Name: בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאי גידול מחוללים בדם של חולי סרטן באמצעות מיקרו-צינורות פונקציונליים עם E-selectin ונוגדנים. השיטה שומרת על חיות התאים ומאפשרת פיתוח טיפולים אישיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה המתוארת נתמך על ידי מרכז קורנל על Microenvironment &amp; גרורה דרך מספר פרס U54CA143876 מן המוסד הלאומי לסרטן. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או מכוני הבריאות הלאומיים. עבודה זו מומנה בנוסף ידי הקרן הלאומית למדע מלגת מחקר לתואר שני (ADH) בחלקו.

פרוטוקול הבאה היא לייצור מכשיר microtube אחת. 1. הכנת פתרון Nanotube Halloysite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate (10-13 וואט (RMS)) 250 halloysite μL Nanotube פתרון (6.6% WT במים) 30 שניות. פתרון מגניב עם מים קרים sonication חוזרת פעם אחת. מצננים שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר פתרון sonicated לתוך מזרק, חבר 0.45 מזרק מסנן מיקרומטר, והפתרון המסנן לתוך צינור microfuge נקי. הפתרון וורטקס מדי פעם כדי לשמור על אחידות. </li></ol> 2. ציפוי של משטח Microtube פנימית עם צינורות halloysite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל 50 ס&quot;מ בחלק הארוך של microtubing מיקרו Renathane (300 מיקרומטר קוטר פנימי, 35.3 נפח פנימי μL). חותכים קצה אחד של microtube ב באלכסון ולהכניס לתוך חתיכת IDEX מתאם קטן. הכנס את המחט של המזרק 29G 3/10 סמ&quot;ק אל הקצה השני של microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את microtube, מקם את הקצה הפתוח של microtube (סוףעם מתאם) אתנול 70% ולצייר ~ 50 אתנול μL לתוך המזרק למלא microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את אתנול מתוך microtube על ידי ציור נפח נדיב של מים מזוקקים לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את המזרק מ microtube, לרוקן את המזרק, ואז לצרף את microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה של 0.02% w / v פולי-L ליזין במים. צייר 50 μL אל microtube ולאפשר לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 100 Nanotube μL פתרון הסתנן אל microtube ולאפשר כדי לדגור על 3 דק &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 100 מים μL דרך microtube לשטוף את הפתרון Nanotube. אפשר microtube מצופה לשבת, מלא מים, למשך הלילה בבית RT. </li></ol> 3. הכנת Microtubes על בידוד תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​חלבון G ב פוספט 1X של Dulbecco בופר סליין (PBS, pH 7.0-7.2). צייר 50 PBS μL דרך microtube ואז לצייר 50 μL שלהפתרון חלבון G ולאפשר כדי לדגור על 1.5 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה המכילה 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​E-selectin-IgG ו - 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​נוגדנים (אנטי EpCAM עבור דגימות סרטן רוב, אנטי PSMA עבור דגימות סרטן הערמונית) ב PBS. צייר 50 μL של selectin-E פתרון נוגדנים לתוך microtube ולאפשר כדי לדגור על משאבי אנוש 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידבקות הסלולר ספציפי חסום עם חלבון חלב 5%. הכן את הפתרון של 5% (w / v) חלבון חלב PBS. צייר 50 הפתרון μL חלבון החלב לתוך microtube ולאפשר כדי לדגור על שעות 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 50 PBS μL לתוך הצינור ולהשאיר על RT עד דם או באפי דגימות המעיל מוכנים לעיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני השימוש microtube לבידוד, צייר 50 PBS μL כי כבר רווי Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) כדי להפעיל את מולקולות selectin. </li></ol> 4. הכנת דגימות לבידוד בתא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר או להשיג 10 מ&quot;ל דם מחולה לתוך heparinizedצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 10 מ&quot;ל Ficoll-Paque פתרון לימפוציטים הבידוד לתוך צינור 50 צנטריפוגות מ&quot;ל. בעדינות 10 מ&quot;ל שכבת הדם כולו על גבי Ficoll כדי לא לערבב את הדם Ficoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 2000x גרם במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם האטה מינימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את שכבת מעיל באפי ומכניסים צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף באפי מעיל עם PBS (צנטריפוגות ב 230x גרם דקות 10, לבטל את supernatant). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend תאים עם חיץ 1 תמוגה RBC מ&quot;ל ו דגירה של 10 דקות על RT כדי lyse אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל PBS, מערבבים בעדינות, צנטריפוגות ב 230x גרם ל 10 דקות. מחק supernatant בעדינות resuspend גלולה ב 3-4 מ&quot;ל PBS +. </li></ol> 5. תא בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף קצה אחד של microtube פונקציונליות כדי מזרק 5 מ&quot;ל באמצעות מתאמי IDEX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הקצה הפתוח של microtube פונקציונליות לתוך התא suspension. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך ההשעיה התא דרך microtube ב 1-4 מ&quot;ל / h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הקצה הפתוח של microtube כדי צינור המכיל PBS + ולצייר 300 μL + PBS לתוך המזרק על 0.016 מ&quot;ל / דקה להסיר מאוגד ותאי המרופט מ microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקצה הפתוח של microtube לתוך צינור נקי. נתק את המזרק מ microtube ולצרף מזרק עם Accutase. בעדינות perfuse Accutase מספיק לתוך microtube למלא (~ 50 μL) ולאפשר כדי לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק עם 1 מ&quot;ל של התקשורת הצמיחה (79% RPMI, FBS 20%, 1% סטרפטומיצין פניצילין) ו perfuse אל microtube, איסוף שפכים לתוך התרבות רקמת יחס טוב צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתנאים humidified. </li></ol> 6. נציג תוצאות מטרת טכניקה זו היא לבודד את התאים הסרטניים קיימא מדם של חולי סרטן. קיימים מספר שיטות לזיהוי תאים סרטניים בתרבית, אימות הכרחי להצלחת המכשיר. בחרנו כתם התאים בתרבית עם נוגדנים נגד moieties אפיתל כמו EpCAM (הידבקות אפיתל מולקולה תאית) או PSMA (אנטיגן ספציפי לערמונית קרום), בנוסף DAPI לזהות גרעיני תאים שלמים (איור 2 ו 3). מספר תאים סרטניים שנתפסו באמצעות טכניקה זו היא בהכרח פונקציה של מספר CTCs במדגם ההתחלה וכי השונות המטופל יכול להיות גבוה. בעיבוד דגימות שנלקחו מהחולים שאובחנו עם סרטן בשלב IV, אנחנו באופן שגרתי ללכוד בין 100 ל 500 תאים סרטניים בכל צינור של דם, על purities&gt; 50%. מיד לאחר הבידוד, מספר גדול יותר של כדוריות דם לבנות מזהמים יכולים להיות נוכחים. עם זאת המספרים הללו ייגמרו הדגירה הבאה במדיום התרבות של עד 5 ימים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; באיור 1. סכמטי של microtube פונקציונליות עבור בידוד CTC, מראה selectin בתיווך מתגלגל אחריו הידבקות נוגדנים בתיווך סטטי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> איור 2. נתונים מייצגים של בידוד CTC של דגימות דם נמשך מחולה סרטן השד חולת סרטן ריאות. מספר תאים קיימא המזוהים באופן חיובי כמו CTC מבוסס על מכתים EpCAM מיוצג על ידי מוטות מוצקים מתייחסים לתאם שמאל אחוז תאים שזוהו כמו CTC בהשוואה למספר הכולל של תאים שנכבשו מיוצג על ידי הברים פתוחים נמדד על לתאם הנכון. התוצאות לאחר חמישה ימים בתרבות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> באיור 3. נציג micrographs מתורמים שונים (A ו-B) של CTC בתרבות 5 יום ממועד isolatiעל פי מדגם החולה בסרטן הדם. התאים היו מוכתמות fluorescently עם AlexaFluor 488 (ירוק) ו 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עבור EpCAM לדמיין את הגרעין (כחול).

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
<li>Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+AD+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22">Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology</a>. , (2011).</li>
<li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li>
<li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells%3A+a+new+model+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li>
<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+Building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li>
<li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li>
<li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade%3A+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.</li>
<li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li>
</ol>

Mrk הוא היועץ המדעי של CellTraffix, Inc (רוצ&#39;סטר, ניו יורק).

זה שקורה לעתים קרובות כי השלבים המוקדמים של גילוי ותרופות לסרטן חדשים לנצל תאים סרטניים קווים, הנושאים דמיון בספק לתאי סרטן ראשוני עדיין להישאר להשתמש בשל קלות השימוש שלהם במעבדה. מחקר ופיתוח של טיפולים בסרטן חדשים יהיה לזרז אם העיקריים תאים סרטניים אנושיים נוצלו בתחילת המחקר רומן. CTC הם סוג ביותר ונגיש של תאים סרטניים, עקב נוכחותם בדם קלות בתיקו דם רגילה. בנוסף, בתאי הגידול במחזור מייצגים צעד הכרחי בתהליך של גרורות 5,6, ולכן הרלוונטיות שלהם המחלה השירות למיקוד תרופות חדשות הוא ברור. הבידוד של CTC מהדם במבחנה מסובך ידי ריכוזים נמוכים שלהם: בסדר גודל של 1 למיליון כדוריות דם לבנות או אחד למיליארד אריתרוציטים 7. רוב השיטות הקיימות לאיתור CTC בדם, כולל תא ה-FDA רק טכניקה<html> חיפוש (Veridex), נזק או להרוס תאים בתהליך איתור, לא ניתן להשתמש מעבר ספירה. השיטה המתוארת לעיל לא להתפשר כדאיות התא ובכך פותח את הדלת עבור מחקרים קליניים בעתיד על סרטן. כמו התאוששות של תאים שלמים היא המטרה של טכניקה זו, זוהי חובתו של תאים להיות מטופלים בזהירות, במיוחד במהלך השלבים הפרדה דם. ישנם מספר פרמטרים מתכונן במערכת זו, כי אפשר לשנות על מנת להשיג תשואה משופרת בהתאם מאפיינים קריטיים כגון סוג סרטן. בשלבים המתוארים לעיל, בחרנו להשתמש EpCAM כמו CTC נוגדנים ספציפיים עבור כל סוגי הסרטן, למעט בעת עיבוד דגימות סרטן הערמונית, שבה אנטי PSMA היה בשימוש. החלפות נוספים של סרטן ספציפיים נוגדנים בהחלט יכול לשמש כדי לשפר את הביצועים עבור חולים בודדים. יתר על כן, ריכוזים selectin ו הנוגדן ניתן לשנות על מנת לשפר ללכוד 8. &quot;&gt; התכונה המהותית של המכשיר הוא שילוב של E-selectin מולקולות על פני השטח. E-selectin בא לידי ביטוי בדרך כלל על פני השטח של תאים luminal אנדותל ותפקוד לגייס leukocytes זז מהר לאתרים של דלקת. Leukocytes זורמים לאגד זמני ל מולקולות selectin, וכתוצאה מכך התנהגות, איטי יותר מתגלגל המאפשר מחייב איטי יותר וחזק יותר של תא האנדותל את ידי integrins. ראיה נסיונית משכנע קיים שעושה את המקרה כי CTC יכול extravasate ידי מנגנון דומה 9,10. הכללת selectin גם מאפשר למכשיר להיות מופעל ברמות ספיקה גדולות יותר, שיעורי שאחרת למנוע מתאי מלהתחבר נוגדנים 11. כך המכשיר שלנו פיזיולוגית מחקה ורדיד biomimetically כדי ללכוד זרימת CTC ללא גרימת פציעה הסלולר. ביצועי המכשיר משופרת ניתן לייחס תוספת של ציפוי Nanotube halloysite אל פני השטח luminalשל המכשיר. מחקרים קודמים הראו כי ישנם שלושה מרכיבים עיקריים של ציפוי Nanotube המאפשר פונקציונליות משופרת. ראשית, ציפוי Nanotube מספק שטח פנים גדל, המאפשר בתצהיר חלבון גדולה יותר על פני 4. שנית, בביצוע במיקרוסקופ כוח אטומי על ציפוי Nanotube שקבענו צינורות בודדים בולטים מעל פני השטח אל תוך הזרם. זה מאפשר מולקולות selectin שיוצג ככל 1 מיקרון מעל פני השטח, כך ניתן ללכוד תאים וגייס אל פני השטח בתחילת המסלול שלהם דרך צינור 4. לבסוף, ציפוי Nanotube halloysite הוא מסוגל למנוע הידבקות ליקוציט ומתפשטת על פני השטח, המאפשר מספר מופחת של כדוריות דם לבנות שנתפסו יחד עם CTC, ולכן יותר purities הבאים CTC 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 300 מזהה אום צינורות </td><td> Braintree Scientific </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> צינורות גדול יותר עבור חיבור המזרק </td><td> IDEX לבריאות ומדע </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> מזרק 5 מ&quot;ל של משאבת </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> קטן בצינור גדול מחבר </td><td> IDEX לבריאות ומדע </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> מחבר צינורות גדול מזרק </td><td> IDEX לבריאות ומדע </td><td> F-120 ו-P-659 </td></tr><tr><td> מזרק על microtube (מזרק אינסולין 3/10cc U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque פלוס </td><td> GE Healthcare ביו למדעי AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC תמוגה חוצץ (Buffer EL, 1000mL) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> גרם חלבון, 5 מ&quot;ג </td><td> CalBiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> נוגדן אנושי EpCAM/TROP-1 </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA נוגדן (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96 צלחות גם Microtest (96) </td><td> BD פלקון </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> סופג חוסם כיתה ללא שומן חלב יבש, 300 גרם </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Halloysite צינורות </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> סידן קרבונט, 5G </td><td> אולדריץ כימיה </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc כימרה, 100 מיקרוגרם </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI בינוני 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> פולי-L ליזין 0.1% w / v במים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סוניק Dismembrator </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> דגם 100 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> אטלנטה ביוכימיקלים </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> סיגמא החיים Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

בתאי הגידול במחזור (CTC) הם תאים מן הגידול המפיצים העיקרי בכל מערכת הדם וזה יכול בסופו של דבר יוצרים גידולים משניים באתרים מרוחקים. CTC ספירת ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה בהתבסס על הקשר בין ריכוז CTC בדם חומרת המחלה 1. ככלי טיפולי, CTC יכול להיות למד במעבדה לפתח טיפולים מותאמים אישית. לשם כך, בידוד CTC גרם שום נזק לתאים, וזיהום על ידי סוגי תאים אחרים, במיוחד leukocytes, יש להימנע ככל האפשר 2. רבים טכניקות הנוכחי, לרבות מכשיר ה-FDA הבלעדי של ספירה CTC, להרוס CTC כחלק מתהליך הבידוד (למידע נוסף ראה Ref. 2). המכשיר microfluidic ללכוד CTC קיימא מתואר, המורכב משטח פונקציונליות עם גליקופרוטאין E-selectin בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל 3. כדי לשפר את ביצועי המכשירmance ציפוי nanoparticle יושמה בהיקף של צינוריות halloysite, nanoparticle aluminosilicate שנקטפו מן החומר 4. את ה-selectin מולקולות לספק אמצעי ללכוד CTC זז מהר, כי הם נשאבים באמצעות המכשיר, השאלת יתרון על פני מכשירים microfluidic חלופיות שבו תהליך העיבוד של יותר נחוצים כדי לספק תאים היעד עם מספיק זמן כדי אינטראקציה עם פני השטח. את הנוגדנים ליעדים אפיתל לספק CTC-הספציפיות למכשיר, כמו גם לספק פרמטר מתכוונן בקלות לכוון בידוד. לבסוף, ציפוי Nanotube halloysite מאפשר בידוד משופר באופן משמעותי לעומת טכניקות אחרות של עוזר ללכוד תאים זז מהר, מתן שטח מוגברת של חלבון ספיחה, ולהדוף leukocytes מזהמים 3,4. מכשיר זה מיוצר על ידי טכניקה פשוטה באמצעות ה-off-המדף חומרים, שימש בהצלחה ללכוד תאים סרטניים מהדם של גרורתיחולי סרטן. התאים שנתפסו יישמרו לתקופה של עד 15 ימים בתרבות בעקבות הבידוד, ודגימות אלו בדרך כלל מורכב&gt; תאים קיימא 50% סרטן ראשוני של כל מטופל. מכשיר זה נעשה שימוש כדי ללכוד CTC קיימא מהדם הן כל בדילול מלא דגימות באפי המעיל. בסופו של דבר, אנו מציגים טכניקה עם פונקציונליות בסביבה קלינית לפתח טיפולים בסרטן אישית.

בתאי הגידול במחזור מבודדים מהדם של חולי סרטן ללא גרימת נזק לתאים. בידוד של תאים סרטניים נעשה באמצעות משטח bimolecular של selectin-E בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל. ציפוי Nanotube במיוחד מקדם תאים סרטניים וכתוצאה מכך הידבקות purities ללכוד גבוהה.

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הם תאים המתפשטים מגידול ראשוני אל מערכת הדם ויכולים בסופו של דבר ליצור גרורות משניות...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי גידול חיוניים במחזור הדם מדגימות דם. התחילו בהכנת המיקרו-מבחנות לבידוד, ולאחר מכן בודדו את שכבת ה-buffy coat מדגימות הדם. בשלב הבא, העבירו את ה-buffy coat דרך מכשיר המיקרו-מבחנה הפונקציונלי.קצרו את התאים שנלכדו מהמיקרו-מבחנה ותחזקו את התרבית באמצעות מכשיר המדמה באופן פיזיולוגי סביבה ללכידה ביומימטית של CTCs זורמים ללא גרימת פגיעה תאית. טכניקה זו מציעה פונקציונליות במסגרת קלינית לפיתוח טיפולים מותאמים אישית לסרטן. היתרונות העיקריים הם שזוהי טכניקה פשוטה המשתמשת בחומרים נפוצים, והיא משחזרת את התהליך הטבעי של רקמה מוצקה המתרחש בכלי דם.אני מייק קינג, פרופסור חבר להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קורנל, ואת ההליך ידגים ג'ף מדיסון, טכנאי בכיר מהמעבדה שלי. הפרוטוקול הבא הוא להפקה של התקן מיקרו-צינור בודד: בצעו סוניקציה ל-250 µL של תמיסת Halo site nano tube בריכוז 6.6% למשך 30 שניות, קררו את התמיסה במים קרים.לאחר סוניקציה שנייה, שאבו את התמיסה למזרק. סננו את התמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.45 micron לתוך מבחנת מיקרו נקייה. ערבבו את תמיסת הננו-טיובים ב-vortex מדי פעם.כדי לשמור על הומוגניות, השג קטע באורך 50 סנטימטר של צינור מיקרו (micro tubing). חתוך את פתח הכניסה של צינור המיקרו באלכסון, והכנס קצה אחד של צינור המיקרו לתוך מתאם IDEXX קטן, והכנס מחט של מזרק אל הקצה השני של צינור המיקרו. כדי לנקות את צינור המיקרו, הנח את הקצה הפתוח של צינור המיקרו ב-70% ethanol ושאב כ-50 microliters של ethanol לתוך המזרק כדי למלא את צינור המיקרו ולשטוף ממנו את ה-ethanol.שאבו כמות נדיבה של מים מזוקקים למזרק. כעת נתקו את המזרק מהמיקרו-מבחנה, רוקנו את המזרק ולאחר מכן חברו אותו שוב למיקרו-מבחנה. שאבו 50 µL של 0.02 weight per volume.העבירו Polyol lysine לתוך המיקרו-צינור והדגירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאבו 100 µL של תמיסת ננו-צינורות מסוננת לתוך המיקרו-צינור והדגירו למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף את תמיסת הננו-צינורות, שאבו 100 µL של מים דרך המיקרו-צינור והדגירו למשך לילה בטמפרטורת החדר, שאבו 50 µL של PBS דרך המיקרו-צינור, ולאחריהם 50 µL של 10 µg/mL.יש להשרות את תמיסת ה-Protein G למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש להעביר למבחנה (micro tube) כמות של 50 µL של תמיסת נוגדן E selectin IgG בריכוז של 5 µg/mL, ותמיסת נוגדן בריכוז של 50 µg/mL. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולחסום היצמדות תאית לא ספציפית באמצעות 5% חלבון חלב.לאחר מכן, דגרו את ה-PBS בטמפרטורת החדר עד שהדגימות של הדם או שכבת התאים הלבנים (buffy coat) יהיו מוכנות לעיבוד, כ-10 דקות לפני השימוש במבחנה המיקרוסקופית לבידוד תאים. שאבו 50 µL של PBS רווי בסידן כדי להפעיל את מולקולות הסלקטין במבחנה עם הפרין.העבר 10 milliliter של תמיסת fol pack לשפופרת צנטריפוגה של 50 milliliter. הוסף בעדינות מעל לתמיסה את דגימת הדם השלם בנפח של 10 milliliter וצנטריפוג את השפופרת במהירות של 2000 times G למשך 15 דקות, בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius עם האטה מינימלית. לאחר מכן, העבר את שכבת ה-buffy coat לשפופרת חדשה.שטפו את שכבת ה-buffy coat ב-PBS וסובבו בצנטריפוגה כדי להשקיע את האריתרוציטים. השביו בעדינות את משקעי התאים ב-1 ml של RBC lysis buffer, והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 10 ml.ערבב בעדינות את ה-PBS והשקע את התאים על ידי סבוב בצנטריפוגה. השהה בעדינות את התאים ב-PBS פלוס באמצעות מתאמי IDEXX. חבר קצה אחד של המיקרו-מבחנה הפונקציונלית למזרק של 5 mL.הנח את המזרק על משאבת מזרקים והטבל את הקצה הפתוח של המיקרו-צינור הפונקציונלי לתוך תרחיף התאים. העבר את תרחיף התאים דרך המיקרו-צינור כדי להסיר תאים שאינם קשורים או קשורים באופן רפוי. העבר את הקצה הפתוח של המיקרו-צינור לתוך מבחנה המכילה PBS פלוס.שאבו 300 µL של PBS לתוך המזרק. לאחר מכן, הניחו את הקצה הפתוח של המיקרו-צינור בתוך מבחנה נקייה. נתקו את המזרק מהמיקרו-צינור וחברו מזרק המכיל acuate, ובצעו פרפוזיה עדינה של acuate כדי למלא את המיקרו-צינור.לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, חברו מזרק המכיל מיליליטר אחד של מצע גידול, בצעו פרפוזיה למסביב המיקרו-צינור ואספו את התוצר לרקמות מתאימות. העבירו את צלחות התרבית לגידול. תאי הגידול המסתננים בודדו מדגימות דם של חולה עם סרטן השד וחולה עם סרטן ריאה לאחר חמישה ימים.בתרבית. תכונותיהם של תכשירי אלה לאפ Capture של CTC אופיינו על בסיס צביעה למולקולה התאית האפיתלית epican, וכן חושבה טהרת לכידת הגרעין כאחוז התאים שזוהו כ-CTC בהשוואה למספר הכולל של התאים שנלכדו. תמונה זו מציגה מיקרוגרפים מייצגים של CTCs שבודדו מתורמים A ו-B. לאחר חמישה ימים בתרבית, התאים נצבעו פלואורסצנטית עבור EPAM עם Alexa Fluor 4 88.הגרעינים הודגמו באמצעות צביעת DPI. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש ב-CTCs חיוניים ובתרבית כדי להפיק מידע ספציפי לחולה, כגון רגישות לתרופות או ביטוי של סמני תאים. תודה לצפייה ובהצלחה.

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גידול במחזור הדם מכל דגימת הדם של מודל עכבר גידול מעי גס שעבר המתת חסד. ניתן לתרבית CTCs מבודדים אלה ולהשתמש בהם לניתוח מיועד במורד הזרם.

בידוד CTC מדגימת דם שלמה: שיטה להשגת CTCs ממודל סרטן המעי הגס מורין

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הוכחו כממלאים תפקיד חשוב בגרורות גידול. כאן, מתוארת שיטה לבידוד והתפשטות של CTCs מהדם המלא של מודל גידול עכבר סינגני של גרורות קרצינומה של הכבד (HCC).

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

פרוטוקול לנצל פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) מצופה Microfilter עבור יעיל ללכוד ולשחרר thermoresponsive של תאים סרטניים קיימא במחזור (CTC) מוצג. שיטה זו מאפשרת ללכוד של CTC מ 'דם בחולים ושחרורו של CTC קיימא עבור במורד הזרם מחוץ שבב תרבות, מנתח ואפיון.

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

מאמר זה מתאר את היישום של ציוד אוטומטי כדי להפריד ולאסוף בקלות וביעילות, כגון DNA ללא תאים ותאי גידול במחזור, מדם שלם.

הפרדה ואיסוף אוטומטיים של חומרים הקשורים לסרטן מדגימות קליניות

השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.

פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

למדו שיטה לבידוד תאי גידול מחוללים בדם של חולי סרטן באמצעות מיקרו-צינורות פונקציונליים עם E-selectin ונוגדנים. השיטה שומרת על חיות התאים ומאפשרת פיתוח טיפולים אישיים.

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

גלה סרטונים נוספים