מהלב הבוגר ים למדוד תוכן DNA וגרעין.

בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד כמות מספקת של לא-קרדיומיוציטים בודדים עם כדאיות גבוהה מלב עכבר לאחר אוטם שריר הלב (MI). זה יכול לשמש לריצוף תא בודד לאחר מכן, ניתוח ציטומטריית זרימה, ותרבית תאים ראשונית.

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

דגימות רקמת אנדארטרקטומיה כלילית עובדו לבידוד גרעינים בודדים באמצעות פרוטוקול דיסוציאציה אופטימלי. שלמות הגרעינים המבודדים אושרה באמצעות שלוש גישות משלימות: צביעת טריפאן כחולה להערכת שלמות הממברנה, מיקרוסקופיה קונפוקלית מבוססת DAPI לאישור מורפולוגיה גרעינית, וציטומטריית זרימה לכמת תפוקת וטוהר גרעיניים.

בידוד גרעין יחיד מרקמת אנדרטרקטומיה כלילית של חולי מעקף עורק כלילי

למדו שיטה לבידוד גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות באמצעות הומוגניזציה, סנטיפוגה צפיפות ומיון תאים פלואורסצנטי. השיטה מספקת טוהר גבוה לניתוח ביולוגיה מולקולרית של הלב.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

גלה סרטונים נוספים