תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס
24 באוגוסט 2012
בפרוטוקול זה, אנו מעדכנים את ההתקדמות האחרונה בתחום ההדמיה Ca 2 + אותות של נוירונים GFP-tagged בפרוסות רקמת המוח באמצעות ניאון אדום Ca 2 + מחוון צבע.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר תגובות סידן המושרות על ידי גירוי, הן בנוירונים המסומנים ב-GFP, באופן מרחבי, והן באופן זמני בחתכי מוח באמצעות צבע אינדיקטור לסידן פלואורסצנטי שאינו ירוק. הדבר משיג תחילה על ידי הוצאת המוח של עכבר טרנסגני המבטא GFP בתאים ספציפיים. השלב השני הוא הכנת חתכי רקמה באמצעות מיקרוטום.
בשלב הבא, מעבירים בעזרת פיפט את תמיסת טעינת צבע האינדיקטור לסידן על גבי הפרוסות כדי לאפשר לספיגת הצבע על ידי תאי המוח. השלב הסופי הוא ביצוע הקלטת חותמת זמן (timestamp) של תאים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, תגובות סידן בנוירונים המסומנים ב-GFP מוצגות באמצעות ניתוח דימות סידן רב-צבעי.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות של מיקרוסקופיה קונפוקלית הוא היכולת להדגים סידן בנוירונים המבטאים GFP פלואורסצנטי ירוק תוך שימוש בצבע אינדיקטור סידן פלואורסצנטי עם הסטה לאדום. הסטת ספקטרום הפליטה הגדולה של הצבע האדום מאפשרת לנו לבצע ניתוח רב-צבעוני של הפלואורסצנציה האדומה בשילוב עם ה-GFP הירוק תוך שימוש באורכי גל עירור בודדים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר נתקלנו בבעיה של ניטור אותות סידן בנוירונים שניתן היה לזהות רק באמצעות תג פלואורסצנטי גנטי, שהיה החלבון הפלואורסצנטי הירוק.
כעת אני הדגים מספר שלבים קריטיים בפרוצדורה זו. התחילו את הפרוצדורה על ידי מזיגת תמיסת האגר החמה לתוך צלחת פטרי מרובעת לגובה של 1 cm; לאחר קירור והתקשות, חתכו את ג'ל ה-4%agar לקוביות של 1 cm³ והניחו אותן בבקבוק לאחסון. לאחר עריפת העכבר, חתכו את הקרקפת באמצעות להב תער חד-צדדי בכיוון סגיטלי מרכזי, מהעצם המצחית ועד לבליטה הת后 occipital החיצונית.
לאחר מכן, פתח עוד יותר את קרובית הראש החתוכה תחילה בכיוון הרוסטרלי-לטרלי (קדמי-צדי). לאחר מכן, פתח אותה בכיוון הוונטרלי (בטני). לבסוף, בצע שני חתכים לטרליים (צדיים) וחתך רוסטרלי (קדמי) אחד.
באזור ה-foramen magnum, השתמש במספרי קפיץ קטנים כדי להסיר בזהירות את הגולגולת. בשלב זה, עצם העורף (occipital), העצמות הבין-קודקודיות (inter parietal) ועצמות הקודקוד (parietal) צריכות להיות מופרדות. אם ה-dura mater עדיין קיימת, הסר אותה בזהירות בעזרת פינצטה כדי למנוע נזק למוח.
בשלב הבא, הסר את עצם הקשקש (squamal bone), את הפתח האתמואידי הקדמי ואת הפורמן הפרונטלי. כעת ניתן להוציא את המוח בקלות באמצעות שפכטל מיקרו-כף הפוך ולנתק את העצבים הגולגולתיים. יש להניח את המוח על משטח עמיד לחיתוך כאשר הצד הוונטרלי שלו פונה כלפי מטה.
השתמשו בלהב תער בעל קצה יחיד כדי להסיר את המוחון. משטח חיתוך ישר זה ישמש כבסיס להצמדת המוח ללוח, כדי לאפשר חיתוך של נתחים קורונליים של המוח. לאחר מכן, הדביקו את המוח, כאשר משטח החיתוך פונה כלפי מטה, ללוח הבסיס של המיקרוטום באמצעות כמות קטנה של דבק סיאנואקרילט ("סופר גלו") בעל ביצועים גבוהים וזמן ייבוש מהיר.
לאחר מכן, הדביקו קוביית ג'ל אגר של סנטימטר מעוקב אחד לצדו הגבתי (ventral) של המוח על לוח הבסיס של המיקרוטום, כדי לתמוך במוח ולקבע אותו במהלך החיתוך. לאחר שהדבק התייבש, הכניסו את הלוח לאמבט המיקרוטום המכיל תמיסה חוץ-תאית מחומצנת בטמפרטורה של 6 °C. לאחר מכן, חתכו את המוח לפרוסות בעובי של 300 מיקרון במהירות חיתוך נמוכה; אספו את פרוסות המוח בחתך קורונלי עד לסיום חיתוך המוח כולו.
כעת הכינו תמיסת onic F1 27 בריכוז 20% ב-DMSO על ידי הוספת תמיסת DMSO לאבקת onic F1 27. לאחר מכן, המיסו את החומר באמצעות סוניקציה ישירה של התמיסה למשך שתי דקות. לאחר מכן, הוסיפו חמישה µL של תמיסת onic F1 27 בריכוז 20% למבחנה המכילה 50 µg של furred am חודר תאים.
ערבבו את התמיסה באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת 45 µL של תמיסה חוץ-תאית וערבבו במכשיר וורטקס. בקצרה, הוסיפו 325 µL נוספים של תמיסה חוץ-תאית וחשפו את המבחנה לאולטרסאונד (sonicate) למשך שלוש דקות נוספות.
לאחר הסוניקציה, הוסף 1.156 milliliters של תמיסה חוץ-תאית מחומצנת כדי לקבל את תמיסת הטעינה הסופית של אינדיקטור הסידן D. העבר את חיתוכי המוח הקורונליים לפלטת תרבית תאים של שש בארות המלאה בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת, עד שישה חיתוכים לבארה. לאחר מכן, שאב את התמיסה החוץ-תאית המחומצנת מהבארות, תוך הקפדה שלא לפגוע בחיתוכי המוח.
בשלב הבא, טפטפו 750 µL של תמיסת טעינה של אינדיקטור הסידן D ישירות לכל באר; פרוסות המוח צריכות להיות מכוסות בתמיסה המכילה rore am. לאחר מכן, דגרו את הפרוסות באינקובטור לתרביות תאים עם חמצן ופחמן דו-חמצני למשך 45 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C.
בסיום הדגירה, החלף את תמיסת הטעינה של אינדיקטור הסידן DI בתמיסה חוץ-תאית רעננה ומחומצנת כדי למנוע טעינת יתר של התאים. כדי לנטר את השינויים באות הפלואורסצנטי המושרים על ידי הגירוי, העבר את אחת מפרוסות המוח שנטענו ב-fure red לתא הקלטה ומקם אותה כרצונך. לאחר התקנת התא על מערכת המיקרוסקופ הקונפוקאלי, בצע פרפוזיה לפרוסה למשך 10 דקות עם תמיסה חוץ-תאית מחומצנת כדי להסיר עודפים של צבע אינדיקטור הסידן החוץ-תאי.
לאחר היציאה מתא ההקלטה, נאסף ה-PERFUSE eight לבקבוק ואקום. לאחר מכן, יש לבחון את הפרוסה דרך המיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. יש לרשום את כיוון הפרוסה ולאתר את אזור העניין בפרוסה, ובמקרה שלנו – את האזור ההיפותלמי במוח.
לאחר מכן, עברו להגדלה גבוהה. אתרו את התא הרצוי בתוך הפרוסה על ידי איסוף תמונות GFP ובדיקה סימולטנית של עוצמת הפלואורסצנציה של אות ה-URA האדום. כווננו את הספק הלייזר לערך המאפשר מדידות בשינוי עוצמת הפלואורסצנציה של ה-URA האדום, ומונע הלבנה (bleaching) של שני הפלואורופורים.
בשלב הבא, התחילו ברכישת תמונות בקצבים שבין 0.5 ל-2 hertz כדי לאסוף את אותות ה-fure וה-GFP. איור זה מציג תמונת קונפוקלי של נוירוני GN, RHR Tau GFP בתוך פרוסת מוח קורונלית. זהו אות הפלואורסצנציה אחיד יחסית שנצפה לאחר טעינת פרוסת המוח ב-fure am, וזוהי התמונה הממוזגת המציגה את הנוירונים שנטענו בצבע המחוון לסידן.
להלן דוגמאות לתגובות סידן המושרה על ידי גירוי סומטי מנוירונים בודדים המסומנים ב-GFP באזורי מוח היפותלמיים שונים. ניתן להשוות בין אותות הסידן המובחנים בין נוירונים המבטאים GN RHR בגרעינים היפותלמיים שונים באמצעות השטח תחת העקומה כהערכה לשינוי הכולל בריכוז הסידן בתא נתון במהלך אותה תקופה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מ-90 דקות, כולל הכנת צבע אינדיקטור הסידן, הטעינה והדגירה של הפרוסות, במידה והיא מבוצעת כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לניטור תגובות סידן בנוירונים המסומנים ב-GFP בתוך פרוסות מוח, תוך שימוש בצבע אינדיקטור פלואורסצנטי אדום לסידן. גישה זו מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של אותות סידן בתגובה לגירויים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- סיגנלינג של סידן הוא קריטי לתפקוד נוירונלי.
- נוירונים המסומנים ב-GFP מאפשרים ויזואליזציה ספציפית ברקמת המוח.
- צבעים פלואורסצנטיים אדומים מהווים חלופה לאינדיקטורים ירוקים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של דינמיקת סידן.
מטרת המחקר
- לניטור תגובות סידן בנורונים המושרות על ידי גירוי.
- להשתמש בצבע אינדיקטור לסידן עם פלואורסצנציה שאינה ירוקה כדי להשיג ניגודיות טובה יותר.
- לשפר את ניתוח הדימוי הרב-צבעי של אותות סידן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאת רקמת מוח מעכברים טרנסגניים המבטאים GFP.
- הכנת פרוסות מוח באמצעות מיקרוטום.
- החלת תמיסת טעינה של צבע סמן סידן על הפרוסות.
- הקלטת חותמי זמן של תאים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
תוצאות עיקריות
- ספיגה מוצלחת של צבע אינדיקטור לסידן על ידי תאי מוח.
- הדמיה של תגובות סידן בנוירונים המסומנים ב-GFP.
- שימוש יעיל בניתוח הדמיית סידן רב-צבעית.
- הדגמה של דינמיקה מרחבית וזמנית של איתות סידן.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מהימנה לחקר סיגנל הסידן בנוירונים.
- צבעים פלואורסצנטיים אדומים יכולים לשפר את יכולות ההדמיה.
- ניתן להחיל את הפרוטוקול על מחקרים שונים העוסקים בפעילות נוירונלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות כמותי של תגובות סידן בנוירונים היפותלמיים המוגדרים גנטית מאפשר חקירה מדויקת של מסלולי איתות נוירוהורמונליים ברמת התא הבודד. גישה זו נותנת מענה לאתגר של בידוד פעילות המושרה על ידי גירוי באוכלוסיות נוירונליות ספציפיות, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS). התאימות של השיטה לניתוח רב-צבעי מספקת נתונים חסונים וניתנים לשחזור לצורך תעדוף תיקים מחקריים ומחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של זרם סידן המושרה על ידי גירוי בנוירונים שזוהו גנטית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות נוירוהורמונליות בתוך מעגלים היפותלמיים מורכבים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד תגובות ספציפיות לסוג התא.
- מספק פלטים כמותיים לבחירת מטרות מונחית-היפותזה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקיים מערכות מאומתות של פרוסות מוח לסריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מספק תוצאות מדידה כמותיות הדירות של דימות סידן לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר ניתוח רב-צבעוני, התומך באסטרטגיות סריקה מרובות-מטרות (multiplexed).
- משפר את יכולת ההרחבה של הבדיקה ואת שימוש הפלטפורמה חוזרת עבור תתי-סוגים של נוירונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מדדים תפקודיים למסלולים היפותלמיים הרלוונטיים למחלה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מספק נתונים מותאמי סיכון לצורך קבלת החלטות על קידום בתוכניות לנוירואנדוקרין.
- מאפשר ניתוח השוואתי בין אוכלוסיות נוירונליות לצורך פיתוח סממנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
תהליך עבודה זה של דימות משלב שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך זיהוי מועמדים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני בצינורות מחקר של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים בתוך נוירונים המוגדרים גנטית.
- סריקה: מספק פלטי דימות סידן כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדדי שטח תחת העקומה ותגובה זמנית להשוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה של פלטי תפקוד למעגלים נוירונליים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת דימות ניתנת לשימוש חוזר שניתן להתאימה למודלים מגוונים של נוירונים ורקמות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מסטנדרט את פרוטוקולי הדימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין פרויקטים.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך ביצוע (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון בפורטפוליו של נוירוביולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות גילוי עבור CNS.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות קונפוקאלי ובמודלים של עכברים שעברו שינוי גנטי.
- מחייב גישה לתשתיות מתקדמות של מיקרוסקופיה ואנליזת פלואורסצנציה.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של טעינת צבעים ופרמטרי דימות.
- ניתן להתאמה לאוכלוסיות נוירונליות וסוגי רקמות אחרים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בזמינותם ובביצועיהם של צבעי אינדיקטור לסידן בעלי הסטה לאדום.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:52
Solution Preparation and Brain Dissection
3:21
Coronal Hypothalamic Sections Slicing
4:30
Preparation of the Ca2+ Indicator Dye Loading Solution
6:35
Microscopy and Analysis
7:59
Results: Ca2+ Signals in TGFP Neurons of Mouse Hypothalamic Brain Slices
8:52
Conclusion
