Name: Assay רובד לnorovirus Murine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למדו כיצד לכמת חלקיקי נורובירוס מזיקים באמצעות מבחן רובד בתאי RAW 264.7. שיטה זו מסייעת לחוקרים לחקור דינמיקת הדבקה ויראלית ולהבין טוב יותר את מנגנוני ההדבקה של Norovirus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לחברי מעבדת Wobus להערות והצעות קריטיות. העבודה במעבדה של CEW מומנה על ידי קרנות הזניקו מאוניברסיטת מישיגן, מענק פיתוח קריירה ממרכז NIH / NIAID מצוינות האזוריים לביו הגנה והמחקר העולה מחלות זיהומיות (RCE) תכנית, אזור V הגדול &#39; RCE &#39;אגמים (פרס NIH 1-U54-AI-057153) וNIH R01 AI080611. MBG-H. מומן על ידי הניסויי אימונולוגיה (NIH T32 A1007413-16) ואת המנגנונים המולקולריים בפתוגנזה של חיידקים (NIH T32 A1007528) מעניקה הכשרה לאוניברסיטת מישיגן. JBC מומן על ידי Coordenação דה Aperfeiçoamento דה דה pessoal Nível סופריור (שכמיות), ברזיליה, ברזיל.

<ol><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+norovirus%3A+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li>
<li>Condit, R. C. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCondit%2C+RC+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).</li>
<li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+estimating+50%25+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li>
<li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li>
<li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435(2011).</li>
<li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196(2009).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li>
<li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת assay פלאק לMNV-1 מוצגת כאן היא דרך של כימות חלקיקי MNV זיהומיות. על ידי ביצוע פעולות assay המאוירים באיור 3, ניתן לקבל titers הנגיפי לשעתק. המגבלה של זיהוי של assay תלויה בדילול מתחיל בשימוש. כאשר מתחילים עם דילול 1:10 של מדגם, כמתואר לעיל, המגבלה של זיהוי של assay פלאק היא 10 pfu (כלומר, לוח 1 גלוי ב10 -1 דילול). מאחר וכל רובד מייצג וירוס אחד, assay פלאק יכול לשמש גם כדי לטהר אוכלוסיות משובטות של MNV באמצעות הרמת שלטים מבודדים והפצתם כפי שתוארה לעיל 1. בנוסף, טהרת הפלאק יכולה לשמש גם כדי להפריד בין אוכלוסיית וירוס בודדה מאוכלוסיות וירוסים מעורבות. הגבלה של שימוש assay פלאק לגילוי זיהום MNV היא שלא כל זני MNV יוצרים פלאק 4. עם זאת, ייתכן שניתן יהיה להתגבר על inability של כמה זני MNV, שבודדו מבעלי חיים, ליצירת פלאק ידי passaging וירוסים אלה התוקפים בתרבית הרקמה 7. חלופה לassay פלאק היא למדוד חלקיקים מזהמים באמצעות 50 טכניקת TCID 3, 4. assay זה מכמת את כמות הווירוס הנדרש כדי לייצר CPE ב50% מתאי תרבית רקמה מחוסנת לאחר דילולי נקודתי קצה ולוקח 1 שבוע כדי להשלים לMNV 4. בנוסף להיות איטי יותר מאשר assay פלאק, 50 assay TCID הוא גם לא רגיש כמו (מגבלה של זיהוי = 200 TCID 50 / מ&quot;ל) בשל הרעילות של דגימות רקמה לתאי 264.7 RAW 4. אף ששלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול תוארו לאורך הפרוטוקול, הסעיף הבא מספק סיכום כדי להקל על בעיות ירי. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא להבטיח שתאי 264.7 RAW נשארים קיימא לאורך assay לתומך בשכפול נגיף. זה יכוללהיות במעקב בכל שלב של הבדיקה באמצעות מיקרוסקופ אור. כדאיויות תא מובטחת בשתי דרכים. ראשית, יש להיזהר לא לתת לתאים יתייבשו בזמן טיפול צלחות. לפיכך, צלחות מחוסנות אחד בכל פעם, התנדנדו בתקופת הזיהום, וצריכות להישאר סגורים כל פעם שהם לא מטופלים. שנית, הוסיפו פתרונות לתאים צריכים להיות מתאזנים ל ~ 37 ° C. יתר על כן, הוא חיוני לבריאות הכללית של 264.7 תאי RAW לשמור עליהם בתקשורת המכילה רעלן פנימי סרום נמוך (&lt;10 איחוד האירופי / מ&quot;ל), המגביל את ההפעלה של תאים. בנוסף, יש לנו נצפו שיעור כישלון גבוה יותר של assay פלאק בעת שימוש בתאים ממעבר 30 ומעלה. למרות שזה עשוי להשתנות ממעבדה למעבדה, חשוב לכלול ביקורת חיובית (למשל, דוגמה עם כייל נגיף ידוע) כדי להבטיח titers לשעתק, במיוחד כאשר באמצעות תאי 264.7 RAW מעבר גבוהים יותר. כדי להגביל את השימוש בתאי מעבר גבוהים יותר, מומלץ להקפיא את המבחנות של תחילת passaתאי ge עם קבלת 264.7 תאי RAW ולהתחיל תרבות חדשה מהבקבוקונים קפואים לעתים קרובות. להתחיל מחדש עם תרביות תאי מעבר נמוכות גם להיות שימושי כאשר תאים להציג מאפיינים שונו, כמו אי ספיקה לדבוק, שינויים במורפולוגיה של תאים (לדוגמה מסיבוב לדק והתפשט החוצה), או כאשר זיהום Mycoplasma זוהה. נקודה חשובה נוספת לשים לב להיא להבטיח שטיפי פיפטה משתנים בין דגימות ובמהלך הדילולים. זה יבטיח דילולים סידוריים מדויקים ולמנוע זיהום צולב בין דגימות. צעד אחד בפרוטוקול שבו ניתן להשתמש באותו קצה פיפטה שוב הוא כאשר דילולים סידוריים של אותו המדגם מתווספים לבארות. במקרה כזה, צריך להתחיל מבידוד המדולל ביותר ועד נמוך, ונמרצות פיפטה מעלה ומטה בעת עריכת דילול חדש. פרוטוקול assay פלאק הוא amendable למספר שינויים. שינוי אחד שיכול להתבצע כאשר tכאן הם לא מספיק תאים לinoculating בארות בשתי עותקים, הוא להדביק רק טובה אחת לכל דילול. עם זאת, מאחר שנפח הבידוד הוא 0.5 מ&quot;ל, מספר פלאק אז צריך להכפיל בפקטור של 2 לנרמל לpfu / מ&quot;ל. Assay פלאק יכול גם להיות מותאם לשימוש עם כל שורת תאי חסיד אחרת שיכולה לתמוך בשכפול של MNV, ואת זה כבר תאר לmicroglial קו BV-2 התא העכברי 8. שינויים אחרים שניתן ליישם הם עיבודים שתוארו בפרוטוקולי assay פלאק שפותחו עבור וירוסים אחרים. במקרה של MNV, את השינויים הבאים כבר יושמו בהצלחה, השימוש בתאית מתיל במקום לוחית ים 9 agarose, וצביעת תאים בסגולים או מתילן הכחול במקום האדום ניטראלית 10, 11 גביש. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם לפי צורך לכמת וירוסי פלאק יוצרים אחרים או שימוש לothאה וירוסים הגורמים לזיהומים בממוסס 264.7 תאי RAW, מה שהופך אותו לכלי שימושי לכמת חלקיקים נגיפיים מידבקים באופן כללי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> DMEM / סוכר גבוה </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x פניצילין וסטרפטומיצין </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 חומצות אמינו לא חיוני מ&quot;מ </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 מ&quot;מ (100x) L-גלוטמין </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> ים הרובד agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> ניטראליים אדום 0.33% </td><td> סיגמא </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1.0 מ&quot;מ חרוזי Zirconia / סיליקה </td><td> מוצרי BioSpec </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Rocker מהירות המודל 35 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> כלי Lyser Magna </td><td> רוש </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> שורת תאי גלם 264.7 </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> רקמת תרבות חממה </td><td> סנה </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

assay רובד לnorovirus murine

Plaque Assay for Murine Norovirus

norovirus Murine (MNV) הוא הנציג היחיד של סוג norovirus שיעילות גדל בתרבית רקמת 1, 2. תמוגה תא והשפעת cytopathic (CPE) הם נצפו במהלך MNV-1 זיהום של תאי דנדריטים Murine או מקרופגים 1. מאפיין זה של MNV-1 יכול לשמש כדי לכמת את מספר החלקיקים מזהמים במדגם שניתן על ידי ביצוע בדיקת רובד 1. Assay פלאק מסתמך על יכולתו של MNV-1 לlyse תאים וליצור חורים בשכבת תאים מחוברת, הנקראות לוחות 3. טכניקות מרובות יכולות לשמש כדי לזהות זיהומים נגיפיים בתרבות רקמות, רקמות נקטפו, קלינית, ודגימות סביבתיות, אך לא לכל המידה את מספר החלקיקים מזהמים (למשל qRT-PCR). אחת הדרכים לכמת חלקיקים נגיפיים מידבקים הוא לבצע assay פלאק 3, שיתואר בהרחבה בהמשך. וריאציה על assay פלאק MNV היא פלואורידassay escent מיקוד, שבו אנטיגן MNV immunostained בmonolayers הסלולרי 4. בדיקה זו יכולה להיות מהירה יותר, שכן ביטוי האנטיגן נגיפי קודמת להיווצרות הפלאק. זה גם שימושי עבור titrating וירוסים מסוגלים ליצור את הפלאק. עם זאת, בדיקת מיקוד הניאון דורשת משאבים נוספים מעבר לאלו של assay פלאק, כמו נוגדנים ומיקרוסקופ כדי לספור יחידות מוקד יוצרים. זיהומיות MNV גם ניתן לכמת על ידי קביעת 50% מינון רקמות תרבות זיהומיים (TCID 50) 3. בדיקה זו מודדת את כמות הווירוס הנדרש כדי לייצר CPE ב50% מתאי תרבית רקמה מחוסנת ידי טיטרציה נקודת הסיום 5. עם זאת, מגבלתו של גילוי היא גבוהה יותר בהשוואה ל4 assay פלאק. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול assay פלאק שניתן להשתמש בו בצורה יעילה כדי לקבוע את מספר חלקיקי MNV זיהומיות להציג בדגימות ביולוגיות או סביבתיות 1, 4, 6. שיטה זו היא based על הכנת דילולים סידוריים 10-קיפול של דגימות MNV המכילים, המשמשים לחסן monolayer של תאים מתירנית (264.7 תאי macrophage Murine RAW). וירוס מותר לצרף לmonolayer התא לתקופת זמן נתונה ולאחר מכן aspirated לפני מכסה תאים עם תערובת של agarose ותקשורת סלולרית תרבות. אגר מאפשר את התפשטות צאצאים נגיפיים לתאים שכנים תוך הגבלת התפשטות לתאים הנמצאים בריחוק. כתוצאה מכך, תאים נגועים lysed וחורי טופס בmonolayer המכונים פלאק. עם התפשטותו של הווירוס מספקת, לוחות הפכו מכתימים הבא גלויה של תאים עם צבעים כמו אדום, ניטראלי, כחול תילן, או סגול גביש. בדילולים נמוכים, כל רובד נובע מחלקיק אחד מדבק נגיפי והצאצאים שלה, שהתפשט גם לתאים שכנים. לפיכך, לספור את מספר הלוחיות מאפשר לחשב יחידות שלט יוצרים (pfu) נוכחיות במדגם החי 3.

כאן אנו מתארים שיטה לכמת חלקיקים זיהומיות של norovirus העכברי (MNV), שהוא היחיד שיעילות norovirus משכפל בתרבות תא. Assay פלאק מנצל הכמיהות של MNV למקרופאגים Murine ויכול להיות מותאם לשימוש עם דגימות ביולוגיות או סביבתיות המכילות MNV.

Assay רובד לnorovirus Murine

נורו-וירוס עכברי (MNV) הוא החבר היחיד בסוג Norovirus הגדל ביעילות בתרבית רקמות 1, 2. ליסיס של תאים ואפקט ציטופתי (CPE) הם...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לכמת חלקיקי נורו-וירוס זיהומיים של נוירונים. זאת באמצעות הכנת דילול עשריתי של האינוקולום הוויראלי בשלב ראשון. בשלב השני, מעבירים את הדילול של האינוקולום הוויראלי לשכבה אחת של תאי raw 2 6 4 0.7 ומדגירים את המנות בערבול (rocking) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.בשלב הבא, שאבו את התרבית הראשונית וכסו אותה ביחס של אחד לאחד של C plaque aros ו-two XMEM, והדגרימו את הצלחות למשך 48 שעות באינקובטור לתרביות רקמה. השלב האחרון הוא כיסוי בתמיסת צביעה של neutral red והדגרמה של הצלחות למשך שעה אחת עד שלוש שעות באינקובטור לתרביות רקמה. לבסוף, שאבו בזהירות את תמיסת הצביעה neutral red מבלי להסיר את שכבת ה-arose, וספרו את הפלאקים באמצעות שולחן אור.שיטה זו לכימות חלקיקים נגיפיים זיהומיים יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנורווירוס, כגון כמות החלקיקים הזיהומיים המופרשים בצואה, או אילו רקמות תומכות בהדבקה. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בשמירה על תאים בריאים וחיוניים לאורך הבדיקה. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן בדיקת הפלאקים (plaque assay) לנורווירוס עלולה להיות קשה להבנה עבור אנשים ללא ניסיון קודם.השלמה מוצלחת של בדיקה זו היא סדרה מצטברת של שלבים הדורשים כמות נכונה של תאים, טמפרטורה נכונה וטיפול מדויק על מנת להבחין בקלות בלוחיות (plaques). ראשית, בחנו את השכבה החד-תאית של התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לבדוק את מורפולוגיית התאים. מרבית התאים צריכים להיראות עגולים.אין לאפשר לתאי ה-RAW 264.7 לגדול יתר על המידה, שכן בדרך כלל הם לא יצרו פלאקים. עבור בדיקת פלאקים של נגיף המורנינוירוס (murn neurovirus), בבקבוק תרבית רקמה של 175 סנטימטר רבוע שבו התאים כמעט הגיעו למצב של התלכדות (confluent), שאבו את המדיום מהבקבוק והוסיפו לתאים 10 milliliters של DMEM 10 טרי. לאחר מכן, גרדו את התאים מהתחתית של הבקבוק באמצעות גורד תאים (cell scraper) והשתמשו בפיפט של 10 milliliters כדי לשאוב ואז להתיז את תרחיף התאים אל תחתית הבקבוק. חזרו על פעולה זו לפחות שלוש פעמים כדי לפרק גושי תאים.להתאמה לבקבוק מאגר. הסר מיליליטר אחד עד שניים של תרחיף תאים והעבר אותם לבקבוק חדש של 175 סמ"ר המכיל 33 עד 34 מיליליטר של DMEM 10. דגרי את הבקבוק באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך יומיים עד שלושה ימים ובצע עיסוי שוב.כאשר מגיע הזמן לזריעת התאים בצלחות עבור הבדיקה, התאימו את צפיפות תרחיף התאים ל-1x10⁶ תאים חיוניים למילליליטר ב-DMEM 10, והוסיפו 2 mL מתרחיף זה לכל באער של פלטה בעלת 6 באערים ובקוטר של 3.5 cm. כסו את הפלטה, ולאחר מכן נערו אותה מיד ביד 10 פעמים כדי להפיץ את התאים באופן שווה בבאערים.אין לנער את הפלטה, שכן פעולה זו תגרום לתאים להצטופף במרכז הבאר. לאחר מכן, יש להניח את הפלטה באינקובטור לתרביות רקמה למשך ארבע שעות לפחות, או באופן אידיאלי למשך הלילה, כדי לאפשר לתאים להיצמד. ניתן להשיג אינוקולום של נגיף MNV מרקמות הומוגניזיות שנדבקו ב-MNV או מדגימות צואה מעכברים שנדבקו ב-MNV. בשימוש בדגימות רקמה, יש להניח פיסת רקמה בגודל אפונה לשפופרת עם פקק הברגה בנפח 2 mL המכילה חרוזי סיליקה סטריליים ו-1 mL של DMEM 10 ולבצע הומוגניזציה.משתמשים במכשיר למגנטיזציה במהירות של 6,000 RPM למשך דקה אחת. במידה ומשתמשים בדגימות צואה, הומוגניזרו לא יותר משלוש גרגרי צואה באותו אופן, הקפיאו את הדגימות ההומוגניות בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius והפשיתו את האינוקולום ביום ביצוע בדיקת הפלאקים. השתמשו בפ pipette של חזרות כדי להעביר 1.35 milliliters של DMEM five לכל באער בלוח של 24 באערים, ולאחר מכן העבירו באמצעות pipette נפח של 0.15 milliliters של אינוקולום הנגיף השלישי לבאער הראשון בלוח.בצעו דילול טורים של פי עשרה על ידי שאיבה של 0.15 milliliters מהדילול הראשון של 10 to the minus one והעברתו לבאר השנייה של הפלטה כדי להשיג דילול של 10 to the minus two. לאחר מכן, חזרו על התהליך עם הדילול מהבאר השנייה כדי להגיע לדילול של 10 to the minus three. שימו לב כי ייתכן שיהיה צורך לבצע דילולים נוספים עד ל-10 to the minus nine, בהתאם לדגימה.לאחר הכנת הדילולות הסדרתיות, סמנו את הפלטות של תאי 2 64 0.7 בקונופלואנס (confluency) של 60% עד 80% בשמות הדגימות ובדילול המשמש. לאחר מכן, הסירו את כל המצע מאחת הפלטות באמצעות שאיבה או השלכה, והוסיפו 0.5 milliliters של דגימה מדוללת לבאר. חזרו על הפעולה בבאר כפולה, ולאחר מכן המשיכו לדילול הנמוך הבא.לאחר ששלושת הדילוציות נוספו לפלטה אחת בכפילות, הטה את הפלטה קדימה ואחורה כדי לוודא שכל התאים כוסו. חזור על הפרוצדורה עם הפלטה הבאה של תאים. לאחר שכל הפלטות טופלו, הנח את הפלטות על מכשיר נדנוד (rocking apparatus) המכוון לכ-18 תנודות לדקה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, וחמם במיקרוגל בקבוק של agarose שהוכן מראש ו/או שעבר עיקור עד להמסה.לאחר מכן, מקמי את ה-agros הנוזלי באמבט מים של 42 °C להשגת שיווי משקל תרמי. בשלב הבא, ערבבי את ה-agros הנוזלי עם מצע 2XMEM סטרילי בבקבוק סטרילי ביחס של אחד ለአחד. מקמי את הבקבוק המכיל תמיסת כיסוי זו באמבט מים של 37 °C עד למועד השימוש.בסיום דגירה של שעה אחת, שאבו את התרבית מכל באר והוסיפו באיטיות שני מיליליטר של תמיסת הכיסוי לכל באר, תוך הקפדה על הצמדת קצה הפ pipette לדופן של כל באר. כדי למנוע תזוזה של התאים, כסו את הצלחות והמתינו כ-10 דקות בטמפרטורת החדר עד להתמצקות השכבה. לאחר מכן, העבירו את הצלחות לאינקובטור לתרביות רקמה למשך 48 שעות.בסיום תקופת הדגירה, בדקו את הצלחות לנוכחות של פלאקים. אם לא נראים פלאקים, החזירו את הצלחות לאינקובטור ובדקו שנית לאחר ארבע שעות. חזרו על הפעולה במידת הצורך, אך משך הדגירה לא יעלה על 72 שעות.ראשית, הכינו את תמיסת הצביעה ב-neutral red. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסת neutral red לכל באר; עבור פרוטוקול זה, אין צורך להסיר את פקק ה-aros. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.לאחר שחלף זמן האינקובציה, בדקו את המצעים לנוכחות של פלאקים תוך השארת תמיסת ה-neutral red בבארות. אם לא נראה צביעה, הדגירו את המצעים למשך שעה נוספת, עד למקסימום של שלוש שעות. ברגע שהפלאקים נראים, שאבו את תמיסת ה-neutral red, תוך הקפדה על כך שפקק ה-arose לא יזוז, ולאחר מכן עברו לספירת הפלאקים.בחן את הצלחות ומצא את הדילול שבו הפלאקים מופרדים בבירור. הנח את הצלחת על שולחן אור וספור את הפלאקים תוך סימון נקודה על כל פלאק שנספר, כדי למנוע ספירה כפולה.לאחר מכן, חזור על הספירה בבאר עם דילול שונה של הנגיף וחשב את הטיטר הנגיפי ביחידות יוצרות פלאק למילליליטר. בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, תמונה נציגה זו מראה שכבה אחת של תאים (monolayer) לפני הדבקה. תאי raw 2 6 4 0.7 תורגבו למשך לילה וצולמו תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 20 פעמים.תמונה זו מציגה את אותה שכבה חד-שכבתית לאחר היווצרות של פלאקים. התאים נצבעו בתמיסת neutral red בריכוז 0.01% לאחר 48 שעות של זיהום ונצפו תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי ארבעה. הספרות הרומיות אחת, שתיים ושלוש מציינות שלושה פלאקים נראים.תמונה זו מציגה פלטה בסיום פרוטוקול בדיקת הפלאקים (plaque assay) עם בארות כפולות של שלושה דילולים עשריים המסומנים בספרות רומיות. אחת וארבע תואמות לדילול 10⁻¹, שתיים וחמש תואמות לדילול 10⁻², ושלוש ושש תואמות לדילול 10⁻³.הטר של הווירוס בדגימה מצוין להלן. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להחליף את טיפי הפפיטה בין הדילולות כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות, להביא את התמיסות לטמפרטורה הנכונה, ולא להניח לשכבות התאים המונו-שכבתיות להתייבש. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקת פלאקים (plaque assay) וכמות חלקיקי זיהום של mi neurovirus.זכרו כי בעת עבודה עם Mira Norovirus בקבינה לבטיחות ביולוגית, יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ולבישת חלוק בעת ביצוע הליך זה, ויש להשליך את הפסולת כראוי בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המקומית שלכם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Noroviruses הם אחד הגורמים העיקריים של הקיבה והמעיים עדיין בטכניקות מולקולריות לאפיון שלהם עדיין חדש יחסית. כאן אנו מדווחים על שתי גישות שונות גנטיקה הפוכה להתאוששות יעילה של norovirus Murine (MNV), הנציג היחיד של סוג זה אשר ניתן מופצות על תרבית תאים.

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות חלקיקים דמויי וירוס נורו-וירוס אנושי (VLPs) הנקשרים לחיידקי מעיים אנושיים. התרחיפים החיידקיים מעורבבים עם ה-VLPs ומודגרים כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של חיידקי VLP. לאחר מכן מסומנים הקומפלקסים בנוגדנים ספציפיים ל-VLP המתויגים כפלואורופורים, ולאחר מכן הדמיה וכימות מבוססי ציטומטריית זרימה כדי לזהות את אחוז החיידקים הקשורים ל-VLP.

בדיקה לכימות הקשר של VLPs נורו-וירוס אנושי לחיידקי מעיים

מבחני פלאק הם תקן הזהב לכימות ויראלי, תוך שימוש בשכבות לכידה על חד-שכבות תאיות מארחות כדי לקבוע טיטרים ויראליים. בעוד שבאופן מסורתי נעשה שימוש בשכבות-על שונות למחצה, כאן אנו מדגימים טכניקות פלאק המשווים שכבות-על מוצקות למחצה לתאית מיקרו-קריסטלית נוזלית חדשה בקרב מספר משפחות של נגיפים.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

כאן אנו מציגים הליך לכימות אנטרו-וירוס ונורו-וירוס במי סביבה ושתייה באמצעות PCR כמותי של שעתוק הפוך. התאוששות הנגיף הממוצעת ממי תהום עם הליך סטנדרטי זה משיטת EPA 1615 הייתה 20% עבור נגיף הפוליו ו-30% עבור נורו-וירוס עכברים.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

מחקר זה מתאר   מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

מתודולוגיית דגימה מבוססת קצף מאקרו פותחה והוערכה לאיתור וכימות של נורו-וירוס על משטחים קשים סביבתיים.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים, אחד למדידת קצב הגידול הספציפי והשני עבור היכולת מחייב תא של בנגיף שימוש assay פלאק ו- RT-qPCR. פרוטוקולים אלה זמינים עבור המאשר את ההבדלים פנוטיפים בין זנים בנגיף.

מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת את הכריכה של הפתוגן איקריוטית האנושי הנגיף כדי חיידקים. לאחר ביצוע הראשונית וירוס חיידק הקובץ המצורף, הזרימה cy, לנסות לזהות חיידקים מאוגדים וירברית בתוך האוכלוסייה.

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

למדו כיצד לכמת חלקיקי נורובירוס מזיקים באמצעות מבחן רובד בתאי RAW 264.7. שיטה זו מסייעת לחוקרים לחקור דינמיקת הדבקה ויראלית ולהבין טוב יותר את מנגנוני ההדבקה של Norovirus.

Assay רובד לnorovirus Murine

גלה סרטונים נוספים