Name: רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למדו הנדסת רקמות שריר משלד ממתאי גזעית עכבריים באמצעות גירוי חשמלי ומיקרוסקופיה. שיטה זו מאפשרת יצירת רקמות מיושרות לחקר רפואה רגנרטיבית ובשר מתורבת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לYabin וו עבור culturing הרקמות המוצגות באיור 2, התמונה צולמה על ידי ברט ואן Overbeeke. העבודה נתמכת כלכלית על ידי SenterNovem, המענק 42022 ISO.

1. תרבות של תאי Murine היצמדות מוליד או C2C12 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאים בהתאם לפרוטוקול שפורסם תחילה על ידי שפר ועמיתיו 10, ומאוחר יותר בעיבוד של קולינס ואח&#39;. בונן 11 ואח&#39; 12. ולאחסן אותם בחנקן נוזלי. זה דורש עכברים, למשל C57Bl / 6. שיטות חלופיות המשמשות במעבדות אחרות, למשל שיטה שפורסמה בכתב העת של ניסויים דמיינו ידי Li Y et al. 13. לחומרים כימיים והציוד אתה התייחסת לטבלה בעמוד 7 ו 8. משרירים מעכבר אחד אתה בדרך כלל תקבל מספיק תאים כדי cryopreserve כ 20 בקבוקונים בחנקן נוזלי. בשלב הבא, אנחנו מתחילים את הפרוטוקול להפשיר את התאים מאחסון החנקן הנוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התאים מבקבוקון 1 ל25 סנטימטרים 2 Matrigel (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בקבוק תרבית רקמה מצופה ולהוסיף מדיום גידול (GM) בהיקף של (335 מ&quot;ל DMEM מתקדם, בובין העוברי 100 מ&quot;לדואר סרום (FBS), 50 המ&quot;ל HS, 5 המ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מיליליטר L-glutamin, 5 מיליליטר תמצית עוף עובר (CEE)). </li></ol> הערה: מעייל ל2 שעות בטמפרטורת חדר ולהסיר Matrigel ידי שאיפה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת תרבות התאים כ 01:03 כל 3 ימים. פירושו של הדבר: ביום 3: תאי מעבר מאחד 25 סנטימטרים 2 עד 2 סנטימטר בקבוק 75, ביום 6: תאי מעבר מ 2 בקבוק אחד 75 סנטימטרים לשתי צלוחיות 150 סנטימטר (2 עם 30 דקות preplating בצלוחיות ללא ציפוי). ביום 2 בקבוק 150 9 העברה 1 סנטימטר עד 2 בקבוק 1 משולש 150 סנטימטר, או אם אינו זמין לשלושה 150 סנטימטר 2 צלוחיות (במידת צורך preplate שוב תלוי בפנוטיפ של תאים). ביום 12 בתאים מוכנים לזריעה למבנה שרירים. </li></ol> הערות: - לכל 150 סנטימטרים משולשים 2 מספר התאים יהיה כ 4.5 x 10 6 תאים. - השתמש באמצעותls מבידודים שונים לערבב אותם כדי להשיג אוכלוסייה מעורבת של תאים בשלב של זריעה. הערה: אם תבחר שלא לעבוד עם תאים ראשוניים, C2C12 myoblasts הוא אלטרנטיבה טובה. 2. הנדסת רקמות שריר שלד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דבק סיליקון על ידי הערבוב &quot;אלסטומר&quot; עם &quot;סוכן הריפוי&quot; (10:01). חותך + / - מגזרים מרובעים 5 מ&quot;מ של סקוטש בצד משולש אחד (בית דמוי צורה; איור 1). דבק סקוטש לתוך הבארות של צלחת תרבות 6-היטב בשטח של כ 12 מ&quot;מ בין הריבועים. </li></ol> הערות: - השתמש רק בצד הרך של סקוטש ולפנות מעלה הצד הזה. - ודא כי גגות פנים זה לזה. - רק לכסות סקוטש עם סיליקון דבק, אינו מתפשט ברחבי דבק היטב. - לגירוי חשמלי מאוחר יותר היא רלוונטית כדי ליישר את המבנים בכיוון האנכי של pl הטובאכלתי (לאורך ציר זמן). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר לייבוש למשך הלילה בתנור ואקום, לא מחומם, בעיקר כדי להסיר בועות אוויר. לעקר ידי הוספת EtOH 70% לבארות והדגירה במשך 15 דקות. לשטוף 3x עם PBS ולשים תחת UV במשך 15 דקות. הסר את כל PBS מהבארות וסקוטש והמקום בחממה עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר פתרון Matrigel במקרר ולהכין את פתרון קולגן לריכוז הרצוי זמן קצר לפני ביצוע מבני 3D. דלל את הקולגן המניות עם חומצה אצטית 0.02% סטרילי (ריכוז סופי 3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li></ol> הערה: להשאיר הכל על קרח. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize התאים, resuspend ב GM וספירה. לצאת מתאים בצינור צנטריפוגה בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכמות הרצויה של פתרון מניות קולגן למספרים של מבנים שברצונך להפוך לצינור (לפי טבלה 1), להוסיף NaOH 0.5m לפתרון קולגן זה עד אור ורוד קולוR הוא מצביע על רמת חומציות של 7.5. מערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ולמנוע היווצרות בועה. ואז להוסיף Matrigel ומערבב בעדינות אך ביסודיות. לבסוף, מוסיף לתערובת GM קולגן / Matrigel (לכמויות המתאימות ראה טבלה 1). </li></ol> הערות: - לבצע כל צעד על קרח! Matrigel וקולגן יהיו בקלות ג&#39;ל בטמפרטורה הולכת וגוברת. - לשים לב שהצבע אכן הוא ורוד! עלייה בחומציות גם לגרום gelation המהיר. - ריכוז סופי של קולגן: 1.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הסכום הרצוי של תאים ב1000 סל&quot;ד למשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. </li></ol> הערה: - בהתאם לפעילות של התאים במספר תאים לכל בנייה צריך להיות מותאם. בדרך כלל, מספר התאים נמצא בין 750.000 ו1250000 תאים לכל מבנה. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בחלק מתערובת ג&#39;ל לresuspend התא הגלולולהעביר את התאים לתוך התערובת שנותרה ומערבב היטב, אך ללא החדרת בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את גם צלחות חוממו מראש מתוך החממה ופיפטה 0.35 -0.4 מ&quot;ל של תערובת התא ג&#39;ל לסקוטש הראשון. ואז, מתחיל פיפטה את התערובת מהמרכז בין האתרים המצורפים ולהאריך לסקוטש. לבסוף, שימוש יתר ג&#39;ל כדי למלא את הפער בין שני עוגנים ופיפטה סקוטש סביב פיסות סקוטש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק היטב לאחר דקות 5-10 אם הג&#39;לי הוא מוצק מספיק כדי להיות מועבר, כלומר בעדינות לנצל את הכלים ולבדוק חזותיים אם ג&#39;ל הוא נוקשה. אם כן, הנח את הכלים בזהירות באינקובטור. בדרך כלל, הם יכולים להיות הרים אחרי עשר דקות. ואז, אחרי שעתי 1-2, עדינות כיסוי כל ג&#39;ל עם 4 מ&quot;ל של GM החם. </li></ol> הערה:-אל תעשו תנועות נמרצות בעת טיפול בצלחות. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף GM ידי בידול בינוני (מדיום גידולללא תמצית עוברים אפרוח) לאחר 24 שעות, ולהחליף במדיום טרי כל 2-3 ימים. ביום 7 היית צריך להשיג סיבי שריר בכיוון בשל, כפי שניתן להעריך עם ההכתמה לפיתוח תלמי צלב בסיבי השריר התמזגו. </li></ol> 3. גירוי חשמלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את האלקטרודות מצלחת ionoptix (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד) לפני השימוש באתנול 70% ולאחר מכן יבש תחת UV בקבינט בטיחות. הנח את הצלחת עם אלקטרודות לצלחת התרבות עם המבנים ומכסים עם מכסה מצלחת התרבות וההעברה לחממה. חבר Ionoptix C-הקוצב עם הכבלים המתאימים. </li></ol> הערה: אלקטרודות מונחות במקביל לצד מבנה השריר (איור 2). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פרוטוקול הגירוי כצפוי. </li></ol> הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 4 V / סנטימטר,פולסים 6ms בתדירות של 2Hz. שינוי התרבות בינונית בכל שעות 24 בזמן הגירוי.

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
<li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li>
<li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells%3A+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li>
<li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+der+Schaft%2C+D+%22Tissue+Eng.+Part+A%22">Tissue Eng. Part A</a>. , (2011).</li>
<li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li>
<li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche%3A+optimizing+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li>
<li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol%3A+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li>
<li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li>
<li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , In revision (2013).</li>
<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לי מה לחשוף.

הנדסת רקמות שריר יש פוטנציאל גדול לשימוש כמודל מחלה, לסריקת תרופות וברפואת רגנרטיבית לייצור בשר. עם זאת, הדרישות ליישומים אלה משתנות. אנחנו בחרנו לעבוד עם שילוב של קולגן וmatrigel, כי קולגן מאפשר יישור תאים וכי תאי אב ההיצמדות דורשים נוכחות של חלבונים שמקורם בממברנה מרתף כפי שנקבע במחקרים הקודמים 2D 12. יתר על כן, ג&#39;לי הפיברין נבדק במעבדה שלנו ונראה שלא לתמוך בבתאים C2C12 והיצמדות כפי שעושה התערובת של קולגן וMatrigel ™ ובמיוחד לא תוביל להידוק רקמות 14. המ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> גורם Matrigel צמיחה מופחתת </td><td> Beckton ודיקינסון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM (רמת סוכר גבוה) * </td><td> Gibco </td><td> 42430 </td><td></td></tr><tr><td> המתקדם DMEM </td><td> Gibco </td><td> 12491 </td><td></td></tr><tr><td> סוס סרום </td><td> Gibco </td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> גריינר </td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45-0.22 מיקרומטר מזרק מסנן * </td><td> Whatmann (לייכר וScheull) </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> פלסטיק תרבות </td><td> גריינר </td><td></td><td> כולל צלוחיות תרבות וטפטפות </td></tr><tr><td> תמצית עובר אפרוח </td><td> ארצות הברית ביולוגית </td><td> C3999 </td><td></td></tr><tr><td> פסטר פיפטה * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> פסטר pipettes, עם התכווצות, עם כותנת L, פתוח טיפ: 230 מ&quot;מ בקוטר קצה 0,9 - 1,1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פסטר פיפטה * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> פסטר pipettes, עם התכווצות, עם כותנת L, פתוח טיפ: 230 מ&quot;מ בקוטר קצה 1,4 - 1,6 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פסטר פיפטה </td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase סוגי* </td><td> סיגמא </td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא מיקרומטר 40 * </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> מחט 19G </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אלסטומר </td><td> Dow Corning תאגיד </td><td> 3097358-1004 </td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> אשפרה סוכן </td><td> Dow Corning תאגיד </td><td></td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> סקוטש </td><td> חנות רגילה </td><td></td><td> אתה יכול לקנות את זה בחנות רגילה, יש להשתמש בצד הרך בלבד </td></tr><tr><td> קולגן סוג I, זנב חולדה </td><td> BD Biosciences </td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> הפייסר תרבות EP-C-Pace </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מנות התרבות 6-כן לגירוי חשמלי </td><td> Beckton דיקינסון-פלקון </td><td> BD פלקון # 353846 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרודות צלחת תרבות C-Dish </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * דרוש לבידוד של תאים (נקודה 1.1) # יחד בערכה 1 </td></tr></tbody></table>

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

רקמות שריר מהונדס יכולות לשמש למספר מטרות שונות, הכוללת את הייצור של רקמות לשימוש כמודל מחלה במבחנה, למשל ללמוד כיבי לחץ, ולרפואת רגנרטיבית כחלופת בשר 1. מבני השרירים הראשונים שדווחו 3D נעשו לפני שנים רבות וחלוץ בתחום הם Vandenburgh ועמיתי 2,3. שיפורים שנעשה בהנדסת רקמת שריר הם לא רק תוצאה מהעלייה העצומה בידע של גורמים ביוכימיים, תאי גזע ותאי אב, אבל הם במבוססים בעיקר על תובנה שנרכשו על ידי חוקרים כי גורמים פיסיים משחקים תפקיד חיוני בשליטה על התנהגות תא ו רקמת פיתוח. שריר מהונדס מדינה-of-the-art בונה כיום מורכב ממבנים הידרוג תא מאוכלסים. במעבדה שלנו אלה בדרך כלל מורכבים מתאי Murine היצמדות progenitor, מבודדים מרירי גפיים אחוריים Murine או קו תא היצמדות עכברי C2C12, mixed בתערובת של קולגן / Matrigel ומצופה בין שתי נקודתי עיגון, מחק את רצועות השריר. תאים אחרים עשויים להיחשב גם כן, שורות תאים חלופיות כגון כגון L6 myoblasts חולדה 4, תאי שריר הילוד נגזרים progenitor 5, תאים שמקורם ברקמות שריר בוגרים ממינים אחרים, כגון אדם או 6 תאי גזע pluripotent מושרים אפילו (תאי iPS) 7 . contractility הסלולרי גורם ליישור של התאים לאורך הציר הארוך של מבנה 8,9 וההתמיינות של תאי אב השריר לאחר כשבוע של התרבות. יתר על כן, היישום של גירוי חשמלי יכול לשפר את התהליך של התמיינות במידה מסוימת 8. בגלל גודלו המוגבל (8 X 2 X 0.5 מ&quot;מ) רקמה המלאה ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופיה confocal לפקח כדאיות למשל, בידול ויישור תא. בהתאם ליישום הספציפי בדרישות לעבודות ההנדסהרקמת שריר אדומה תשתנה; שימוש דוגמה לרפואת רגנרטיבית דורש גמלון גודל רקמות וכלי הדם, ואילו לשמש כחלופת תרגום בשר למינים אחרים הוא הכרחי.

המוצר הסופי יהיה בונת שריר, שהוזכרה באיור 3. גודל הרקמה יהיה כ 8 מ&quot;מ ארוך, 2 מ&quot;מימ רוחב ו 0.5 מ&quot;מ עובי. גירוי חשמלי במהלך הבידול יהיה לשנות את הביטוי של שרשרת הכבדה isoforms השרירן, אך אינו משפר את תהליך הבידול מאוד כמו הנגרם על ידי מדיום ההתמיינות 8, אבל גירוי חשמלי יכול להיות מיושם גם בסופו של התהליך לבדיקה פונקציונלית של השריר , כי שריר עם sarcomeres מפותח יהיה מסוגל להתכווץ על דופק חשמלי. <p class="jove_content" style=";text-align:right;dire...

רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

ניתן להשתמש ברקמות שריר מהונדסות למספר מטרות שונות, הכוללות ייצור רקמות לשימוש כמודל למחלה in vitro, לדוגמה, כדי...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור רקמות שריר מהונדסות. הדבר מושג תחילה על ידי תרבית של תאי לוויין (satellite cells) או של קו תאי מיובלאסטים כדי להשיג את מספר התאים הנדרש. השלב השני הוא יצירת נקודות העיגון.בשלב הבא, התאים מעורבבים עם ג'ל והתערובת המתקבלת מושקעת בין נקודות העיגון. השלב הסופי הוא גדילה מבדלת של התאים לרקמת שריר. לבסוף, ניתן להשתמש בגירוי חשמלי כדי להשרות התכווצויות של התאים, ובצביעה פלואורסצנטית ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קונפוקלית כדי לזהות את הארגון הסרקומרי של השלד התאי בתאי השריר המבדלים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שתאי השריר יסתדרו בכיוון אחד ברקמות אלו. לטכניקה זו ישנן השלכות גם עבור מטופלים הסובלים מאובדן מסת שריר. אם, למשל, נשתמש בעתיד בתאיו של המטופל עצמו כדי לייצר רקמות אלו, הן יוכלו לשמש למטרות השתלה.שיטה זו מספקת תובנות לגבי התפתחות שרירים ונזקי שרירים, אך היא תספק תובנות גם עבור יישומים חדשניים כמו רפואה רגנרטיבית ובשר מתורבת in vitro. הדגמת הפרוצדורה תהיה חלק משיטות לבידוד והקפאה של תאי מיובלסטים פרוגניטורים, שתוארו במקורות אחרים.אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב לרשימת המקורות המלאה. לאחר הוצאת המבחנה של תאי פרוגניטור של מיובלסטים של עכבר מהחנקן הנוזלי, הניחו את המבחנה במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C להפשרה.לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של מצע גידול מחומם לבקבוק תרבית רקמות של 25 centimeter squared מצופה ב-matric gel. מיד עם הפשרת התאים, הוסיפו את תכולת המבחנה למצע. הדגירו את התאים בבקבוק תרבית הרקמות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide.ביום השלישי לדגירה, קצרו את התאים באמצעות טריפסין, אינקיבציה וסנטריפיגציה במהירות של 1000 RPM, ולאחר מכן העבירו את התאים לבקבוק תרבית רקמה בנפח של 75 סמ"ר המצופה ב-matrigel. פצלו את התאים מדי שלושה ימים, וביום השישי העבירו את התאים לבקבוק תרבית רקמה בנפח של 150 סמ"ר המצופה ב-matrigel. ביום התשיעי, העבירו את התאים מבקבוק תרבית הרקמה בנפח 150 סמ"ר המצופה ב-matrigel לבקבוק תרבית רקמה משולש בנפח 150 סמ"ר המצופה ב-matrigel או לשלושה בקבוקים בנפח 150 סמ"ר.ביום ה-12 של הדגירה, התאים מוכנים להשתלה במבנה שריר. התחילו בגזירת מקטעי סקוטש (Velcro) בשטח של כ-חמישה מילימטרים רבועים, כאשר קצה אחד בצורה משולשת כפי שמוצג בסכימה זו; יש להשתמש רק בצד הרך של הסקוטש. לאחר מכן, הכינו דבק סיליקון על ידי ערבוב האלסטומר עם חומר המקשה ביחס של 10 ל-1.לאחר מכן, הדביקו שתי חתיכות סקוטש (Velcro) לכל באר בצלחת תרבית בעלת שש בארות, תוך השארת רווח של כ-12 מילימטרים בין החתיכות, והשאירו לייבוש למשך הלילה. למחרת, סטריליזו את הבארות ואת הסקוטש על ידי הוספת 70% ethanol לבארות ודגירה למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBS.השאירו את השטיפה השלישית בבארים וחשפו את הפלטה לאור UV למשך 15 דקות. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והעבירו את הפלטות למדגרה לתרביות רקמה עד למועד השימוש. הכינו תמיסה של 3.2 milligrams per milliliter קולגן וחומצה אצטית סטרילית בריכוז 0.02%.הניחו את תמיסת הקולגן על קרח יחד עם תמיסת מטריג'ל (matrigel) שהופשרה previamente במקרר. לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות טריפסינציה (trypsinization) וסבוב במסחרבב (centrifugation). לאחר מכן, השביחו מחדש את משקע התאים בתוך מצע גידול ובצעו ספירת תאים בהתאם לנהלים הסטנדרטיים.לאחר ספירת התאים, העבירו את המבחנה המכילה את התאים למקדם תרביות רקמה. תמיסת המטריקס מכינה על ידי ערבוב התמיסות על קרח באחוזים הבאים: 51.3% תמיסת קולגן 0.2%, 0.5 מולרי נתרן הידרוקסיד, 8.6% ג'ל מטריקס, ו-39.9% מצע גידול. ודאו כי התמיסה הסופית היא בצבע ורוד, שכן עלייה ב-pH עלולה להוביל להיווצרות מהירה של סיבים.הנפח הסופי תלוי במספר הבארים שיש לזרע. טבלה זו מציגה את הנפחים עבור 10 שרירים. ודאו שהתאים תלוים באופן מלא (fully resuspended) והעבירו 750,000 עד 1,250,000 תאים לכל מבנה (construct) למבחנת צנטריפוגה נקייה; צנטריפוגו במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את משקע התאים בנפח קטן אך מספיק של תערובת המטריקס.לאחר שהמשקע הושעה לחלוטין, הוסיפו את התאים לשארית הנפח של תערובת המטריצה. כעת, לאחר הוצאת הפלטות שחוממו מראש מהאינקובטור, טפטפו בעזרת פיפט 0.35 עד 0.4 milliliters של תערובת התאים והמטריצה לכל חלק של ה-Velcro. לאחר מכן, התחילו לטפטף את התערובת מהמרכז, בין נקודות ההיחוס, והרחיבו אותה אל ה-Velcro.לבסוף, השתמשו ביתרת הג'ל כדי למלא את הרווח בין שני עיגוני הוולקרו וטפטפו מסביב לחלקי הוולקרו. כסו את הפיתח והשאירו אותו בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, הקישו בעדינות על הצלחת ובדקו חזותית אם הג'ל התמצק.אם כן, ניתן להעביר בעדינות את הצלחות לאנקובטור לתרביות רקמה. לאחר שעה עד שעתיים באנקובטור, יש להוסיף בעדינות על כל ג'ל 4 mL של מצע גידול שחומם מראש. לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאנקובטור לתרביות רקמה.לאחר 24 שעות, החליפו את מצע הגידול במצע דיפרנציאציה. חזרו על החלפת המצעים מדי יומיים עד שלושה ימים. סיבי שריר בוגים ומכוונים אמורים להופיע ביום השביעי של התרבית.בשלב זה, ניתן להפעיל גירוי חשמלי על הסיבים. תחילה, יש לעקר את האלקטרודות מלוח האופטיקה היונית באמצעות 70% ethanol למשך 15 דקות, ולייבש תחת קרינת UV למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את האלקטרודות המעוקרות על פיתח התרבית, תוך הבטחה שהאלקטרודות מונחות במקביל למבנה השריר כפי שמוצג בתמונה זו המציגה את תחתית הפיתח; החיצים הלבנים מצביעים על כך שהאלקטרודות מכסות את הפיתח עם המכסה שלו, והעבירו למקטורן לתרביות רקמה.חברו את המעצב (pacer) של האופטיקה היונית C בעזרת הכבלים המתאימים והחילו כאן את פרוטוקול הגירוי. נעשה שימוש במתח של 4 V/cm, בפולסים של 6 ms בתדר של 2 Hz.הגירוי החשמלי מבוצע בדרך כלל למשך 48 שעות. יש להחליף את מצע התרבית בכל 24 שעות במהלך הגירוי. תמונה זו מציגה דוגמה טיפית של מבנה שריר בוגר.גודל הרקמה הוא כ-שמונה מילימטרים באורכה, שני מילימטרים ברוחבה ו-0.5 מילימטרים בעוביה. תמונה זו מציגה דוגמה טיפית לתא מקור של שריר ברקמות שריר שלד מהונדסות. חתכים קפואים של שרירים ביו-מלאכותיים מדמים שאינם מעוררים (M bms).ביום השמיני של הדיפרנציאציה בוצע צביעה עבור sarcomeric alpha actinin שמוצג באדום, sarcomeric myosin שמוצג בירוק וגרעינים שמוצגים בכחול. הפאנלים מימין הם הגדלה של האזורים המסומנים בריבוע. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם על תאי C two C 12.תמונה זו מציגה תאי C2C12 מודלפים שנצבעו באותה דרך כפי שמוצג בתמונה האחרונה. Sarcomeric alpha actinin מוצג באדום. Sarcomeric myosin מוצג בירוק, והגרעינים מוצגים בכחול.שוב, הפאנלים מימין הם הגדלות של האזורים המסוגרים בריבוע. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על כל הרכיבים על קרח. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון quantitative PCR כדי להדגים שינויים ברמות ביטוי הגנים לאחר פיתוחן.הטכניקה סללה את הדרך עבור חוקרים ללמוד על תפקידם של כוחות מכניים במורפוגנזה של רקמות. היא סייעה גם בתכנון של מודלים הנדסיים של שריר לב. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן יצירת רקמות שריר הנדסיות באמצעות פיגום מבוסס הידרוג'ל.

engineering-skeletal-muscle-tissues-from-murine-myoblast-progenitor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

מודל murine של גירוי חשמלי neuromuscular (NMES), שיטת קליני בטוח ולא יקר, אל השרירים תא הקדמי מתואר. מודל זה יש את היתרון של שינוי התקן קליני זמינים לצורך לעורר התכווצויות שרירים ממוקד וספציפי בעכברים.

דגם Murine של אימון שרירים באמצעות גירוי חשמלי neuromuscular

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן...

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

פרוטוקול זה משתמש באלקטרופורציה כדי להציג ולבטא חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית בסיבי שריר עכברים. לאחר ההתאוששות לאחר אלקטרופורציה, הסיבים מבודדים. לאחר מכן מדמים סיבים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש את מבנה השרירים.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

כאן אנו מציגים פרוטוקול על הדרכת אוכלוסיה התא באמצעות גירויים חשמליים ומכניים הדמיית פיזיולוגיה של הלב. גירוי מכאני חשמלי זה משפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תאים שטופלו, אסטרטגיה מבטיח טיפול בתאי נוספת, מידול המחלה, והתרופות הקרנה.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

בפרוטוקול זה מתוארת שיטת ניתוח מבחנה וניתוח תפקודי לתאי גזע שריריים, המשמרת את רוב האינטראקציות שלהם עם הנישה האנדוגנית שלהם.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.

הערכת מדדים תפקודיים של בריאות שריר השלד במיקרוטיסוסות שריר השלד האנושי

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

למדו הנדסת רקמות שריר משלד ממתאי גזעית עכבריים באמצעות גירוי חשמלי ומיקרוסקופיה. שיטה זו מאפשרת יצירת רקמות מיושרות לחקר רפואה רגנרטיבית ובשר מתורבת.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

גלה סרטונים נוספים