Name: תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למד מעקב אחר תגובות סידן בנוירונים מסומני GFP בפרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס באמצעות צבע סידן פלואורסצנטי אדום ומיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של אותות סידן בתגובה לגירויים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברינו שהשתתפו ביצירתו סכמו כאן. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה (SFB 894), &quot;הניתוח אינטגרטיבי של olfaction &#39;DFG Schwerpunktprogramm 1392 ועל ידי פולקסווגן הקרן (TLZ). TLZ הוא פרופ &#39;ליכטנברג של פולקסווגן הקרן.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
	 <a target="_blank" href="
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שאלה מרכזית בחקר המוח היא להבין כיצד המוח מעבד מידע חברתי. מקור עיקרי של מידע נחוץ להכרה חברתית מקודד על ידי אותות ריח או מושכים. זיהוי של אותות אלה על ידי אוכלוסיות עצביות באף ומההכרה של האותות במוח, בעיקר ההיפותלמוס, לשחק תפקיד מפתח בתהליכים חברתיים רבים והורמוני השפעה וגורמים אחרים נוירואנדוקריניים 13-16. מכשול מהותי מניתוח תגובות עצביות באזורים במוח כמו ההיפותלמוס המכיל גרעינים רבים תכליתיים עם נוירונים מרובים הוא זיהוי של תאי עצב ספציפיים של עניין. <p class="jo...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> חתול. N ° </td></tr><tr><td> אגר </td><td> סיגמא </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> סיגמא </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> sulfoxide דימתיל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> רטט-Blade Microtome השפן V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> קירור ההתקנים CU 65 לMicrotome שפן V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 חממה, CB210-UL </td><td> כורך </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> סופר דבק, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> מריות כפולות, צורת כפית </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> מריות Microspoon, צורת כפית </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> מספרי האביב, מוריה-Vannas-וולף - להבי 7mm </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> מספרי האביב, Vannas - להבי 3mm </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> מספריים וגנר </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> רפואי מלקחיים, 7b דומון </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> הלשכה גדולה מלבנית פתוחה אמבטיה (RC-27) </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> זיו BioRad מיקרוסקופ confocal 2100 </td><td> Zeiss </td><td> נה </td></tr></tbody></table>

תגובות סידן הדמיה בנוירונים gfp-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

למרות גידול עצום בידע שלנו על את המנגנונים בבסיס הקידוד של מידע במוח, שאלה מרכזית בנוגע לצעדים המולקולריים המדויקים, כמו גם את פעילותם של תאי עצב ספציפי בגרעינים רבים תפקודיים של אזורי מוח כגון ההיפותלמוס יישאר. בעיה זו כוללת זיהוי של המרכיבים המולקולריים המעורבים בוויסות של מפלי העברת אותות neurohormone שונים. גבהים של Ca 2 + התאי לשחק תפקיד חשוב בויסות הרגישות של תאי עצב, היא ברמה של העברת אותות ובאתרים סינפטיים. כלים חדשים צמחו כדי לסייע בזיהוי נוירונים במספר העצום של תאי עצב במוח בהבעת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של ​​אמרגן מסוים. כדי לפקח גם מרחב ובזמן גירוי-Induced Ca 2 + תשובות בGFP בתיוג נוירונים, שאינו ירוק זרחני Ca 2 + מחוון הצבע needs לשמש. בנוסף, מיקרוסקופיה confocal היא שיטה מועדפת של נוירונים בודדים בפרוסות הדמית רקמות בשל היכולת לדמיין נוירונים במטוסים שונים של עומק בתוך הרקמה ולהגביל פלואורסצנטי מחוץ לפוקוס. Ca 2 + ratiometric המחוון Fura-2 כבר בשימוש בשילוב עם ה-GFP מתויג-1 תאי עצב. עם זאת, הצבע הוא נרגש על ידי אור אולטרה סגול (UV). העלות של הליזר ואת עומק החדירה האופטי המוגבל של אור UV הפריעה את השימוש בו במעבדות רבות. יתר על כן, GFP פלואורסצנטי עלול להפריע Fura-2 האותות 2. לכן, החלטנו להשתמש בניאון אדום Ca 2 + צבע מחוון. השינוי הענק של הסטרוקס Fura אדום מאפשר ניתוח ססגוני של הקרינה האדומה בשילוב עם ה-GFP באמצעות אורך גל עירור יחיד. בעבר היו לנו תוצאות טובות באמצעות Fura אדום בשילוב עם ה-GFP-tagged נוירונים ריח 3. הפרוטוקולים לפרוסות רקמת הרחה נראים עובדים דוארqually גם בנוירונים ההיפותלמוס 4. Fura האדום מבוסס Ca 2 + הדמיה הייתה גם שלב בהצלחה עם β-תאי ה-GFP-tagged לבלב ואת הקולטנים של GFP מתויג-מתבטאים בתאי HEK 5,6. גחמה קטנה של Fura האדום היא שעוצמת הקרינה שלה ב 650 ננומטר מקטינה פעם המחוון נקשר סידן 7. לכן, הקרינה של נוירונים מנוחה עם Ca נמוך + 2 יש ריכוז עצמה גבוהה יחסית. יש לציין, כי אחרים האדומים Ca 2 +-צבעי חיווי קיימים או כרגע בשלבי פיתוח, שעשוי לתת תוצאות טובות יותר או שיפור בנוירונים שונים ואזורים במוח.

בפרוטוקול זה, אנו מעדכנים את ההתקדמות האחרונה בתחום ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות של נוירונים GFP-tagged בפרוסות רקמת המוח באמצעות ניאון אדום Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; מחוון צבע.

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

למרות העלייה האדירה בידע שלנו לגבי המנגנונים העומדים בבסיס קידוד המידע במוח, שאלה מרכזית הנוגעת ל...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר תגובות סידן המושרות על ידי גירוי, הן בנוירונים המסומנים ב-GFP, באופן מרחבי, והן באופן זמני בחתכי מוח באמצעות צבע אינדיקטור לסידן פלואורסצנטי שאינו ירוק. הדבר משיג תחילה על ידי הוצאת המוח של עכבר טרנסגני המבטא GFP בתאים ספציפיים. השלב השני הוא הכנת חתכי רקמה באמצעות מיקרוטום.בשלב הבא, מעבירים בעזרת פיפט את תמיסת טעינת צבע האינדיקטור לסידן על גבי הפרוסות כדי לאפשר לספיגת הצבע על ידי תאי המוח. השלב הסופי הוא ביצוע הקלטת חותמת זמן (timestamp) של תאים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, תגובות סידן בנוירונים המסומנים ב-GFP מוצגות באמצעות ניתוח דימות סידן רב-צבעי.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות של מיקרוסקופיה קונפוקלית הוא היכולת להדגים סידן בנוירונים המבטאים GFP פלואורסצנטי ירוק תוך שימוש בצבע אינדיקטור סידן פלואורסצנטי עם הסטה לאדום. הסטת ספקטרום הפליטה הגדולה של הצבע האדום מאפשרת לנו לבצע ניתוח רב-צבעוני של הפלואורסצנציה האדומה בשילוב עם ה-GFP הירוק תוך שימוש באורכי גל עירור בודדים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר נתקלנו בבעיה של ניטור אותות סידן בנוירונים שניתן היה לזהות רק באמצעות תג פלואורסצנטי גנטי, שהיה החלבון הפלואורסצנטי הירוק.כעת אני הדגים מספר שלבים קריטיים בפרוצדורה זו. התחילו את הפרוצדורה על ידי מזיגת תמיסת האגר החמה לתוך צלחת פטרי מרובעת לגובה של 1 cm; לאחר קירור והתקשות, חתכו את ג'ל ה-4%agar לקוביות של 1 cm³ והניחו אותן בבקבוק לאחסון. לאחר עריפת העכבר, חתכו את הקרקפת באמצעות להב תער חד-צדדי בכיוון סגיטלי מרכזי, מהעצם המצחית ועד לבליטה הת后 occipital החיצונית.לאחר מכן, פתח עוד יותר את קרובית הראש החתוכה תחילה בכיוון הרוסטרלי-לטרלי (קדמי-צדי). לאחר מכן, פתח אותה בכיוון הוונטרלי (בטני). לבסוף, בצע שני חתכים לטרליים (צדיים) וחתך רוסטרלי (קדמי) אחד.באזור ה-foramen magnum, השתמש במספרי קפיץ קטנים כדי להסיר בזהירות את הגולגולת. בשלב זה, עצם העורף (occipital), העצמות הבין-קודקודיות (inter parietal) ועצמות הקודקוד (parietal) צריכות להיות מופרדות. אם ה-dura mater עדיין קיימת, הסר אותה בזהירות בעזרת פינצטה כדי למנוע נזק למוח.בשלב הבא, הסר את עצם הקשקש (squamal bone), את הפתח האתמואידי הקדמי ואת הפורמן הפרונטלי. כעת ניתן להוציא את המוח בקלות באמצעות שפכטל מיקרו-כף הפוך ולנתק את העצבים הגולגולתיים. יש להניח את המוח על משטח עמיד לחיתוך כאשר הצד הוונטרלי שלו פונה כלפי מטה.השתמשו בלהב תער בעל קצה יחיד כדי להסיר את המוחון. משטח חיתוך ישר זה ישמש כבסיס להצמדת המוח ללוח, כדי לאפשר חיתוך של נתחים קורונליים של המוח. לאחר מכן, הדביקו את המוח, כאשר משטח החיתוך פונה כלפי מטה, ללוח הבסיס של המיקרוטום באמצעות כמות קטנה של דבק סיאנואקרילט ("סופר גלו") בעל ביצועים גבוהים וזמן ייבוש מהיר.לאחר מכן, הדביקו קוביית ג'ל אגר של סנטימטר מעוקב אחד לצדו הגבתי (ventral) של המוח על לוח הבסיס של המיקרוטום, כדי לתמוך במוח ולקבע אותו במהלך החיתוך. לאחר שהדבק התייבש, הכניסו את הלוח לאמבט המיקרוטום המכיל תמיסה חוץ-תאית מחומצנת בטמפרטורה של 6 °C. לאחר מכן, חתכו את המוח לפרוסות בעובי של 300 מיקרון במהירות חיתוך נמוכה; אספו את פרוסות המוח בחתך קורונלי עד לסיום חיתוך המוח כולו.כעת הכינו תמיסת onic F1 27 בריכוז 20% ב-DMSO על ידי הוספת תמיסת DMSO לאבקת onic F1 27. לאחר מכן, המיסו את החומר באמצעות סוניקציה ישירה של התמיסה למשך שתי דקות. לאחר מכן, הוסיפו חמישה µL של תמיסת onic F1 27 בריכוז 20% למבחנה המכילה 50 µg של furred am חודר תאים.ערבבו את התמיסה באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת 45 µL של תמיסה חוץ-תאית וערבבו במכשיר וורטקס. בקצרה, הוסיפו 325 µL נוספים של תמיסה חוץ-תאית וחשפו את המבחנה לאולטרסאונד (sonicate) למשך שלוש דקות נוספות.לאחר הסוניקציה, הוסף 1.156 milliliters של תמיסה חוץ-תאית מחומצנת כדי לקבל את תמיסת הטעינה הסופית של אינדיקטור הסידן D. העבר את חיתוכי המוח הקורונליים לפלטת תרבית תאים של שש בארות המלאה בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת, עד שישה חיתוכים לבארה. לאחר מכן, שאב את התמיסה החוץ-תאית המחומצנת מהבארות, תוך הקפדה שלא לפגוע בחיתוכי המוח.בשלב הבא, טפטפו 750 µL של תמיסת טעינה של אינדיקטור הסידן D ישירות לכל באר; פרוסות המוח צריכות להיות מכוסות בתמיסה המכילה rore am. לאחר מכן, דגרו את הפרוסות באינקובטור לתרביות תאים עם חמצן ופחמן דו-חמצני למשך 45 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C.בסיום הדגירה, החלף את תמיסת הטעינה של אינדיקטור הסידן DI בתמיסה חוץ-תאית רעננה ומחומצנת כדי למנוע טעינת יתר של התאים. כדי לנטר את השינויים באות הפלואורסצנטי המושרים על ידי הגירוי, העבר את אחת מפרוסות המוח שנטענו ב-fure red לתא הקלטה ומקם אותה כרצונך. לאחר התקנת התא על מערכת המיקרוסקופ הקונפוקאלי, בצע פרפוזיה לפרוסה למשך 10 דקות עם תמיסה חוץ-תאית מחומצנת כדי להסיר עודפים של צבע אינדיקטור הסידן החוץ-תאי.לאחר היציאה מתא ההקלטה, נאסף ה-PERFUSE eight לבקבוק ואקום. לאחר מכן, יש לבחון את הפרוסה דרך המיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. יש לרשום את כיוון הפרוסה ולאתר את אזור העניין בפרוסה, ובמקרה שלנו – את האזור ההיפותלמי במוח.לאחר מכן, עברו להגדלה גבוהה. אתרו את התא הרצוי בתוך הפרוסה על ידי איסוף תמונות GFP ובדיקה סימולטנית של עוצמת הפלואורסצנציה של אות ה-URA האדום. כווננו את הספק הלייזר לערך המאפשר מדידות בשינוי עוצמת הפלואורסצנציה של ה-URA האדום, ומונע הלבנה (bleaching) של שני הפלואורופורים.בשלב הבא, התחילו ברכישת תמונות בקצבים שבין 0.5 ל-2 hertz כדי לאסוף את אותות ה-fure וה-GFP. איור זה מציג תמונת קונפוקלי של נוירוני GN, RHR Tau GFP בתוך פרוסת מוח קורונלית. זהו אות הפלואורסצנציה אחיד יחסית שנצפה לאחר טעינת פרוסת המוח ב-fure am, וזוהי התמונה הממוזגת המציגה את הנוירונים שנטענו בצבע המחוון לסידן.להלן דוגמאות לתגובות סידן המושרה על ידי גירוי סומטי מנוירונים בודדים המסומנים ב-GFP באזורי מוח היפותלמיים שונים. ניתן להשוות בין אותות הסידן המובחנים בין נוירונים המבטאים GN RHR בגרעינים היפותלמיים שונים באמצעות השטח תחת העקומה כהערכה לשינוי הכולל בריכוז הסידן בתא נתון במהלך אותה תקופה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מ-90 דקות, כולל הכנת צבע אינדיקטור הסידן, הטעינה והדגירה של הפרוסות, במידה והיא מבוצעת כראוי.

imaging-calcium-responses-gfp-tagged-neurons-hypothalamic-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

האיבר הוומרו-נזלי (VNO) מזהה אותות כימיים בתוך-מיניים המעבירים מידע חברתי ורבייתי. ביצענו ניסויי דימוי Ca2+ באמצעות עכברים טרנסגניים המבטאים G-CaMP2 ברקמת ה-VNO. גישה זו מאפשרת לנו לנתח את דפוסי התגובה המורכבים של נוירוני הוומרו-נזל למספר רב של גירויי פרומונים.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

מקור: } בנקרופט, א.א., . כימות Ca ספונטני2+{{}} שטפים והשפעותיהם במורד הזרם בתאי עצב ראשוניים במוח התיכון של עכבר. J. Vis. exp. (2020){{}}{{TAG_ 46}}סרטון זה מדגים את ההדמיה בזמן אמת של זרימת סידן בתאי עצב גחוניים במוח התיכון שמקורם בעוברי עכברים. באמצעות וקטור ויראלי כדי לבטא אינדיקטור סידן, הנוירונים מצולמים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לעקוב אחר שינויים בעוצמת הקרינה במהלך פעילות סידן ספונטנית ומושרה על ידי נוירוטרנסמיטרים.

הדמיה של זרם סידן בנוירונים במוח התיכון הגחוני שמקורם בעוברי עכברים

אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת פעילות. עצבית מבעד לחלונות אופטי כפול מעל הדו-צדדיים העיקרי המגע corticies (S1) ב- Thy1-GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות 2-פוטון (2p) מיקרוסקופיה ויוו.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיית סידן in vivo למדידת התגובות של הרכבים של נוירונים מותניים-6 DRG לגירויים סומטיים וקרביים. ניתן לבצע השוואות יסודיות בין נוירונים המגיבים לגירויים שונים. פרוטוקול זה הוא בעל ערך לחקירת מנגנונים של כאב קרביים וגירוי סומטי, כגון דיקור סיני.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובת נוירוני גרעיני השורש הגבי לגירויים סומטיים וקרביים

הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס מבצעת תפקידים חיוניים ומובחנים בלמידה ובזיכרון. פרוטוקול זה מתאר סדרה של הליכים חזקים ויעילים להדמיית סידן in vivo של תאי גרגירים בבליטה המשוננת בעכברים הנעים בחופשיות.

In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים 

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

למד מעקב אחר תגובות סידן בנוירונים מסומני GFP בפרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס באמצעות צבע סידן פלואורסצנטי אדום ומיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של אותות סידן בתגובה לגירויים.

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

גלה סרטונים נוספים