Name: שלפוחיות עור Autoantibody-Induced granulocyte תלויים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: חקור את שיטת ההעברה הפסיבית של נוגדנים ספציפיים לקולגן VII בעכברים ליצירת דגם מחלת EBA. שיטה זו מאפשרת ניתוח היסטופתולוגי של שלפוחיות עור ומנגנוני מחלות אוטואימוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

החוקרים מכירים בתמיכה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה SI-1281/4-1 וBIOSS מהפקולטה לרפואה באוניברסיטת פרייבורג (לCS).

1. הכנת הנוגדנים פתוגניים הערה: טיהור וריכוז של הנוגדנים צריכות להתבצע באותו היום, כפי שנוגדנים אינם להיות מאוחסנים ב0.1 מ &#39;גליצין pH 2.5-3 (חיץ elution) במשך הלילה (ON). טיהור זיקה של IgG: 25 מ&quot;ל של שימוש בסרום ארנבת חיסוני: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר סרום הארנב על ב 4 ° C, לערבב אותו עם 01:01 1xPBS (ריצת חיץ) וחובצה את זה ב1260 XG למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לחלופין, צעד סינון עם מסנן נייר יכול להיכלל לאחר צנטריפוגה במקרה הסרום הוא שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לשטוף את חלבון G מטריצה ​​מלאת עמודה עם 10 כרכי מיטה (נפח המיטה = נפח מטריצה) של 1XPBS (ריצת חיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מדוללים ומסונן סרום לעמודה ודגירה 1 שעה על הפלטפורמה מתנדנדת בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הזרימה באמצעות (FT) בצינור 50 מיליליטר Flacon. אל תמחק אותו עד הריכוזוכייל של המטוהרים IgG ידוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מטריצה ​​עם 5 כרכי מיטה של ​​1XPBS ובינתיים להכין 50 צינורות מ&quot;ל פלקון לאיסוף שבריר IgG eluted. חיץ פיפטה 1 מיליליטר חומציות נטרול: 1 ז TRIS pH 10 בכל צינור (שיעור של חיץ 1:20 TRIS יחסית לכמות eluate שתיגבה בדרך אחרת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חיץ 100-150 מ&quot;ל elution: 0.1 מ &#39;גליצין pH 2.5-3 לעמודה ולאסוף חלק 50 מ&quot;ל (הים). הפוך את צינור 2-3x, למדוד את רמת החומציות ולהוסיף חיץ נטרול עד שהגעת לרמת החומציות 7.2-7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כמה טיפין של eluate IgG ובאמצעות חיץ elution כetalon למדוד OD ב 280 ננומטר. אם OD הוא &lt;איסוף עצירה 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחדש מטריצת G חלבון ולאחסן אותו בהתאם להוראות היצרן. </li></ol> ריכוזיות לפי ultrafiltration עם צינורות Amicon: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף Amicon Ultra (15 מ&quot;ל / 30KDa) צינורות ultrafiltration עם 1XPBS ידי צנטריפוגה דקות 15-20ב3220 XG ב 4 ° C. השלך את FT מAmicon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את Amicons עם 15 מ&quot;ל של שבריר IgG eluted וצנטריפוגות ל25-30 דקות ב 3220 XG ו 4 מעלות צלזיוס; זמן צנטריפוגה תמיד תלוי בתכולת החלבון של eluate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך FT ולחזור ultrafiltration עד שאין לך חלק eluted עזב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף IgG המרוכז בהרחבה, פעמים, עם 25-30 דקות 1XPBS ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הפתרון &quot;הדביק&quot;, הצהבהב נוגדנים מAmicon המסנן בנפח סופי של 1,500-2,000 μl של 1XPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז אמצעי להתכונן IgG באמצעות ספקטרופוטומטר או NanoDrop: קונצרט כלשהו. (מ&quot;ג / מ&quot;ל) = A (280 ננומטר) X פקטור דילול / 1,4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולאחסן את Amicons בעקבות הוראות היצרן. </li></ol> 2. הזרקת קולגן VII הספציפי IgG לעכברים לפני שתתחיל בהליך הניסוי בפועל, לוודא שהפר הניסיוניtocol כתוב ואת כל החומרים מוכנים לניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את גיליונות נתונים עבור ניקוד המחלה, ELISAs, immunofluorescence (IF) הניתוח וmyeloperoxidase (MPO) assay 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תייג את צינורות דם ואיברים, cryomolds כמו גם היסטולוגיה העיבוד והטבעת קלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרוני הנוגדנים צריכים להיות מוכנים טריים או מופשר ממניות ומאופיינות ביחס לתגובתיות שלהם (אם כייל ידי מיקרוסקופי ו / או ELISA). פתרון הנוגדן המסונן סטרילי צריך להיות מדולל ב PBS באופן שהמינון הנדרש להזרקה נע בין 250-1000 μl. ודא שיש לך מספיק נוגדנים כדי לבצע את הניסוי כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי קרישה: הפרין 20 U / מ&quot;ל ​​ו -8.7 מ&quot;ג / המ&quot;ל קטמין / תערובת 1.3 מ&quot;ג / מיליליטר xylazine להרדמה. כאשר להקריב את העכברים שכותרת צינורות עם פורמלדהיד 3.7% מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירי ניתוח (אזמל, מספריים, צבע עדין והכמתמ&quot;כforcipes ED) ולהכין את מזרקים (מזרקי אינסולין, 1 ו 2 מזרקי מ&quot;ל), מחטים, מצלמה דיגיטלית וכרטיס זיכרון נוסף. </li></ol> הערה: בצע את כל ההליכים על עכברים מסוממים קטמין / או xylazine isoflurane isoflurane הוא האופציה המועדפת להרדמת בדיקות העור היומיות, כמו עכברים להתאושש במהירות.. עם זאת, בעת צילום תמונות, קטמין 87 מ&quot;ג / ק&quot;ג וxylazine 13 מ&quot;ג / ק&quot;ג בדרך כלל מוזרקת מתחת לעור. להמתת חסד מינון קטמין / xylazine גדל ל קטמין 130 מ&quot;ג / ק&quot;ג וxylazine 20 מ&quot;ג / ק&quot;ג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את החיות כבר סומנו למצבו הבריאותי, העור והמראה הכללי שלהם פרווה, לשקול אותם ולמדוד את עובי האוזן שלהם (תמיד מקל על אותה האוזן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשמת ערכים ושינויים בגיליון ההערכה הקלינית שנצפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20-30 μl (2-3 טיפין) דם מוריד הזנב במזרק המכיל את אותו הנפח של קרישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הפרווה ועור באמצעות אתנול 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרון הנוגדן תת עורי לחלק האחורי באמצעות מזרק אינסולין. (עבור אתרים מסוימים (לדוגמה, האוזניים) רק בנפחים קטנים (10-50 μl) הם ריאליים כדי להיות מוזרק.) </li></ol> זריקות יש לחזור כל יום שני, 4 פעמים. BALB / ג וC57BL6 עכברים של משקל גוף של כ 20 גרם להתחיל לפתח את מחל 3-4 ימים לאחר שהממשל הראשון של 400-500 עד 750 מיקרוגרם נוגדנים עצמיים / g משקל גוף / הזרקה. כשסיים את הניסוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים את העכברים תחת הרדמה עמוקה על ידי הזרקת 130 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו 20 מ&quot;ג / ק&quot;ג תת עורי קטמין / xylazine, לגרום לדימום המחודש מהווריד הנבוב האחורית ולחתוך את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף איברים / דגימות רקמות כגון עור: זנבות, אוזן, דם וושט ולשים אותם בצינורות שכותרתו בעבר ופורמלדהיד% PBS או 3.7 מלאים. </li></ol> כאשר חוזריםמעבדה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדם ב1200 XG, 10 דקות ב RT לפלזמה נפרדת, להעביר את הפלזמה לצינורות שכותרתו כראוי ולאחסן אותם בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ עור הביופסיה בטמפרטורה בינונית Cut אופטימלי באמצעות cryomolds, כראוי למותג, ולאחסן אותם ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את דגימות הרקמה שנועדו ליסטולוגיה בתבניות הטבעת התוויות ולשמור אותם בפורמלין 3.7% עד הטבעת פרפין. </li></ol> 3. הערכה קלינית של חומרת מחלה עכברים יש לבחון מדי יום לנגעים בעור ובריריות והממצאים צריכים להיות מוקלטים באמצעות טפסים מתאימים. הקריטריונים להמתת החסד מוקדמת הם נגעי עור המשפיעים יותר, כי 20% משטח הגוף וירידה במשקל של 5-10% ממשקל הגוף בשלושה ימים רצופים, ספירה לציון מחלה של 5 (טבלה 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על בטנו. התחל עם אזור הראש, כלומר עם הזכותאוזן ולבדוק לשלפוחיות, שחיקות, קרום בפנימי, כמו גם בצד החיצוני. תמשיך באותה הדרך עם אוזן השמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיני ימין ושמאל נשלטות סימנים של אודם, התקרחות, שחיקה ו / או קרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור חוטם מצח והם עברו דרך הבאה, ממשיכים בחלק הגחוני של החוטם, בשפות ובקרום הרירי של הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הרגל הימנית הקדמית החל מהכפה, נע כלפי מעלה; לעבור לרגל הקדמית השמאלית. הליך אותו דבר עם רגליו האחוריות הימניות ושמאליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צחצח דרך הפרווה בצוואר ובגב האזור עם מלקחי נקודה עדינים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפך את העכבר על גבה ולבדוק את חלק הגחון, כמו גם את צדדי הגחון של גפיים באותו אופן כמו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של חלקי גוף הרלוונטיים שבו העכברים לפתח מחלה. יש לשים לב לכמות והאיכות של תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את ציוני מחלה הקליניות. </li></ol> 4. בדיקת דגימות עור ופלזמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכון, חנות, ו / או לעבד את כל הרקמות שנאספו על פי התכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חלקי רקמה קפוא לאם זיהוי של נוגדני ארנבת ורכיבי מערכה משלימה עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את תכולת החלבון ואנזים השונה (בדיקת MPO) של תמציות איברי רקמות ו / או קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף פרפין מוטבע רקמות וכתם עם H &amp; E כדי להמחיש את מידת ניזק לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הפלזמה על ידי ELISA, immunoblot. </li></ol>

<ol><li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li>
<li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li>
<li>Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K%CE%B2+plays+a+critical+role+in+neutrophil+activation+by+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes.</a> Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).</li>
<li>Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+is+required+for+neutrophil-dependent+autoantibody-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage.</a> J. Pathol. 212, 56-65 (2007).</li>
<li>Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+pathway+of+complement+activation+is+critical+for+blister+induction+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).</li>
<li>Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+deficiency+protects+from+tissue+injury+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).</li>
<li>Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+responses+induce+humorally+mediated+injury+in+experimental+anti-glomerular+basement+membrane+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).</li>
<li>Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthritis+provoked+by+linked+T+and+B+cell+recognition+of+a+glycolytic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.</a> Science. 286, 1732-1735 (1999).</li>
<li>Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flavonoid+luteolin+inhibits+Fc%CE%B3-dependent+respiratory+burst+in+granulocytes%2C+but+not+skin+blistering+in+a+new+model+of+pemphigoid+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice.</a> PLoS One. 7, e31066(2012).</li>
<li>Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+transfer+model+of+the+organ-specific+autoimmune+disease%2C+bullous+pemphigoid%2C+using+antibodies+generated+against+the+hemidesmosomal+antigen%2C+BP180%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180.</a> J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).</li>
<li>Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pemphigus+in+neonatal+mice+by+passive+transfer+of+IgG+from+patients+with+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.</a> N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).</li>
<li>Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myasthenia+gravis%3A+passive+transfer+from+man+to+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse.</a> Science. 190, 397-399 (1975).</li>
<li>Rose, N. R., Bona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+criteria+for+autoimmune+diseases+%28Witebsky%27s+postulates+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited.</a> Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).</li>
<li>Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita.</a> Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).</li>
<li>Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+type+VII+collagen+mediate+Fcgamma-dependent+neutrophil+activation+and+induce+dermal-epidermal+separation+in+cryosections+of+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin.</a> Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).</li>
<li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li>
<li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ההעברה הפסיבית של נוגדנים עצמיים לחיות ניסוי היא גישה עיקרית להוכחת פתוגניות 7, -12. מודלים של בעלי חיים שהושגו באמצעות שיטה זו, בנוסף להיות עדות העקיפה לאוטואימוניות 13, לאפשר את חקירתו של שלב efferent של המנגנון הפתוגני. מודל ההעברה הפסיבית של נוגדני עור המושרה granulocyte תלוי שלפוחיות epidermolysis ולוזה acquisita (EBA) שמש לנתח את המנגנונים של ניזק לרקמה בדלקות עור אוטואימוניות. התבררתי גם, כמחלת מודל להפליא מאלפת ללמוד יסוד ביולוגי וקליניים, היבטים מכרי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אנטיגן רקומביננטי </td><td></td><td></td><td> קידוד פלסמידים לצורות רקומביננטי של קולגן VII העכברי זמין המחבר המקביל. </td></tr><tr><td> סרום ארנבת חיסוני </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> היו לנו ארנבים לבנים בניו זילנד חוסנו 200 מיקרוגרם של אנטיגן, 3 פעמים במרווחים של שבועות 2. לשם כך יש לנו להשתמש בשירותיו של Eurogentec SA, בלגיה. </td></tr><tr><td> החלבון G agarose </td><td> רוש יישומי מדע </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> עכברי BALB / ג </td><td> צ&#39;ארלס ריבר מעבדות </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> מתחם אוקטובר, רקמות-Tek </td><td> סאקורה Finetek </td><td> 4583 </td><td> אוקטובר, טמפרטורה אופטימלית חיתוך </td></tr><tr><td> Cryomold הסטנדרטי </td><td> סאקורה Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 מ&quot;מ × 20 מ&quot;מ × 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Cryomold ביניים </td><td> סאקורה Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 מ&quot;מ × 15 מ&quot;מ × 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> ר &#39;Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> עיבוד היסטולוגיה וקלטות הטבעה </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe שוורץ </td><td> ח Hauptnerund &amp; ריצ&#39;רד Herberholz GmbH &amp; Co KG </td><td> 71492000 </td><td> קעקוע דבק </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO א Becker &amp; Co GmbH </td><td></td><td> קעקוע מכשיר </td></tr><tr><td> הפארין </td><td> קרל רוט GmbH &amp; Co </td><td> 7692.1 </td><td></td></tr><tr><td> פורמלדהיד 37% </td><td> קרל רוט GmbH &amp; Co </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> קטמין hydrochloride </td><td> סיגמה אולדריץ Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> hydrochloride Xylazine </td><td> סיגמה אולדריץ Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי PBS </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> ניקון </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק מונע יחידת מסנן 0.45 מיקרומטר </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caliper </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (מפיץ) </td></tr><tr><td> גיליון ניקוד מחלה </td><td></td><td></td><td> הדוגמא enclosed </td></tr></tbody></table>

שלפוחיות עור autoantibody-induced granulocyte תלויים

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

תופעות אוטואימוניות להתרחש אצל אנשים בריאים, אבל כאשר סובלנות עצמית נכשלה, התגובה אוטואימונית עלולה לגרום לפתולוגיה ספציפית. לדברי Witebsky של נחות היסוד, אחד מהקריטריונים באבחון מחלה אוטואימונית כהיא השעתוק של המחלה בחיות מעבדה על ידי ההעברה הפסיבית של נוגדנים עצמיים. לepidermolysis ולוזה acquisita (EBA), מחל אוטואימונית איבר ספציפי לאבטיפוס של קרום עור ורירי, מספר מודלים ניסיוניים שהוקמו לאחרונה. במודל של בעלי החיים המתוארים בעבודה הנוכחית שלנו, מטוהרי נוגדני IgG נגד מתיחה של 200 חומצות אמינו (aa 757-967) של קולגן VII מוזרקים שוב ושוב לעכברים להתרבות פנוטיפ שלפוחיות כמו גם histo וimmunopathological תכונות אופייניות לאדם 1 EBA. מחלה נפוצה במלוא מובן מילה נתפסת בדרך כלל 5-6 ימים לאחר הזריקה הראשונה והיקף המחלה בקורלציה עם המינון של c מנוהלollagen השביעי ספציפי IgG. הניזק לרקמות (היווצרות שלפוחית) בEBA הניסיוני בהתאם לגיוס וההפעלה של גרנולוציטים ידי נוגדנים עצמיים רקמות בכריכת 2, -4. לכן, מודל זה מאפשר לנתיחה של המסלול הדלקתי granulocyte התלוי המעורבים בניזק לרקמה אוטואימונית, כמודל מתרבה רק שלב T תא העצמאי של התגובה אוטואימונית efferent. יתר על כן, הערך שלו מודגש על ידי מספר המחקרים הממחישים את פוטנציאל שלפוחית ​​וישכנע של נוגדנים עצמיים בגוף חי וחוקרים את מנגנון היווצרות הכיב בEBA 1,3, -6. לבסוף, מודל זה יהיה מאוד להקל על הפיתוח של טיפולים חדשים נגד הדלקת במחל autoantibody מושרות. בסך הכל, מודל חית ההעברה הפסיבית של EBA הוא מודל מחלה נגישה ומאלף ויסייע לחוקרים לנתח לא רק פתוגנזה EBA אבל לענות בסיסי ביולוגי וקלינישאלות אוטואימוניות חיוניות.

ההעברה הפסיבית של אנטיגן ספציפיות נוגדני תוצאות במחלה מלאת מפוצץ בעכברים, המזכירים ברמות קליניות, היסטולוגית וimmunopathological EBA האנושי. שלפוחיות, קרומיים, השחיקות וההתקרחות יתפתחו באוזניים, הזרבובית, הרגליים, כפות הרגליים, גב ומסביב לעיניים של העכברים. הסימנים הקליניים הראשונים של המחלה ככל הנראה יופיעו באוזניים ו / או באזור הראש. תצהיר של הארנב IgG הספציפי, ועכבר המשלים C3 הוא זוהה על ידי ישיר אם בצומת אפידרמיס העור בcryosections של עור perilesional. בשלפוחיות בעור lesional ...

במודל של בעלי החיים המתוארים בעבודה הנוכחית שלנו, מטוהרי נוגדני IgG נגד מתיחה של 200 חומצות אמינו (aa 757-967) של קולגן VII מוזרקים שוב ושוב לעכברים להתרבות פנוטיפ שלפוחיות כמו גם histo וimmunopathological תכונות אופייניות לאדם epidermolysis ולוזה acquisita (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

שלפוחיות עור Autoantibody-Induced granulocyte תלויים

תופעות אוטואימוניות מופיעות באנשים בריאים, אך כאשר הסבירות העצמית (self-tolerance) נכשלת, התגובה האוטואימונית עלולה להוביל לפתולוגיה ספציפית. על פי ...

אני Cassian RO מהמחלקה לדרמטולוגיה באוניברסיטת Fryberg, גרמניה. המחקר במעבדתנו מתמקד בפתוגנזה של מחלות עור אוטואימוניות. אחת המחלות האוטואימוניות שבהן אנו מעוניינים היא Epidermolysis QUISTA או EBAA, שהיא מחלה אוטואימונית ספציפית לאיבר עם מערכת אנטיגן-נוגדן עצמי מוגדרת היטב, ועבור מחלה זו קיימים מודלים משלימים של exvivo ומודלים של בעלי חיים.ניתן לשחזר את היווצרות השלפוחיות של EBA באמצעות העברה פסיבית (PE) של נוגדנים נגד קולגן מסוג שבעה לעכברים. לכן, במאמר וידאו זה, נציג את ההשראה והניתוח של היווצרות שלפוחיות בעור בעכברים על ידי העברה פסיבית של נוגדנים ספציפיים לקולגן שבעה. שלום, אני King OBA מקבוצת CAS במחלקת דרמטולוגיה בבית החולים האוניברסיטאי של פרייבורג.בסרטון זה, נדגים כיצד מקימים מודל עכברים ניסיוני של EBA באמצעות העברה פסיבית של נוגדנים עצמיים פתוגניים. אנו משתמשים בהליך זה כאשר אנו בוחנים מנגנוני פתולוגיה אפשריים בהפרעות עור אוטואימוניות או כאשר אנו מחפשים אפיתופים פתוגניים. בעת הקמת מודל ההעברה הפסיבית עבור EBA, יש לבצע מספר שלבים נוספים לפני הזרקת הנוגדנים העצמיים לעכברי palp מסוג wild type.בשלב ראשון, ארנבונים לבנים מחסונים תת-עורית עם האנטיגן הרקומיננטי המופק. IgG כולל מסרום של ארנב מבודל באמצעות כרומטוגרפיית עמודה בעלת זיקה (affinity column chromatography) ומוזרק לאחר מכן לעכברים מסוג פראי (wild type). ההזרקות ניתנות תת-עורית אחת ליומיים, ארבע פעמים, ודגימות דם נלקחות במרווחי זמן של יומיים.העכברים נבדקים מדי יום להערכת מצבם הכללי ולחיפוש עדות לנגעים עוריים. במהלך הניסוי, מחושבים עבור כל פרט ציונים קליניים המשקפים את פעילות המחלה, ושבועיים לאחר ההזרקה הראשונה, בעלי החיים מוטהלים ונדגמים דגימות סרום וביופסיות של העור לצורך ניתוח המשכי. לאחר זמן הדגירה, מציבים עמודה במעמד תמיכה אנכי, פותחים את החלק התחתון, מקישים ואוספים את הנוזל שזרם החוצה.במבחנות פאלקון (Falcon) של 50 מיליליטר, שמרו את השברים (flow through) עד לקבלת אישור בניתוח פלואורסצנציה עקיפה (immune fluorescence) שהם נקיים מנוגדנים ספציפיים. דללו את ה-IgG המרוכז על ידי אולטרה-פילטרציה במבחנות amicon מיוחדות ב-3,220 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות. תהליך הריכוז כולל העברת האלוואט (eluate) דרך מסנן, השלכה של השברים, מילוי מחדש של המבחנה וחזרה על הפעולה עד שכל האלוואט מסונן. כשלב אחרון, שטפו ב-1× PBS, אספו את ה-IgG המרוכז, הדביק והצהוב, מדדו את ריכוזו ואחסנו אותו במבחנות מסומנות כראוי.לפני תחילת ההזרקה בפועל של הנוגדנים העצמיים, העריכו את הסגוליות שלהם ואת התיתר שלהם באמצעות אימונופלואורסצנציה עקיפה. דגרו חיתוכי קריו של עור רגיל ועדין עם דילולים סדרתיים של תכשיר IGT רכז, והדמינו את שיקועם באמצעות נוגדן משני מתאים ומסומן על ידי צילום תמונות לפני המעבר למתקן בעלי החיים. ודאו שפרוטוקול בעלי החיים כתוב ושכל החומרים מוכנים.גיליונות נתונים לדירוג קליני של פעילות המחלה, מבחנות מתויגות לדגימות דם ורקמה. תמיסת נוגדנים מהולה כך שניתן יהיה להזריק את הנפח המתאים. נוגדי קרישה טריים וחומרי הרדמה, מכשירים כירורגיים סטריליים וכן מזרקים.יש להוסיף לרשימת הבדיקה גם פלר (מדדי) ומצלמה דיגיטלית. לאחר ניקוי משטח העבודה והכנת התקנת האיסופלורן, יש להפטין את המזרק לשאיבת הדם ולמלא מזרק אינסולין בתמיסת נוגדנים. הוצא את העכבר מהכלוב, בדוק את מספר הזיהוי שלו ושקול אותו.רשמו את כל הנתונים שנמדדו ונצפו בגיליון הנתונים האישיים והניקוד הקליני של העכברים. כאשר העכבר נמצא כבר תחת ssis, מדדו את עובי האוזן, ולאחר מכן בדקו את מראה העור והפרווה של בעל החיים. הקדישו תשומת לב מיוחדת לאזור הראש, לגב, לבטן ולגפיים.שאבו דם מווריד הזנב באמצעות חתך קטן שבוצע בשליש העליון שלו; חטאו את הפרווה והזריקו בזהירות את תמיסת ה-IgG תת-עורית על ידי הרמת העור בגב. עם החזרה למעבדה, סובבו את הדם בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,200 ×g בטמפרטורת החדר כדי להפיק את הסרום. העבירו את הדגימה למבחנות מסומנות כראוי ואחסנו אותן בהתאם לתוכנית.יש לבחון את העכברים מדי יום כדי לזהות סימני מחלה כאשר הם מתחילים לפתח אריתמה, אלופציה ונגעים בעור. בנוסף למדידת משקלם, יש להעריך את הפעילות של המחלה. יש להזריק תת-עורית תערובת של ketamine ו-xylazine כדי להרדימ את העכבר.מדדו את עובי האוזן ולאחר מכן התחילו בבדיקה כללית של הגוף. השתמשו בפינצטה עקומה בעלת חוד דק כדי לסרוק את הפרווה בניגוד לכיוון צמיחתה, במטרה לחשוף נקודות פגועות אפשריות. המשיכו בבדיקה מסביב לפנים.הזז את קצה האף לכיוון החלקים החיצוניים והפנימיים של האוזן, ולאחר מכן בדוק גם את הצד השני של הראש. המשך ברירית חלל הפה, בחלק הגחוני של האף ובאזור הבטן. בדוק את האזור הדרסו-לטרלי, האזורB הדרסלי ואזור הצוואר, כמו גם את הגפיים הקדמיות והידיים.כַּמּוּ את היקף הנגעים ברישום, את הממצאים בטופס המבוסס על שטח העור המכוסה, אחוזי חלקים ואזורים מסוימים בגוף בהשוואה לכל שטח העור של העכבר. ציון מחלה קליני מחושב על סמך סך שטח העור וריריות הממברנה המושפעים. לבסוף, צלם חלקים רלוונטיים בגוף ואזורים חולים.בסיום הניסוי, יש להקריב את בעלי החיים תחת הרדמה עמוקה ולאסוף דם וכן דגימות רקמה. האוזניים, הזנב והוושט הם הדגימות הנלקחות בשכיחות הגבוהה ביותר במסגרת ניסויית זו. יש לחתוך את הביופסיות של העור מהאזור הפגוע לפסים קטנים יותר.העביר אותם לקסוות לעיבוד היסטולוגי ולהטמעה, ושמור אותם ב-3.7% formaldehyde עד להטמעה בפרפין. לאחר מכן, עבד את הדגימות לצביעת h and e לצורך אנליזה של פלואורסצנציה אימונית. הטמן את רצועות עור הפראל ב-Optimal cutting temperature medium והשתמש בקריוסטט לחיתוך נתחים בעובי של שש מיקרומטר.בצעו ניתוח פלואורסצנציה אימונית ישירה כדי להדגים נוגדויות ארנב ספציפיות ומרכיבי משלים של עכבר הקשורים לרקמה; כבדיקה נוספת, בצעו Eliza באמצעות פלטות מיקרו-טיטראציה מצופות באנטיגן רקומביננטי ודילול סדרתי של סרום העכבר כדי למדוד את רמות האוטו-נוגדויות במחזור הדם. העברה פסיבית של נוגדויות ספציפיות לקולגן שבעה גורמת למחלה מלאה בעכברים, הדומה למחלה ברמות הקליניות, ההיסטולוגיות והאימונו-פתולוגיות. שלפוחיות EBA אנושיות, קשריים, כיבולים ואלופציה מתפתחים באוזן, סביב העיניים, באף, בכפות הרגליים, ברגליים ובגב של העכברים.פעילות המחלה, המראה מגמה עולה לאורך הניסוי, מחושבת על בסיס שטח העור וריCריות הרירית הפגועים. תוצאות מייצגות המתארות שיקוע של IgG ספציפי של ארנב ומשלים C3 של עכבר שזוהו באמצעות פלואורסצנציה אימונית עקיפה בצומת הדֶרמה-אפידרמיס. מוצגות כאן חתכים קריוגניים של עור פראלי.לא זוהו IgG או complement C3 בביקורות. ניתוח היסטולוגי עוקב של עור עם נגעים חושף שלפוחיות תת-אפידרמליות והסננה דלקתית. עם זאת, לא נצפתה היווצרות שלפוחיות תת-אפידרמליות בביקורת בעת ביצוע הבדיקה.כפי שמוצג כאן, המודל של נוגדנים עצמיים המשרה שלפוחיות תת-אפידרמליות יסייע רבות בניתוח המסלולים הדלקתיים התלויים ב-ROY, המופעלים על ידי נוגדנים עצמיים וגורמים לנזק רקמתי. עיצובו החסון ופרוטוקולו הפשוט הופכים אותו למתאים גם לפיתוח ובדיקה של טיפולים אנטי-דלקתיים חדשים במחלות המונח seules על ידי נוגדנים עצמיים.

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Herpetiformis דרמטיטיס (DH) היא מחלה דלקתית כרונית המאופיינת תגובה אוטואימונית בין IgA ו אפידרמיס transglutaminase (eTG). ד"ה מפתחת בחלק קטן מאוד של חולים הרגישים לגלוטן ו / או צליאק. תוצאות המחקר הזה מצביעים על כך ד"ה יכול גם להתפתח לארח רזוס קוף עם סימפטומים של אטופיק idiopatic.

הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

מבחני immunofluorescent העקיף (IIF) באופן מסורתי המשמשים לזיהוי של נוגדני antinuclear (ANA) בסרום אדם. הנוכחות של נוגדנים אלה יכול לסייע באבחון של מחלות מערכתיות אוטואימוניות שגרוניות (סארטי). פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע ביעילות את טכניקת IIF לזהות במדויק נוגדנים עצמיים אלה.

אנטי גרעיני נוגדן הקרנה באמצעות הפ-2 תאים

העברת לימפוציטים bm12 למושתל C57BL/6 היא מודל מבוסס של זאבת אדמנתית מערכתית. כאן אנו מתארים כיצד ליזום מחלה באמצעות מודל זה וכיצד לאפיין תאי עזר זקיקי T, תאי B במרכז הנבט ותאי פלזמה על ידי ציטומטריית זרימה.

דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6

כאן, אנו מספקים הפגנה של המודל האחזור עורית שלפוחית היניקה. המודל מאפשר גישה פשוטה ללמוד האנושי ויוו מסתגלת תגובות מערכת החיסון, למשל בהקשר של פיתוח החיסון.

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מעורבות מח עצם מאתר כימרות עם ספונטנית למרכזי נבטי אוטואימונית, באיזה autoreactive לימפוציטים לשאת photoactivatable חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP-הרשות) כתב. פעולה זו מספקת את היכולת לקשר מיקום סלולארי ברקמות עם ניתוחים פונקציונליים המולקולריים במורד הזרם.

חוקרים למרכזי נבטי Autoreactive בודדים על-ידי Photoactivation במודל של Chimeric מעורבת של מחלת חיסון עצמי

מבחן ההפעלה הבזופילי הוא מבחן אבחון משלים במבחנה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE המבוסס על זיהוי הפעלת בזופיל בנוכחות גירוי מסוים באמצעות מדידת סמני הפעלה על ידי ציטומטריה של זרימה.

בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיה

המחקר מדגים את תפקידו של העור בוויסות התגובות החיסוניות בעכברים באמצעות חיסון אפיעורי (EC). חיסון EC עם אנטיגן חלבון יכול לדכא תגובות חיסוניות ברגישות יתר למגע או להפוך דיכוי המושרה על ידי העור בשילוב עם דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן. חיסון EC מראה הבטחה כגישה יעילה ונטולת מחטים לאימונותרפיה.

מודל עכברי של אימונומודולציה המושרה אפיעורית

נגעי עור הם מאפיינים נפוצים וחשובים במחלות ראומטיות רבות, וביופסיה עם ניתוח פתולוגי ממלאת תפקיד קריטי באבחון. מאמר זה מספק סקירה מפורטת של הליך ביופסיית העור הסטנדרטי, ותוך שימוש בזאבת אדמנתית דיסקואידית כדוגמה, מדגיש את התפקיד החיוני של דרמטופתולוגיה באבחון מחלות ראומטיות.

ביופסיית עור לאבחון זאבת אדמנתית דיסקואידית

אופטימיזציה של מודל ניסיוני אוגר leishmaniasis עורית על ידי הזרקה של...

Leishmaniasis עורית בעור הגב של אוגרים: מודל שימושי להקרנה של תרופות Antileishmanial

מאמר זה מתאר שיטה לחזות היווצרות הסינפסה virological HIV-1 המעטפה הנגרמת על bilayers זכוכית הנתמכים מישוריים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סך פנימית (TIRF) השתקפות. השיטה ניתן גם לשלב עם כתמים immunofluorescence לזהות הפעלה חלוקה מחדש של מולקולות איתות המתרחשים במהלך היווצרות ה-HIV-1 המעטפה הנגרמת סינפסה virological.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

חקור את שיטת ההעברה הפסיבית של נוגדנים ספציפיים לקולגן VII בעכברים ליצירת דגם מחלת EBA. שיטה זו מאפשרת ניתוח היסטופתולוגי של שלפוחיות עור ומנגנוני מחלות אוטואימוניות.

שלפוחיות עור Autoantibody-Induced granulocyte תלויים

גלה סרטונים נוספים