הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

המטרה הכוללת של הניסויים המתוארים היא ניטור אינטגרציה של אותות פוטנציאליים של הממברנה ועיבוד מידע על ידי תא עצב בודד באופן אופטי ברזולוציה של תת-מיקרומטר ותת-אלפית שנייה ממספר אתרים בתא עצב. זה מושג על ידי בניית מערך הדמיה עם רגישות מתאימה כדי לאפשר רישום של שינויים חלקיים קטנים בעוצמת האור המתאימים לחולף פוטנציאל הממברנה. לאחר מכן, בחר את הנוירונים עם האנטומיה המתאימה לנוירוני הדמיה יעילים עם תהליכים שלמים ארוכים במישור מוקד יחיד קרוב לפני השטח של הפרוסה.

לאחר מכן טען את הנוירונים שנבחרו מראש בצבעים רגישים למתח כדי לאפשר מעקב אופטי אחר שינויים בפוטנציאל הממברנה. התוצאות מראות את היכולת הייחודית של גישה זו להשיג מידע על שילוב אותות חשמליים על ידי תאי עצב בודדים על ידי ניטור אותות פוטנציאליים של ממברנה מאקסונים, דנדריטים וקוצים דנדריטיים. בנוירופיזיולוגיה של התא.

כלים חדשים מפותחים בגלל שתי המגבלות ארוכות השנים של האלקטרופיזיולוגיה הקונבנציונלית, רזולוציה מרחבית נמוכה של מדידות אלקטרודות וחוסר יכולת להקליט ממבנים קטנים כגון ערבויות אקסון או קוצים דנדריטיים. כדי להתגבר על חסרונות אלה, ניתן לשלב את גישת אלקטרודות התיקון עם טכניקות אופטיות המאפשרות הקלטות מקבילות מכל חלקי הנוירו. כאן אנו מתארים טכניקה כזו, הקלטה אופטית מרובת צדדים של ארעי פוטנציאל ממברנה ברזולוציה של עמוד שדרה יחיד.

בניסוי זה משתמשים במיקרוסקופ זקוף ובשלוש מצלמות כדי להתאים את התאורה האחידה. ראשית, הכנס מסנן צפיפות ניטרלית מתאים בנתיב קרן הלייזר. לאחר מכן, מקד את המטרה על פני השטח של שקופית הפלואורסצנט הסטנדרטית.

תוך כדי התבוננות בתמונת ה-CCD של שדה הראייה על מסך הצג, כוונן את מיקום הקצה המקבל של מוביל אור הקוורץ ואת מיקום קצה הפלט של מוביל האור באמצעות מפעילים מתאימים על מעבה ה-epi fluorescence על מנת להשיג תאורה ממורכזת ואחידה של שדה הראייה. כדי לקבוע את רעש הרטט, השתמש במגלשת פלורסנט רגילה עם סימן שאינו פלואורסצנטי על פני השטח. רשום את עוצמת האור עם ה-CCD העצבי במצב רציף.

מקד את המטרה בקצה כהה של הסימן השחור והקלט את עוצמת האור למשך כ-100 אלפיות השנייה בקצב פריימים של שני קילו-הרץ. לאחר מכן הצג את הממוצע המרחבי של עקבות עוצמת האור החלקית מכ-20 פיקסלים המקבלים אור מהאזור המואר באופן אחיד ומכ-20 פיקסלים לאורך קצה הסימן השחור. הרעש העודף בממוצע המרחבי מהפיקסלים עם קצוות ניגודיות גבוהים משקף את רעש הרטט במערכת.

חיוני להתקין את התריס המכני על שולחן בידוד הרטט כדי שפתיחת התריס לא תכניס רעשי רטט בהקלטה האופטית. זהו צעד קריטי. התקן את התריס באמצעות ברגי פלסטיק וחומר בידוד רעידות כדי להפחית את רעש הרטט האקוסטי שניתן לקלוט על ידי מערכת ההקלטה האופטית.

כדי לבודד את הרטט, כוונן את טבלת בידוד הרטט עד שרעש הרטט של הפיקסלים המכסים את הקצה החד של התמונה יהיה קטן יותר מרעש הצילום. חוטי הציוד על השולחן חייבים להיות רופפים על מנת להימנע מהעברת התנודות המכניות למיקרוסקופ. בהליך זה, הכינו את פרוסות המוח בעובי של 300 עד 400 מיקרון על פי נהלים סטנדרטיים עם קו עכבר המבטא EGFP בתאי עצב בודדים מעניינים עם מערכת קונפוקלית של דיסק מסתובב.

דמיינו את תאי העצב המסומנים ב-EGFP בפרוסה. לאחר מכן, בחר את הנוירונים עם עצים אקסונליים דנדריטיים שלמים, ועם תהליכים הפועלים במקביל וקרוב לפני השטח של הפרוסה להדמיית פוטנציאל הממברנה. לאחר מכן מלאו פיפטת תיקון זכוכית מהקצה בתמיסה תוך-תאית נטולת צבע עד שני שליש מהאלקטרודה מתחדדת על ידי הפעלת לחץ שלילי למשך כ-15 שניות.

לאחר מכן, מלאו מחדש את האלקטרודה בתמיסה המכילה את הממברנה IMP מחלחלת לצבע רגיש למתח המומס בתמיסה התוך תאית. כעת, טלאו תא עצב שנבחר בעבר תוך דקה אחת מטעינת הצבע לתוך האלקטרודה. הפעל לחץ חיובי נמוך כ-10 מילימטרים של כספית לפני הורדת הפיפטה לאמבטיה, ותוך כדי מיקום האלקטרודה בפרוסה, זה מבטיח שלא ידלוף צבע מהאלקטרודה לפני יצירת האיטום.

הגדל ללחץ גבוה בסביבות 100 מילימטר כספית ממש לפני שהאלקטרודה נוגעת במשטח התא. ביסוס האיטום בכל תצורת התא, אפשר דיפוזיה חופשית של הצבע מפיפטה טלאי סומטי לסומה למשך 20 עד 45 דקות. במהלך הדיפוזיה הצבועה, עקוב אחר המצב הפיזיולוגי של הנוירון על ידי רישום פוטנציאל הפעולה המעורר במצב המהדק הנוכחי.

בנוסף, עקוב אחר כמות הצביעה על ידי רישום עוצמת האור במנוחה מסומה התא בקצב פריימים של שני קילו-הרץ ובשבריר מעוצמת האור המלאה המותאמת עם מסנני צפיפות ניטרלית. המשך בתהליך ההורדה עד שפוטנציאל הפעולה יתחיל להתרחב. בתום הצביעה, משוך בזהירות את פיפטת התיקון הרחק מהסומה בתצורת מהדק מתח כדי להבטיח שהמעבר מתא שלם לתצורת תיקון חיצוני מושג בתהליך.

לאחר מכן S דוגר על הפרוסה למשך 1.5 עד שעתיים נוספות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לצבע הרגיש למתח להתפשט לתהליכים העצביים. לאחר שכמות משמעותית של צבע התפזרה הרחק מהסומה לתהליכים הדנדריטיים והאקסונליים, יש לשחזר לחלוטין את צורת הגל של פוטנציאל הפעולה. בשלב הבא, אתר את הסומה של נוירון הכתם מתחת לפלואורסצנטיות בעוצמה נמוכה.

הפחת את עוצמת האור עם מסנני צפיפות ניטרלית למינימום הנדרש כדי לדמיין את האובייקט המעניין באמצעות שלב XY סרוק את אזור הפרוסה המכיל את הנוירון הפלואורסצנטי עד לזיהוי הסומה הפלואורסצנטית. מקם את הסומה של התא המוכתם במרכז המיקרוסקופ חזרת שדה לחבר את הנוירון עם אלקטרודת תיקון סטנדרטית ללא צבע מתחת ל-DIC. לאחר מכן דמיין את התהליכים העצביים תחת הקרינה בעוצמה נמוכה בקצב פריימים של 10 עד 40 הרץ במצב הקלטה רציף של ה-CCD להדמיית מתח.

שימוש במיקום שלב XY, התהליך העצבי המעניין במרכז אזור ההדמיה. בנוסף, הגן על ה-SOMA מפני אור העירור באמצעות קשתית עצירת השדה הסגורה חלקית של המיקרוסקופ כדי להפחית את הנזק הפוטודינמי. לאחר מכן, רשום את האותות האופטיים הקשורים לפוטנציאל פעולה של התפשטות לאחור בענפים הדנדריטיים הבודדים.

לאחר מכן רשום את האותות האופטיים הקשורים לפוטנציאל הפעולה באקסון. לאחר מכן, רשום את האותות האופטיים הקשורים לפוטנציאל פעולה של התפשטות לאחור בקוצים הדנדריטים. השתמש בקצב הפריימים המתאים לשחזור מדויק של צורת גל האות.

במקביל, שמור על תקופות ההקלטה והחשיפה לאור עירור בעוצמה גבוהה קצרים ככל האפשר על מנת למזער הלבנת צבע ונזק פוטודינמי. הקלטת האותות האופטיים מוצגת כאן. הנה. הפאנל העליון מציג תמונה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של נוירון מוכתם עם האקסון שלו במצב ההקלטה.

בעוד שהפאנל האמצעי מציג את תמונת הקרינה ברזולוציה מרחבית נמוכה של האקסון המתקבל על ידי CCD המשמש להדמיית פוטנציאל ממברנה, הפאנל התחתון מציג את הקלטות האלקטרודות מהסומה וההקלטות האופטיות מה-A IS והצומת של rvi. הנתונים הגולמיים והאותות המעובדים מוצגים. איור זה מציג את אותות פוטנציאל הפעולה מהאקסון של נוירון קליפת המוח L 5 טעון בפעולת הצבע הרגישה למתח.

אותות קשורים פוטנציאליים נרשמו בקצב פריימים של 10 קילו-הרץ. עקבות אלה מצביעים על פוטנציאל הפעולה החולף משלושה מקומות. האחד, האלקטרודה שמקליטה מהסומה.

שתיים, ההקלטות האופטיות מגבעת האקסון, ושלוש, ההקלטה האופטית מהתו הראשון של vie, והנה האותות המונחים על גבי אותם שלושת המקומות. איור זה מציג פרץ של ארבעה אותות פוטנציאל פעולה המתפשטים לאחור ממספר מיקומים על הסוכה הדנדריטית של נוירון קליפת המוח L 5 המופעל על ידי פולסים קצרים של זרם דה-פולריזציה ב-100 הרץ. מוצגים כאן אותות פוטנציאל הפעולה מעמוד שדרה דנדריטי בודד.

הנה השחזור האנטומי המתקבל מערימה של תמונות קונפוקליות של דיסק מסתובב, והנה תמונת הקרינה של אותו אזור המתקבלת עם מצלמת CCD. עבור הדמיית פוטנציאל ממברנה, עקבות עוצמת הקרינה המתאימות לפעולת התפשטות לאחור פוטנציאלים ממיקומים אחד עד שלושה כמתואר בתמונת ה-CCD מוצגים בפאנל הימני. העקבה התחתונה מציינת את הקלטת האלקטרודה מהסומה.

ההכנה להקלטה מוקדמת אורכת כשלוש שעות, כולל תקופת ההמתנה לפיזור הקוביות לתהליכים דיסטליים. זמן ההקלטה מוגבל על ידי סקירה רגילה של ההכנה ועל ידי נזק פוטודינמי PO. כמות הנזק הפוטודינמי פרופורציונלית לעוצמת אור העירור, ולמשך ומספר ניסיונות ההקלטה הבודדים.

בניסויים מסוימים ניתן לבצע יותר מ-50 ניסויי הקלטה במשך שעה או שעתיים. מדידות אחרות דורשות עירור גבוה, עוצמות אור והקלטות ארוכות יותר, והן מוגבלות על ידי נזק פוטודינמי למספר ניסויי הקלטה בלבד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הדמיית מתח מכל המבנה האקסונלי והקצה של נוירונים בודדים בפרוסות מוח.