Assay רובד לnorovirus Murine

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לכמת חלקיקי נורו-וירוס זיהומיים של נוירונים. זאת באמצעות הכנת דילול עשריתי של האינוקולום הוויראלי בשלב ראשון. בשלב השני, מעבירים את הדילול של האינוקולום הוויראלי לשכבה אחת של תאי raw 2 6 4 0.7 ומדגירים את המנות בערבול (rocking) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

בשלב הבא, שאבו את התרבית הראשונית וכסו אותה ביחס של אחד לאחד של C plaque aros ו-two XMEM, והדגרימו את הצלחות למשך 48 שעות באינקובטור לתרביות רקמה. השלב האחרון הוא כיסוי בתמיסת צביעה של neutral red והדגרמה של הצלחות למשך שעה אחת עד שלוש שעות באינקובטור לתרביות רקמה. לבסוף, שאבו בזהירות את תמיסת הצביעה neutral red מבלי להסיר את שכבת ה-arose, וספרו את הפלאקים באמצעות שולחן אור.

שיטה זו לכימות חלקיקים נגיפיים זיהומיים יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנורווירוס, כגון כמות החלקיקים הזיהומיים המופרשים בצואה, או אילו רקמות תומכות בהדבקה. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בשמירה על תאים בריאים וחיוניים לאורך הבדיקה. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן בדיקת הפלאקים (plaque assay) לנורווירוס עלולה להיות קשה להבנה עבור אנשים ללא ניסיון קודם.

השלמה מוצלחת של בדיקה זו היא סדרה מצטברת של שלבים הדורשים כמות נכונה של תאים, טמפרטורה נכונה וטיפול מדויק על מנת להבחין בקלות בלוחיות (plaques). ראשית, בחנו את השכבה החד-תאית של התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לבדוק את מורפולוגיית התאים. מרבית התאים צריכים להיראות עגולים.

אין לאפשר לתאי ה-RAW 264.7 לגדול יתר על המידה, שכן בדרך כלל הם לא יצרו פלאקים. עבור בדיקת פלאקים של נגיף המורנינוירוס (murn neurovirus), בבקבוק תרבית רקמה של 175 סנטימטר רבוע שבו התאים כמעט הגיעו למצב של התלכדות (confluent), שאבו את המדיום מהבקבוק והוסיפו לתאים 10 milliliters של DMEM 10 טרי. לאחר מכן, גרדו את התאים מהתחתית של הבקבוק באמצעות גורד תאים (cell scraper) והשתמשו בפיפט של 10 milliliters כדי לשאוב ואז להתיז את תרחיף התאים אל תחתית הבקבוק. חזרו על פעולה זו לפחות שלוש פעמים כדי לפרק גושי תאים.

להתאמה לבקבוק מאגר. הסר מיליליטר אחד עד שניים של תרחיף תאים והעבר אותם לבקבוק חדש של 175 סמ"ר המכיל 33 עד 34 מיליליטר של DMEM 10. דגרי את הבקבוק באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך יומיים עד שלושה ימים ובצע עיסוי שוב.

כאשר מגיע הזמן לזריעת התאים בצלחות עבור הבדיקה, התאימו את צפיפות תרחיף התאים ל-1x10⁶ תאים חיוניים למילליליטר ב-DMEM 10, והוסיפו 2 mL מתרחיף זה לכל באער של פלטה בעלת 6 באערים ובקוטר של 3.5 cm. כסו את הפלטה, ולאחר מכן נערו אותה מיד ביד 10 פעמים כדי להפיץ את התאים באופן שווה בבאערים.

אין לנער את הפלטה, שכן פעולה זו תגרום לתאים להצטופף במרכז הבאר. לאחר מכן, יש להניח את הפלטה באינקובטור לתרביות רקמה למשך ארבע שעות לפחות, או באופן אידיאלי למשך הלילה, כדי לאפשר לתאים להיצמד. ניתן להשיג אינוקולום של נגיף MNV מרקמות הומוגניזיות שנדבקו ב-MNV או מדגימות צואה מעכברים שנדבקו ב-MNV. בשימוש בדגימות רקמה, יש להניח פיסת רקמה בגודל אפונה לשפופרת עם פקק הברגה בנפח 2 mL המכילה חרוזי סיליקה סטריליים ו-1 mL של DMEM 10 ולבצע הומוגניזציה.

משתמשים במכשיר למגנטיזציה במהירות של 6,000 RPM למשך דקה אחת. במידה ומשתמשים בדגימות צואה, הומוגניזרו לא יותר משלוש גרגרי צואה באותו אופן, הקפיאו את הדגימות ההומוגניות בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius והפשיתו את האינוקולום ביום ביצוע בדיקת הפלאקים. השתמשו בפ pipette של חזרות כדי להעביר 1.35 milliliters של DMEM five לכל באער בלוח של 24 באערים, ולאחר מכן העבירו באמצעות pipette נפח של 0.15 milliliters של אינוקולום הנגיף השלישי לבאער הראשון בלוח.

בצעו דילול טורים של פי עשרה על ידי שאיבה של 0.15 milliliters מהדילול הראשון של 10 to the minus one והעברתו לבאר השנייה של הפלטה כדי להשיג דילול של 10 to the minus two. לאחר מכן, חזרו על התהליך עם הדילול מהבאר השנייה כדי להגיע לדילול של 10 to the minus three. שימו לב כי ייתכן שיהיה צורך לבצע דילולים נוספים עד ל-10 to the minus nine, בהתאם לדגימה.

לאחר הכנת הדילולות הסדרתיות, סמנו את הפלטות של תאי 2 64 0.7 בקונופלואנס (confluency) של 60% עד 80% בשמות הדגימות ובדילול המשמש. לאחר מכן, הסירו את כל המצע מאחת הפלטות באמצעות שאיבה או השלכה, והוסיפו 0.5 milliliters של דגימה מדוללת לבאר. חזרו על הפעולה בבאר כפולה, ולאחר מכן המשיכו לדילול הנמוך הבא.

לאחר ששלושת הדילוציות נוספו לפלטה אחת בכפילות, הטה את הפלטה קדימה ואחורה כדי לוודא שכל התאים כוסו. חזור על הפרוצדורה עם הפלטה הבאה של תאים. לאחר שכל הפלטות טופלו, הנח את הפלטות על מכשיר נדנוד (rocking apparatus) המכוון לכ-18 תנודות לדקה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, וחמם במיקרוגל בקבוק של agarose שהוכן מראש ו/או שעבר עיקור עד להמסה.

לאחר מכן, מקמי את ה-agros הנוזלי באמבט מים של 42 °C להשגת שיווי משקל תרמי. בשלב הבא, ערבבי את ה-agros הנוזלי עם מצע 2XMEM סטרילי בבקבוק סטרילי ביחס של אחד ለአחד. מקמי את הבקבוק המכיל תמיסת כיסוי זו באמבט מים של 37 °C עד למועד השימוש.

בסיום דגירה של שעה אחת, שאבו את התרבית מכל באר והוסיפו באיטיות שני מיליליטר של תמיסת הכיסוי לכל באר, תוך הקפדה על הצמדת קצה הפ pipette לדופן של כל באר. כדי למנוע תזוזה של התאים, כסו את הצלחות והמתינו כ-10 דקות בטמפרטורת החדר עד להתמצקות השכבה. לאחר מכן, העבירו את הצלחות לאינקובטור לתרביות רקמה למשך 48 שעות.

בסיום תקופת הדגירה, בדקו את הצלחות לנוכחות של פלאקים. אם לא נראים פלאקים, החזירו את הצלחות לאינקובטור ובדקו שנית לאחר ארבע שעות. חזרו על הפעולה במידת הצורך, אך משך הדגירה לא יעלה על 72 שעות.

ראשית, הכינו את תמיסת הצביעה ב-neutral red. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסת neutral red לכל באר; עבור פרוטוקול זה, אין צורך להסיר את פקק ה-aros. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.

לאחר שחלף זמן האינקובציה, בדקו את המצעים לנוכחות של פלאקים תוך השארת תמיסת ה-neutral red בבארות. אם לא נראה צביעה, הדגירו את המצעים למשך שעה נוספת, עד למקסימום של שלוש שעות. ברגע שהפלאקים נראים, שאבו את תמיסת ה-neutral red, תוך הקפדה על כך שפקק ה-arose לא יזוז, ולאחר מכן עברו לספירת הפלאקים.

בחן את הצלחות ומצא את הדילול שבו הפלאקים מופרדים בבירור. הנח את הצלחת על שולחן אור וספור את הפלאקים תוך סימון נקודה על כל פלאק שנספר, כדי למנוע ספירה כפולה.

לאחר מכן, חזור על הספירה בבאר עם דילול שונה של הנגיף וחשב את הטיטר הנגיפי ביחידות יוצרות פלאק למילליליטר. בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, תמונה נציגה זו מראה שכבה אחת של תאים (monolayer) לפני הדבקה. תאי raw 2 6 4 0.7 תורגבו למשך לילה וצולמו תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 20 פעמים.

תמונה זו מציגה את אותה שכבה חד-שכבתית לאחר היווצרות של פלאקים. התאים נצבעו בתמיסת neutral red בריכוז 0.01% לאחר 48 שעות של זיהום ונצפו תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי ארבעה. הספרות הרומיות אחת, שתיים ושלוש מציינות שלושה פלאקים נראים.

תמונה זו מציגה פלטה בסיום פרוטוקול בדיקת הפלאקים (plaque assay) עם בארות כפולות של שלושה דילולים עשריים המסומנים בספרות רומיות. אחת וארבע תואמות לדילול 10⁻¹, שתיים וחמש תואמות לדילול 10⁻², ושלוש ושש תואמות לדילול 10⁻³.

הטר של הווירוס בדגימה מצוין להלן. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להחליף את טיפי הפפיטה בין הדילולות כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות, להביא את התמיסות לטמפרטורה הנכונה, ולא להניח לשכבות התאים המונו-שכבתיות להתייבש. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקת פלאקים (plaque assay) וכמות חלקיקי זיהום של mi neurovirus.

זכרו כי בעת עבודה עם Mira Norovirus בקבינה לבטיחות ביולוגית, יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ולבישת חלוק בעת ביצוע הליך זה, ויש להשליך את הפסולת כראוי בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המקומית שלכם.