Name: גידול והזרקה של Manduca סקסטה זחלים להערכה ארסית קטריאלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: חקור הערכת ארסיות חיידקית בזחלי Manduca sexta באמצעות הזרקה ישירה לחלל הדם. שיטה זו מאפשרת ניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן ומספקת כלי לניהול מזיקים חקלאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של גודריץ-בלייר המעבדה: סמנתה אורצ&#39;רד, קימברלי קאולס, ארין הרברט-טראן, גרג ריצ&#39;רדס, מייגן נרד, וYoungjin פרק על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק קרן המדע הלאומי IOS-0950873 והמכונים הלאומיים לבריאות NRSA המלגה FAI084441Z.

1. עיקור ביצת חרקים וגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדיאטה של 15 גרם מעוקר הראשון של אגר ספק ב900-1,000 המ&quot;ל H 2 O. מייד לאחר מעוקר, לערבב עם דיאטה 166 גר &#39;ניבט חיטה ותערובת היטב במעבדת בלנדר. יוצק לצלחת (או צלחות) להתקרר, ואז להעביר לדיאטת רדיד אלומיניום, עוטף היטב, ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הגעתו, לעקר מ &#39; ביצי סקסטה עם 250 מ&quot;ל של 0.6% בתמיסת כלור ל2-3 דקות בבעל זכוכית מסנן ומכשירים ירמסו עם נייר סינון 90 מ&quot;מ, תוך ערבוב מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ואקום לניקוז תמיסת כלור וביצי 3-4 פעמים לשטוף עם 250 המ&quot;ל סטרילי המזוקק H 2 O לשטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים לנייר חדש 90 מ&quot;מ מסנן להציב מכסה צלחת הפטר ולאפשר להם להתייבש עד שהם כבר לא ביחד מקל (כ 20-30 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים לתחתית מכלי פלסטיק עם דיאטת חרקים, צבת כ 40 ביצים בכל מכולה(איור 1 א). ביצים מופרדות מדיאטה על מנת למנוע זיהום פטרייתי לחות מושרה. לשמור על ביצים על 26 ° C עם אור 16 שעות: 8 השעות photoperiod הכהה. ביצים תהיינה להאיר לצבע צהוב לבן לפני הבקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הבקיעה היא מוחלטת, להעביר בזהירות כ 25 זחלים לכל מכולות חדשות עם דיאטה בתחתית (1B איור). חשוב לאסוף את כל זחל על ידי הקרן השחורה הארוכה באמצעות מלקחיים, כדי למנוע פגיעה בם במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים השבירים שלהם. דגירה עבור 2 ימים כאמורים לעיל. בעוד מות זחל הוא יוצא דופן בשלב זה, חלק הזחלים מתים או, סבירים יותר, ננסי התפתחותית אפשר לראות. חרקים כאלה צריכים להיות מחוץ למחקר נוסף והקריבו על ידי הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מהתנהגויות קניבליות, זחלי העברה למכלים נפרדים עם חתיכות קטנות של אוכל (התרשים 1C) ודגירה כאמורה לעיל. לעקוב אחר התפתחות חרקים, צואת החלפת מזון וניקוי ouלא של מכולות בכל יום אחר עד שהם עוברים את נשירת הזחל השלישית (בדרך כלל 6-9 ימים לאחר בקיעה). זה שלב ה 4 instar הזחל, המתאפיין במראה של crochets קרס השחור על כל גדולת proleg ומוגברת של פסים לאורך גוף החרק (1D איור). הזחלים עשויים להשתנות במידה ניכרת בגודלה, אך בדרך כלל שוקלים 0.15-0.4 גרם עם כניסתו לבמת instar -4. זחלים בגודל דומה צריכים להיבחר להזרקה. </li></ol> 2. הכנה של חיידקים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זן החיידקים (הים) להיבדק על פי נהלים הרגילים לשלב הצמיחה ברצונך לבדוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 μl הגלולה של כל זן חיידקים שנבדק על ידי ספינינג עבור 2 דקות בmicrocentrifuge ב13000 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend בפוספט 1x סטרילי 1 המ&quot;ל נאגרו מלוחים (PBS) וגלולה שוב כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב 0.5 המ&quot;ל סטרילי 1x PBS וmeaבטוח הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה. לדלל את כל ההשעיות לאותו OD, במידת צורך. תקשורת צמיחה סטריליים עשויה לשמש גם לresuspension תא ודילול במקום 1x PBS, אם תרצה בכך. </li></ol> 3. הזרקה של 4 זחלי Instar ה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים סידוריים 10-קיפול של זן החיידקים הראשון ב6 בארות של צלחת 96-microtiter גם ב1x PBS סטרילי, באמצעות קצה פיפטה טריה עבור כל דילול (איור 2 א). הנפח הסופי של השעית תא בכל אחד גם צריך לחרוג הנפח נדרש להזרקה (10 μl לחרקים) בתוספת 20 μl לצלחת הבידוד (ראה שלבים 3.2 ו -3.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl ספוט כל במשך 5 דילולים -2 (10 עד 10 -6) בחלק העליון של צלחת פטרי המכיל מדיום גידול מתאים. הטה את הצלחת כך שהכתמים התפשטו למרכז (איור 2 ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דיאטת חרקים וצואה וחרקי מקום במכולות על קרחכ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מחט המזרק על ידי שטיפת 3 פעמים כל אחד ב 2 צינורות של אתנול 70-100%, ואחריו צינור אחד H 2 O סטרילי (האיור 2C). הנפח נוזלי חייב להיות מספיק כדי להטביע את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את המתלים הסלולריים לדלל תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. בהתאם לבידוד הרצוי, לצייר 10 μl מmicrotiter המתאים היטב (האיור 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית משטח החרקים עם אתנול 95%, ולהזריק את השעית תא 10 מ&quot;ל לחרקים בזווית (פחות מ 45 מעלות) מאחורי אחד מprolegs הבטן. יש להיזהר שלא לנקב את המעי ולהזריק את התוכן בדיוק מתחת לשכבת האפידרמיס (2E איור). בעוד שחלק אובדן hemolymph (נוזל שקוף, ירוק כחול) הוא נורמלי, חומר חלקיקים ונוזל צהוב יוצא מאתר ההזרקה מעיד על לנקב מעי. במקרה זה, להקריב את החרק ולהשיג זחל חדש מחדשלמקם אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6 לכל חרק שנותר בקבוצת הזריקה הראשונה. מחט העיקור אינו הכרחי בין כל חרקים הזריקו עם אותו הדילול והזן של חיידק אלא אם זיהום מתרחש. לחלופין, מנפק חוזר עשוי לשמש לעקביות רבה יותר בנפח הזרקה בין דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה כל חרקים במתח הראשון של חיידקים, חזור על שלב 3.2, הפעם ייכון השעיות סלולריות באמצע הצלחת ולתת להם לזרום לכיוון החלק התחתון (האיור 2F). דגירת צלחות בטמפרטורה המתאימה ולסמוך מושבות למנות בידוד. צעד 2 ציפוי זה משמש כדי לוודא שהדגימות אינן מזוהמות במהלך תהליך ההזרקה, שכן דבר יגרום למספרי מושבה שונים בין platings הראשון והשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 עד 3.8 לכל זן של חיידק בניסוי. לבסוף, להזריק 3-5 חרקים עם 1x PBS סטרילי באמצעות sterמחט איל כקבוצת ביקורת שלילית. דגירת חרקים ב 26 ° C עם אור 16 שעות: 8 השעות photoperiod הכהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקח על הישרדות חרקים לאורך זמן לאחר הזרקה. מות חרק מאופיין כחוסר תנועה רצונית על גירוי. חרקים מציגים לעתים אובדן תיאבון, שלשולים (צואה מימית, צהובה), ו / או אובדן מים (&quot;זעה&quot;) במהלך זיהום לפני המוות; מאפיינים אלו עשויים להיות ראויים לציון גם כן. </li></ol>

<ol><li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li>
<li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li>
<li>Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li>
<li>Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li>
<li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+histidine+kinase%2C+EnvZ%2C+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li>
<li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li>
<li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li>
<li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li>
<li>Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project">http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project</a> (2012).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li>
<li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li>
<li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li>
<li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li>
<li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism%2C+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li>
<li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus%3A+two+roads+to+the+same+destination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li>
<li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modulation+of+immunity%3A+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li>
<li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ההזרקה הישירה של מ &#39; זחלי סקסטה עם חיידקי entomopathogenic, כפי שמתוארים כאן, משמשים כאמצעי פשוט ויעיל לניתוח ארסיות חיידקים. השיטה היא גם ישימה מאוד כדי להתאים לנושאים ניסיוניים שונים ו / או תנאים. חיידקים יכולים להיות מוכנים בדרכים קודמות להזרקה שונות. במקרה של X. nematophila, תאים מסוג בר שגודלו בוריא-Bertani בינוני מזין עשיר (LB) לשלב אמצע יומן הוא בדרך כלל ארסי והורג את רוב או את כל החרקים בתוך 30 שעות לאחר הזרקה. תאים בשלב נייח לעתים קרובות לקח...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 90 נייר סינון מ&quot;מ </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> בעל זכוכית מסנן </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca סקסטה ביצים </td><td> אספקת קרוליינה הביולוגית </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> דיאט עש הצועני + אגר </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5 גר &#39;. מכולות ומכסי פלסטיק </td><td> חברת גביע יחיד </td><td> URC55-0090-0090 Pl4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 גר &#39;. מכולות ומכסי פלסטיק </td><td> DART מכולות תאגיד </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 המ&quot;מ NaCl, 2.7 mM KCl, 8 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 1.46 mM KH 2 4 ת.ד., 7.4 pH </td></tr><tr><td> מזרק </td><td> המילטון </td><td> 80208 </td><td> 30 מד, 0.375 &quot;אורך, סגנון נקודה 2 </td></tr></tbody></table>

גידול והזרקה של<em&gt; manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca סקסטה, הידוע בכינויו hornworm הטבק, נחשבת למזיק חקלאי משמעותי, האכלה על צמחי solanaceous כוללים טבק ועגבנייה. רגישותו של מ &#39; זחלי סקסטה למגוון מיני entomopathogenic חיידקי 1-5, כמו גם השפע של מידע הזמין לגבי מערכת חיסון של חרק 6-8, ואת רצף הגנום עד 9 להפוך אותו לאורגניזם מודל טוב לשימוש בחקר אינטראקציות מארח חיידק במהלך פתוגנזה. בנוסף, מ &#39; זחלי סקסטה גדולים יחסית וקלים לתפעל ולתחזק במעבדה היחסית למיני חרקים רגישים אחרים. ממדיהן גדולים גם מאפשרים מיצוי רקמה / hemolymph יעיל לניתוח של תגובת המארח לזיהום. השיטה שהוצגה כאן מתארת ​​הזרקה הישירה של חיידקים לhemocoel (חלל דם) של מ &#39; זחלי סקסטה. גישה זוניתן להשתמש בו כדי לנתח ולהשוות את המאפיינים הארסיים של מינים שונים של חיידקים, נקע, או פשוט על ידי מוטציות ניטור הזמן למות חרק לאחר הזרקה. שיטה זו פותחה ללמוד פתוגניות של Xenorhabdus ומיני Photorhabdus, אשר בדרך כלל לקשר עם וקטורים נמטודות כאמצעי לזכות כניסה לחרקים. נמטודות Entomopathogenic בדרך כלל להדביק זחלים דרך עיכול טבעי או פתחי נשימה, ולשחרר את תוכנם לתוך החיידקים סימביוטיים hemolymph החרקים (דם) זמן קצר לאחר מכן 10. שיטת ההזרקה המתוארת כאן עוקפת את הצורך בוקטור נמטודות, ובכך מתירה את ההשפעות של חיידקים ונמטודות על החרקים. שיטה זו מאפשרת לספירה מדויקת של חומר מדבק (תאים או חלבונים) בבידוד, דבר שאינו אפשרי בשיטות קיימות אחרות לניתוח entomopathogenesis, כוללות לסחוב 11 ומבחני רעילות אוראליים 12 <eמ &#39;&gt;. כמו כן, מבחני רעילות אוראליים לטפל הארסיות של רעלים מופרשים הציגו לתוך מערכת העיכול של זחלים, ואילו בשיטת ההזרקה הישירה כתובות הארסיות של inocula כל התאים. התועלת של שיטת ההזרקה הישירה כפי שתואר כאן היא לנתח פתוגנזה חיידקים על ידי ניטור תמותת חרקים. עם זאת, שיטה זו יכולה בקלות להיות מורחבת לשימוש בחקר ההשפעות של זיהום על מ &#39; מערכת חיסונית של סקסטה. החרקים מגיבים לזיהום באמצעות שתי תגובות הומורלית ותאיות. התגובה הומורלית כוללת זיהוי תבניות חיידקים הקשורים והפקה הבאה של פפטידים שונים מיקרוביאלית 7; הביטוי של גני מקודדי חלבונים אלה יכול להיות במעקב לאחר זיהום ישיר באמצעות RNA חילוץ וכמותית PCR 13. התגובה התאית לזיהום כרוך nodulation, אנקפסולציה, וphagocytosis של חומרים מזהמים על ידי hemocytes 6 </sup&gt;. כדי לנתח את התגובות האלה, חרקים מוזרקים יכולים להיות גזורים ומדמיינים ידי מיקרוסקופיה 13, 14.

דוגמה מייצגת של assay תמותת חרקים מתואר באיור 3. בניסוי זה, חרקים הוזרקו כ 50 יחידות להרכיב מושבה (CFU) של כל אחד מסוגים פרא (ATCC19061) או זן מוחלש מוטציה (LRP 13) של Xenorhabdus nematophila גדל שלב יומן האמצע (n = 6 חרקים למתח). חרקים נצפו במשך כ 72 שעות, ואחוזים מהחרקים הזריקו עדיין בחיים בכל timepoint נרשמו. במקרה זה, הזן נחלש הציג עיכוב ברור בהריגת חרק; הזן פראי הסוג נהרג כל 6 הזחלים בתוך לאחר הזרקת 30 שעות, לפני מותו של כל זחל מו...

השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלי חרקים.<em&gt; מ סקסטה</em&gt; הוא חרק זמין מסחרי ונחקר היטב. לכן, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה לניתוח אינטראקציות מארח בקטריאלי מנקודת המבט של אחד או שני בני הזוג.

גידול והזרקה של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

Manduca sexta, המוכר בדרך כלל כתולעת קרן הטבק, נחשב למזיק חקלאי משמעותי, הניזון מצמחים מסביבת הסולנאיים (solanaceous plants), כולל טבק ו...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך פתוגניות חיידקית כנגד זחלי חרקים תוך שימוש ב-manduka seca כאורגניזם מודל. זאת מושג תחילה על ידי גידול זחלי החרקים מביצים שעברו סטריליזציה עד לשלב הפיתוח של הגוזל הרביעי (fourth instar). בשלב השני, דגימות החיידקים מוכנות להזרקה.בשלב הבא, מזריקים את החיידקים לזחלי *Manduka seca* בשלב הגוזל הרביעי (fourth instar). בשלב הסופי, עוקבים אחר מות החרקים לאורך זמן לאחר ההזרקה. לבסוף, נרשם הזמן עד למות החרק והוא משמש להערכת העוצמה החיידקית (virulence).שיטה זו יכולה לסייע בטיפול בהיבטים מרכזיים בתחום הסימביוזה, כולל גילוי פתוגנים חדשים של חרקים וקביעת הבדלים באלימות (virulence) בין מינים או זנים חיידקיים. התחילו תחילה באוטוקלאב של 15 גרם של Auger ב-900 עד 1000 מיליליטר של מים. מיד לאחר האוטוקלאב.ערבבו את המקדח עם 166 גרם של תזונת נבטי חיטה. בבלנדר מעבדתי, שפכו את תזונת החרקים המעובדת לתוך צלח. לאחר הקירור, העבירו את התזונה מהצלח לחתיכת נייר אלומיניום.עטפו זאת היטב ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. עם הגעתם, הניחו את ביצי ה-M sex בתוך מתקן סינון זכוכית ובקולב ואקום עם נייר סינון של 90 מילימטר. לאחר מכן, שפכו 250 מיליליטר של תמיסת אקונומיקה בריכוז 0.6% על הביצים למשך שתיים עד שלוש דקות, תוך ערבוב מדי פעם.כעת הפעילו את הוואקום כדי לנקז את תמיסת האקונומיקה, ולאחר מכן שטפו את הביצים שעברו עיקור שלוש עד ארבע פעמים ב-250 milliliters של מים מזוקקים סטריליים בכל שטיפה. בשלב הבא, הניחו פיסת נייר סינון טריה בגודל 90 millimeter במכסה של פטרי, והעבירו את הביצים אל נייר הסינון כדי לאפשר להן להתייבש במנדף זרימה עד שלא ידבקו יותר זו לזו. כעת הניחו את מזון החרקים שהוכן לאחרונה מעל פקק גומי מאובטח במספר מכלים מפלסטיק, והעבירו כ-40 ביצים לכל מכל, תוך הפרדת הביצים מהמזון כדי למנוע זיהום פטרייתי הנגרם מרטיבות.שמרו את הביצים בטמפרטורה של 26 degrees Celsius עם מחזור תאורה של 16 שעות אור ושמונה שעות חושך. הביצים יבהירו לגוון לבן-צהוב לפני הבקיעה, וזאת כאשר תהליך הבקיעה יושלם. בעזרת פינצטה, הרימו כל אחת מהזחלים באמצעות הקרן השחורה הארוכה, והעבירו בזהירות כ-25 זחלים לכל מיכל חדש המכיל תזונה בתחתיתו.דגרו את ה larvae למשך יומיים תחת אותם תנאים כפי שבוצע עבור הביצים; בעוד שמוות של larvae הוא נדיר בשלב זה, ייתכן שייראו larvae מתים או, סביר יותר, larvae עם עיכוב התפתחותי. כעת, העבירו את ה larvae למכלים אינדיבידואליים עם חתיכות קטנות של מזון כדי למנוע התנהגות קניבליסטית, ודגרו אותם שוב. החליפו את המזון ונקו את הצואה מהמכלים מדי יומיים, עד שהחרקים יעברו את שלב ההגחת השלישי של ה larvae.הנשירה הזחלית השלישית היא שלב הזחל של הגוזל הרביעי, המתאפיין בהופעת קרושות (crochets) שחורות דמויות קרס בכל פרולה (prole) ובבליטות מוגברת של הפסים לאורך גוף החרק. לאחר גידול זני החיידקים הרצויים לבדיקה, סובבו 500 µL מכל אחד מזני החיידקים במשך שתי דקות במיקרו-צנטריפוגה ב-17,000 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את המשקעים ב-1 mL של PBS סטרילי תחת אותם תנאים.לאחר השעיית התאים ב-0.5 mL נוסף של PBS סטרילי, מדדו את הצפיפות האופטית של התוhängים. לפני תחילת ההזרקות, הכינו שישה דילולים סדרתיים של פי 10 עבור זן החיידקים הראשון ב-PBS סטרילי בתוך פלטת מיקרוטיטר של 96 בארות, תוך שימוש בטיפ פטה רענן לכל דילול. כעת, טפטפו 10 µL מכל דילול, מ-10⁻² עד 10⁻⁶, לאורך החלק העליון של פטריה המכילה את מצע הגידול המתאים. לאחר מכן, הטו את הפלטה כך שהטיפות יתפשטו לעבר המרכז.בשלב הבא, לאחר הסרת מזון החרקים והצואות, הניחו את מיכלי החרקים על קרח למשך כחמש דקות כדי לקרר את החרקים. שטפו מחט של מזרק שלוש פעמים בכל אחת משתי מבחנות המכילות 70% עד 100% ethanol, ולאחר מכן במבחנה אחת של מים סטריליים. לאחר מכן, השתמשו ב-hemo cytometer כדי לכמת את תרחיפי התאים המדוללים תחת מיקרוסקופ.בהתאם לאינוקולום הרצוי, שאבו 10 µL מהבאר המתאימה במיקרוטיטר. לאחר מכן, נגבו את פני השטח של החרק המיועד להזרקה באמצעות 95% ethanol. השלב המאתגר ביותר הוא החזקת החרק בתנוחה המתאימה להזרקה, תוך כדי תפעול המחט והקפדה על אי-ניקוב מערכת העיכול של החרק.כמו כן, הקפידו לעבוד במהירות כדי שהחרק לא יתחמם ויתחיל להתפתל בזמן שאתם מחזיקים אותו להזרקה. הזרקו את 10 µL של תרחיף התאים אל החרק בזווית של פחות מ-45 מעלות, מאחורי אחת הרגליים הבטניות. תוך הקפדה שלא לנקב את מערכת העיכול, הזרקו את התוכן ממש מתחת לשכבת האפידרמיס.לאחר הזרקת זן החיידקים הראשון לכל חרק, פזרו שוב את הדילולות מ-10 to minus two ועד 10 to minus six, הפעם במרכז הצלחת. הניחו להן לזרום לכיוון תחתית הצלחת. כעת דגרו את הצלחות בטמפרטורה המתאימה, ולאחר מכן ספרו את המושבות כדי לקבוע את כמות האינוקולום.לאחר חזרה על תהליך הדילול, הזריעה וההזרקה עבור כל זן של חיידקים, הזרק PBS סטרילי לשלושה עד חמישה חרקים עבור קבוצת הביקורת השלילית. לאחר מכן, דגור את כל החרקים בטמפרטורה של 26 °C ובמחזור תאורה של 16 שעות אור ושמונה שעות חושך. לבסוף, עקב אחר הישרדות החרקים לאורך זמן לאחר ההזרקות; החרקים מראים לעיתים קרובות אובדן תיאבון, שלשולים מימיים וצהובים, הפרשות ו/או איבוד נוזלים במהלך הזיהום לפני המוות.מוות של חרק מוגדר כהיעדר תנועה רצונית בעקבות גירוי. במבחן זה, הוזרקו לחרקים כ-50 יחידות יוצרות מושבה (colony forming units) של זן בר או של זן מוטנטי מוחלש של Xer Haus NLA שגודלו עד לשלב הלוגריתמי האמצעי. החרקים נבחנו במשך כ-72 שעות, ואחוז החרקים המוזרקים שנותרו בחיים בכל נקודת זמן נרשם.בניסוי זה, הזן המוחלש הפגין עיכוב ברור בהריגת החרקים, בעוד שהזן מסוג הבר (wild type) הרג את כל ששת הזחלים בתוך 30 שעות לאחר ההזרקה, לפני מותם של הזחלים המודבקים במוטנט. הנתונים נבדלו באופן מובהק סטטיסטית בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון מיצוי RNA ותגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת כמותית (quantitative real-time polymerase chain reaction), על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון קביעה אם החיידק מסוגל או לא להשפיע על התגובה החיסונית של החרק.

rearing-injection-manduca-sexta-larvae-to-assess-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים,...

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

זיהום haemocolic אוראלי ותוך של זחלים של עש השעווה הגדולה...

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

מקור: ברנוט, א., ואח', פענוח והדמיה של פתוגנזה ודימות של מיקובקטריום אבססיסוס בעוברי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2015).הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לבידוד וכימות של Mycobacterium abscessus מעובר דג זברה נגוע. ההליך כולל המתת חסד של עוברים, ניתוק רקמות והומוגניזציה לשחרור החיידקים, ולאחר מכן צנטריפוגה והשעיה מחדש בבופר סורפקטנטים. לבסוף, ההשעיה החיידקית מדוללת באופן סדרתי, מצופה על אגר עם תוספת אנטיביוטיקה, ומודגרת כדי לאפשר יצירת מושבות וכמות.

בידוד וגידול חיידקים מעוברי דגי זברה להערכת עומס זיהום

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס מודל זיהום Mycobacterium bovis בזחלים של עש השעווה הגדול, Galleria mellonella. זן ביולומינסנטי של Mycobacterium bovis BCG מוזרק לתוך המולימפה של הזחל כדי ליצור זיהום, והביולומינסנציה נמדדת במרווחי זמן מוגדרים מראש כדי לחקור את התקדמות הזיהום.

טכניקה לביסוס מודל זיהום חיידקי בזחלי חרקים

סרטון זה מציג את מדידת העומס החיידקי in vivo באמצעות Bacillus Calmette-Guérin, BCG, זחלי חרקים נגועים בלוקס. התהליך כולל הומוגניזציה של הזחל, טיפול במצע לוציפראז ומדידת ביולומינסנציה כדי לקבוע יחידות אור יחסיות המתואמות עם עומס חיידקי.

מדידת נטל In Vivo של חיידקים המבטאים לוציפראז בזחל חרקים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מודל הניהול אוראלי בעזרת הזחלים mellonella גלריה (galleria) , כיצד לאפיין המושרה תגובות מערכת החיסון המולדת. באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ניסיון מעשי תהיה אפשרות להשתמש mellonella ג שיטת פיטום.

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים בודדים מעיים יתוש, כולל בידוד וזיהוי של חיידקים midgut יתושים, דלדול אנטיביוטיקה של חיידקים מעיים יתוש, ולהחזן מחדש מין אחד חיידקים ספציפיים.

תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

זבובים בוגרים של Drosophila melanogaster נוצלו בהרחבה כאורגניזמים מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובות החיסוניות המולדות של המארחים ואסטרטגיות זיהום מיקרוביאליות. כדי לקדם את שלב הזחלים D. melanogaster כמערכת מודל נוספת או חלופית, מתוארת טכניקת הזרקת זחלים.

Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

חקור הערכת ארסיות חיידקית בזחלי Manduca sexta באמצעות הזרקה ישירה לחלל הדם. שיטה זו מאפשרת ניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן ומספקת כלי לניהול מזיקים חקלאיים.

גידול והזרקה של

גלה סרטונים נוספים