Name: ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: חקור שיטה לבידוד חלבונים קשורים לכרומטין מרקמת לב עכברים באמצעות הומוגניזציה וצנטריפוגה במגרעת סוכרוז. ניתוח ספקטרומטריית מסה ללא תווית מספק תובנות לגבי דינמיקת הפרוטאום הגרעיני במחלות לב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vondriska המעבדה נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם של NIH וLaubisch הקרן ב-UCLA. א&quot;מ הוא נמען של ג&#39;ניפר ס וכוואלד בוגרת המלגה לפיזיולוגיה באוניברסיטת קליפורניה; HC הוא הנמען של מלגת איגוד לב אמריקנית קדם דוקטורט; MP הוא הנמען של מלגת Kirschstein רות NIH פוסט דוקטורט; וSF הוא הנמען של פרס K99-NIH.

<ol><li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li>
<li>Rumyantsev, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelations+of+the+proliferation+and+differentiation+processes+during+cardiact+myogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration.</a> Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).</li>
<li>Olson, E. N., Schneider, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+heart%3A+development+redux+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Sizing up the heart: development redux in disease.</a> Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).</li>
<li>Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+signaling+pathways+that+regulate+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy.</a> Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).</li>
<li>Fishman, M. C., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fashioning+the+vertebrate+heart%3A+earliest+embryonic+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions.</a> Development. 124, 2099-2117 (1997).</li>
<li>Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program+protects+the+stressed+heart%3A+a+strong+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail+Rev%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis.</a> Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).</li>
<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+proteins+with+potential+disease+links+found+by+subtractive+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics.</a> Science. 301, 1380-1382 (2003).</li>
<li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li>
<li>Malik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+lamin-dependent+targeting+of+novel+transmembrane+proteins+in+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).</li>
<li>Chu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chromatin+proteomics+identifies+evolutionarily+conserved+fertility+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors.</a> Nature. 443, 101-105 (2006).</li>
<li>Uchiyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+human+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of human metaphase chromosomes.</a> J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Moore, D. H., Ruska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+study+of+mammalian+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells.</a> J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).</li>
<li>Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cardiac+hypertrophy%3A+a+quantitative+ultrastructural+study+in+the+compensatory+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
<li>Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+Identify+Proteins+Interacting+with+P2X2+Ligand-Gated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels.</a> J. Vis. Exp. (27), e1178(2009).</li>
<li>Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+software+tool+for+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).</li>
<li>Kamleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+using+Orbitrap+Fourier+transform+mass+spectrometry+with+hydrophilic+interaction+chromatography%3A+a+method+with+wide+applicability+to+analysis+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).</li>
<li>Searle, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold%3A+a+bioinformatic+tool+for+validating+MS%2FMS-based+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies.</a> Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).</li>
<li>Murray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Basic+Proteins+of+Cell+Nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Basic Proteins of Cell Nuclei.</a> Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).</li>
<li>Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fractionations+of+arginine-rich+histones+from+calf+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus.</a> Biochem. J. 77, 631-636 (1960).</li>
<li>Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+methods+for+purification+of+histones+from+cultured+mammalian+cells+with+the+preservation+of+their+native+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications.</a> Nucleic Acids Res. 37, e81(2009).</li>
<li>Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+of+high-mobility-group+proteins+in+the+nucleus+and+cytoplasm+of+several+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues.</a> J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).</li>
<li>Gronow, M., Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+separation+of+the+non-histone+proteins+of+rat+liver+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei.</a> FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).</li>
<li>Mischke, B. G., Ward, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+tissue+specificity+of+chromatin-associated+proteins+in+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba.</a> Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+proteomic+analysis+of+the+human+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed proteomic analysis of the human nucleolus.</a> Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).</li>
<li>Zhao, Y., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification-specific+proteomics%3A+strategies+for+characterization+of+post-translational+modifications+using+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques.</a> Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).</li>
<li>Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+identification+of+modified+proteins+using+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS.</a> Proteomics. 10, 671-686 (2010).</li>
<li>Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-wide+proteomic+characterization+of+combinatorial+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns.</a> Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שתי שיטות עיקריות לבידוד גרעיני כבר נבדקו בעבר: 27 אחד היא טכניקת הרנס של מאחד רקמת lyophilized בממס בלתי מימי ושנייה, שינוי שאנו משתמשים כאן, מאחדים רקמה בתמיסת מלח סוכרוז / מימי אחרי בהפרש או צנטריפוגה צפיפות שיפוע. Subfractionation של הגרעינים על ידי מיצוי חומצה על דגימות רקמה הוא כלי חשוב ללימוד הכרומטין אשר שמש מאז 1960, 28 במטרתה המקורית הייתה לנתח ההיסטונים. פרוטוקולי חומצת חילוץ פותח...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> Dulbeco שינוי נשר בינוני </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> פרוטאז גלולה </td><td> רוש </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> מסננת מיקרומטר 100 </td><td> BD פלקון </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracut ultramicrotome </td><td> רייכרט </td><td></td></tr><tr><td> 100CX הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופ </td><td> JEOL ארה&quot;ב, Inc </td><td></td></tr><tr><td> זהבן </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> נוגדן H2A היסטון </td><td> סנט קרוז </td><td> SC-8648 </td></tr><tr><td> נוגדן Nucleoporin p62 </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> אדנין Nucleoנוגדן טרנספורטר גאות </td><td> סנט קרוז </td><td> SC-9299 </td></tr><tr><td> BIP נוגדן </td><td> סנט קרוז </td><td> SC-1050 </td></tr><tr><td> נוגדן טובולין </td><td> סיגמא </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> נוגדן H3 היסטון </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> נוגדן Fibrillarin </td><td> איתות תא </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 נוגדן </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1 נוגדן </td><td> תרם פישר </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> נוגדן רטינובלסטומה </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> גורם-1 מושרה היפוקסיה נוגדן </td><td> נובוס ביולוגי </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> assay החלבון BCA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> הפוך עמודת שלב </td><td> Obj החדשective </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> דפדפן BioWorks </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח הכמות של proteomes הכרומטין במחלות

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

בגרעין מתגורר בproteomes שהתפקיד קשור באופן אינטימי ביותר עם רגולציה של גנים. גרעיני cardiomyocyte יונקי בוגרים הם ייחודיים בשל אחוז הגבוה של תאי binucleated, 1 המדינה בעיקר heterochromatic של ה-DNA, והאופי שאינו מפריד-של cardiomyocyte שהופך גרעינים בוגרים במצב קבוע של interphase. בקרת שעתוק 2 במהלך פיתוח ו מחלה נחקרה היטב באיבר זה, אבל מה שנשאר 3-5 נחקר יחסית היא התפקיד שמלא את החלבונים האחראים על אריזת DNA וביטוי הגרעיניים, וכיצד החלבונים הללו לשלוט שינויים בתוכניות תעתיק המתרחשים במהלך מחלה. 6 בפתחו עולם, מחלות לב היא סיבת מספר אחת לתמותה עבור גברים ונשים כאחד. 7 תובנה על איך חלבונים גרעיניים ישתפו פעולה על מנת להסדיר את ההתקדמות של מחלה זו היא קריטי לקידום הטיפול o הנוכחיתptions. ספקטרומטריית מסה היא הכלי האידיאלי לטיפול בשאלות אלו שכן היא מאפשרת ליאור משוחד של כימות וProteome היחסי הגרעינית לכיצד השפע של חלבונים אלו שינויים עם מחלה. אמנם יש כבר כמה מחקרי proteomic למתחמי יונקים גרעיניים חלבונים, 8-13 עד לאחרונה 14 חלו רק מחקר אחד בודק Proteome הגרעיני הלב, והוא התייחס לכל הגרעין, במקום לחקור Proteome ברמה של תת מדורים גרעיניים 15. במידה רבה, מחסור זה בעבודה נובע מהקושי של בידוד גרעיני לב. גרעיני לב מתרחשים בתוך מנגנון יקטין מיוזין נוקשה וצפוף שאליו הם מחוברים באמצעות הרחבות מרובות מreticulum endoplasmic, במידה שמשנה את התכווצות myocyte הצורה הכללית שלהם. 16 בנוסף, cardiomyocytes הם 40% לפי נפח 17 המיטוכונדריה שnecessitaTES העשרת הגרעין מלבד האברונים האחרים. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעשרה גרעינית לב וחלוקה נוספת לתאים ביולוגיים רלוונטיים-. יתר על כן, שיטות פירוט נתיחת תווית חינם כמותית המונית spectrometric של שברי טכניקות המתאימים לניסויים בגוף חיים במודלים שונים של בעלי חיים ומערכות איברים בי תיוג מטבולית הוא לא ריאלי אלה.

איור 4 מדגיש את התועלת של צורה זו של כימות יחסי. מוצגים בלוח השמאלי הן הפסגות הבודדות monoisotopic פפטיד (מעולף מעכברים שונים), שנקבעו כלשייכת לHMGB1 החלבון (מזוהה באמצעות חיפוש באתר). כל שיא, למעשה כרומטוגרף יוני חילוץ לפפטיד הנתון, מגיע מעכבר אחר. הקבוצות מייצגות את שלוש מדינות שונות פיסיולוגיות: היפרטרופיה בסיס, לב ואי ספיקת לב, עם שלוש ביולוגיים משכפל לכל קבוצה. על ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה, שפע יחסי יכול להיות מחושב. בפנל האמצעי הממוצע של שכיחות אלה מוצג....

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה אחרים<em&gt; In vivo</em&gt; מודלים של מחלות אנושיות.

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

בגרעין נמצאים הפרוטאומים שפונקציותיהם קשורות באופן ההדוק ביותר לבקרת גנים. גרעיני תאי שריר לב (cardiomyocytes) של יונקים בוגרים הם ייחודיים בשל...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד חלבונים הקשורים לכרומטין מלב של עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי הומוגניזציה של הלב ולאחר מכן בידוד גרעיני לב באמצעות מדרג צפיפות של סוכרוז. לאחר מכן, נפרדת הפלזמה הגרעינית (nuclear plasm) מפרקציית הכרומטין.לאחר מכן, חלבונים מופקים ממשקע הכרומטין כדי להעשיר את תכולת החלבונים הקשורים באופן רופף ל-DNA. לבסוף, חלבונים מופקים ממשקע כרומטין אחר כדי להעשיר את תכולת החלבונים הקשורים באופן הדוק ל-DNA. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המציגות את מאפייני הפרוטאומ הגרעיני תחת תנאים פיזיולוגיים שונים באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסות כמותי ללא סימון (label-free).שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הלב, כגון האופן שבו עיצוב מחדש של הכרומטין תורם להיפרטרופיה של הלב ולאי-ספיקת לב. לאחר הקרבת עכבר בוגר והוצאת הלב, יש לשטוף אותו ב-PBS קר מאוד. לאחר מכן, יש להניח אותו במבחנה עם 2 mL של באפר ליזיס המכיל תערובת מעכבי פרוטאז ופוספטאז, ולבצע הומוגניזציה.סננו את הליזאטים דרך מסננת של 100 micron ואספו את התסנין למבחנה של 1.5 milliliter; מרגע זה ואילך, אלא אם צוין אחרת, שמרו את הדגימה על קרח. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 4,000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. אספו את הסופנאט המכיל את הציטוזול ואחסנו אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות Celsius.יש לבצע רספנדציה של המשקע ב-200 µL של תמיפת ליזיס. יש להוסיף 1 mL של תמיפת סוכרוז למבחנה חדשה, ולהניח בעדינות את המשקע שעבר רספנדציה מעל שכבת הסוכרוז באמצעות פיפטת העברה. יש לסבב בצנטריפוגה במהירות של 5,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. יש להסיר את השכבה הדקה שמעל וכן את שכבת הסוכרוז, המכילה את הממברנה.שטפו את המשקע הנותר המכיל את הגרעינים עם 200 µL של P-B-S-E-D-T-A קר מאוד, השאירו את המשקע המכיל את הגרעינים ב-200 µL של תמיסת חילוץ דטרגנט (detergent extraction buffer), ובצעו וורטקס לדגימה פעמיים למשך 10 שניות בכל פעם. הניחו את הדגימה על קרח למשך 10 דקות ולאחר מכן צנטריפוגו במהירות של 13,000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. הסירו את העלייה (supernatant) המכילה חלבוני נוקלאופלזמה ואחסנו אותה בטמפרטורה של 80- °C.שטפו את המשקעים ב-PBSEDTA קר מאוד והמיסו אותם מחדש ב-300 µL של באפר Tris, SDS-EDTA. בצעו סוניקציה לדגימה שלוש עד שש פעמים למשך 10 שניות בכל פעם. כדי לפרק את ה-DNA, תוך שמירה על הדגימה על קרח בין הסוניקציות, סובבו בצנטריפוגה ב-13,000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.שמרו את העליון (supernatant) המכיל את החלבון המבודד ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס כדי להעשיר חלבונים כגון היסטונים, הקשורים היטב ל-DNA. בצעו פרקציונציה נפרדת לבידוד כרומטין, החל מלב של חולדה בוגרת מבודד או מתאי שריר לב (cardiomyocytes) של חולדה PARPs. רססו (Triturate) את משקע הכרומטין ב-400 µL של חומצה גופרתית 0.4 N וערבבו במערבל Vortex. כדי להסיר גושים, סובבו את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או למשך לילה; לאחר האינקובציה, הסירו את השאריות הגרעיניות על ידי ספינטציה ב-16,000 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.העבירו את הנוזל העליון למבחנה נקייה והוסיפו לדגימה 132 µL של חומצה טריכלוראצטיתתית בטיפות. הפכו את המבחנה מספר פעמים והדגירו על קרח למשך 30 דקות. לאחר סבוב בצנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון והשתמשו באצטון קר מאוד כדי לשטוף בעדינות את המשקע המכיל היסטונים, ולאחר מכן סבבו שוב בצנטריפוגה.שוב, חזרו על השטיפה באצטון וייבשו את המשקע באוויר לפני התלייתו מחדש ב-100 µL של באפר Triss S-D-S-E-D-T-A. השתמשו ב-Triss בריכוז 1 M כדי לכוון את ה-pH ל-8.בצע סוניקציה לדגימה באמבט מים למשך 15 דקות. אחסן את הדגימה בטמפרטורה של 80- °C. השתמש בספקטרומטריית מסות לביצוע אנליזות לקביעת רמת הטוהר ולזיהוי החלבונים המוצגים כאן.כרומטוגרמות של יונים מופרדות (extracted ion chromatograms) חופפות עבור פפטיד בודד שמופה לחלבון HMGB1. כל כרומטוגרמה מקורה מדגימת כרומטין שונה וסומנה בצבע המייצג את המצב הפיזיולוגי של העכבר ממנו נלקחה הדגימה. שלוש חזרות ביולוגיות נותחו עבור כל אחד מהמצבים הפיזיולוגיים, היפרטרופיה לבבית בסיסית ואי-ספיקת לב, כאשר כל דגימה נותח פעמיים, מה שהניב סך של 18 כרומטוגרמות.על ידי אינטגרציה של השטח מתחת לעקומה, ניתן לקבוע את השפעיות היחסית עבור כל חזרה. בלוח זה, שש החזרות הובאו לממוצע עבור כל אחד משלושת המצבים הפיזיולוגיים כדי לקבל ערכי שפעיות כוללים. ניתוח זה מראה בבירור כי השפעיות של HGB one משתנה במהלך המחלה, כפי שניתן לראות כאן.ספקטרום הפרגמנטציה של פפטיד זה מאשר את רצף חומצות האמינו שלו ומאפשר למפות אותו לחלבון H MG B one. לעומת זאת, כימות של פפטיד שונה מחלבון ההיסטון H four מראה כי השפעות שלו אינה משתנה עם המחלה. אנו יכולים לנתח את השחזוריות של השינויים בשפע הפפטידים שנצפה ביניהם במצבים הפיזיולוגיים השונים באמצעות ניתוח סטטיסטי.ראשית, השפעות של כל הפפטידים שזוהו בכל שכפול נבדקים באמצעות anova, ולאחריה ניתוח רכיבים ראשיים או PCA. ההצמדה (clustering) של השכפולים הטכניים והביולוגיים בגרף זה מאשרת כי שינויי השפעות שזוהו באמצעות ספקטרומטריית מסות הם עקביים וניתנים לשחזור בין מצבי המחלה השונים. basal בכחול, hypertrophy באדום ו-failure בירוק; בעלת חשיבות שווה לכימות ולשחזור התוצאות היא הכיסוי המוגבר של הפרוטאומה הגרעינית שהתאפשר הודות לפרקטוריזציה של תתי-תחומים גרעיניים.איור זה ממחיש כי ניתוח של הגרעין השלם לבדו אינו מצליח לחשוף אפילו את רוב החלבונים הגרעיניים שזוהו כאשר משלבים ניתוחים בודדים של המדורים הנפרדים. יתרה מכך, החפיפה המתונה בין הפראקציות השונות מדגימה את הרלוונטיות הביולוגית של בחינת מדורים אלו באופן פרטני לקבלת תובנות נוספות על תפקוד הגרעין ועל ויסות גנים. לבסוף, היכולת לבצע פראקציונציה ספציפית של כרומוזומים שהופקו בחומצה או שהופקו בדטרגנט מעשירה חלבונים מבניים מרכזיים של הכרומטין כגון היסטונים, ובכך מאפשרת ניתוח מדויק יותר בספקטרומטריית מסות של קבוצת חלבונים ללא צורך בנוגדנים ספציפיים לכל וריאנט ואיסופורם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על דגימות שיינתחו בספקטרומטר המסות נקיות מזיהום של קרטין.דבר זה חשוב במיוחד בשלבים הבאים לאחר בידוד החלבון.

quantitative-analysis-of-chromatin-proteomes-in-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנו מציגים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נוהל לניתוח הגנום כולו מיקום isoforms חלבונים שונים בתחום היסטון מחייב. אנו מיישמים אותו לניתוח שבב Seq לזהות מטרות demethylase היסטון KDM5A/JARID1A/RBP2.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

כאן, אנו מתארים, אופטימיזציה תפוקה גבוהה שבב-רצף פרוטוקול ו ניתוחים חישובית צינור מצפני הגנום כולו כרומטין דפוסי המדינה בין קפוא גידול רקמות שורות תאים.

פלטפורמה משולבת עבור מיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית באמצעות שבב בתפוקה גבוהה-רצף ברקמות הגידול

זוהי שיטה לזיהוי חלבונים אינטראקציה-DNA הרומן ב לוקוסים יעד ספציפיות, בהסתמך על רצף ספציפי לכידתו של כרומטין תפור עבור ניתוחים פרוטיאומיה מבנית עוקבות. ידע מוקדם לגבי פוטנציאל מחייב חלבונים, ולא תא שינויים נדרשים. בתחילה פותח עבור שמרים, הטכנולוגיה כבר עכשיו מותאם בתרבית של תאים.

עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות השלכות פונקציונליות של משתנים שאינם קידוד המזוהים על ידי לימודי הגנום הרחב (GWAS) באמצעות אינטראקציות תלת ממדיות של כרומטין.

מיפוי מחלת אלצהיימר משתנים גנים היעד שלהם באמצעות ניתוח חישובית של תצורת כרומטין

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

באמצעות PCR כמותי, אנו מדגימים כיצד המודל ומבוססת חומוס CAM ניתן להשתמש כדי לנתח את כמותית גרורות של תאים סרטניים אנושיים לאיברים רחוקים.

ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות

חקור שיטה לבידוד חלבונים קשורים לכרומטין מרקמת לב עכברים באמצעות הומוגניזציה וצנטריפוגה במגרעת סוכרוז. ניתוח ספקטרומטריית מסה ללא תווית מספק תובנות לגבי דינמיקת הפרוטאום הגרעיני במחלות לב.

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

גלה סרטונים נוספים