Name: ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: למדו שיטת צביעה סטנדרטית לספירת אוכלוסיות לויקוציטים בדם שלם טרי באמצעות ציטומטריית זרימה. השיטה מיועדת לניסויים קליניים רב-מרכזיים ומאפשרת מעקב מדויק אחרי תגובות חיסוניות לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ג&#39;סיקה ג&#39;ונס, אריקה קלארק, קונסטנס Ducar, דון סמית, רוי לואיס, לילי Apedaile, ג&#39;ואן ויזנר, דווין אדאמס, הקורים McBain וסטיבן Voght על עזר בפיתוח של שיטה, וכתב יד בסרטון זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס CAVD מענק 38645 (MJM) ומכונים הלאומיים לבריאות מענקי UM1 ​​AI068618 וU01 AI069481 (MJM). EA-N. הוא נתמך על ידי NIH גרנט T32 AI007140. אנו מודים לקרן ג&#39;יימס ב &#39;פנדלטון צדקה לתרומת ציודם הנדיבה.

הערה: כדי להגן על נוגדני fluorophore-מצומדות מאור, לבצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגית עם האור הכבוי. 1. הכנת לוח כתמי נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנל מכתים הנוגדן ניתן למצוא בטבלת 1. ריכוז נוגדנים צריך להיות מוגדר על ידי טיטרציה עם כל דם ושימוש באותו הציוד ונהלים שישמשו לרכישת דגימות phenotyping המוכתמות cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע titers הצביעה המתאימה נקבעים, לשלב את כל הנוגדנים לתערובת אחת בצינור מנעול בכובע מצחיה. הוסף חיץ לשטוף זרימה (PBS של Dulbecco עם סרום 2% חום מומת עוברים מבקרים) כדי להביא את הנפח הכולל עד 100 μl. הרחב את התערובת במשך מספר הדגימות שמוכתמות. תערובת זו ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שמונה שבועות. </li></ol> 2. הכתמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדם שנאסף כדי לשמש למטרות אחרות במודעהdition לassay זה, קבע aliquot צד בעת שהליכים יותר רגישים לזמן מבוצעים על הדם שנותר. Aliquot ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר עד 4 שעות לאחר venipuncture ללא אובדן תא משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש שלמות חרוז גלולה בתחתית של התחתית ותווית Trucount הצינור לזהות המדגם שהוכתם. בניסויים קליניים HVTN, מערכת ניהול נתוני המעבדה (Frontier מדע וטכנולוגית קרן מחקר; אמהרסט, ניו יורק) משמשת לתייג ולעקוב אחר דגימות מוכתמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספרי מגרשים ותאריכי תפוגה של כל החומרים כימיים. רשום את מספר Trucount צינור חרוז הספירה מסופק על ידי היצרן על השקית של צינורות; לוודא שהמספר הרבה על השקית תואם למספר הרבה ברכבת התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש להפוך pipetting במדויק פיפטה μl 100 מכל הדם לתוך צינור Trucount, ממש מעליו את מקדמת המתכת. הימנע ממריחת דם למטה בצד של הצינור. </li><li&gt; באמצעות טכניקה רגילה (קדימה) pipetting, 100 μl פיפטה של לוח מכתים הנוגדן המעורב (ראה טבלה 1) לתוך צינור Trucount. מכסה את הצינור ומערבולת במהירות נמוכה למשך כ 15 שניות כדי לערבב. חזותי לבדוק את הצינור כדי להבטיח שחרוז הגלולה נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צינור Trucount במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (15-30 מעלות צלזיוס) בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, מדלל aliquot של 10 × פתרון Lysing FACS ל1X באמצעות diH 2 O. הוסף 900 ​​μl 1 × פתרון Lysing FACS לצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצינור ומערבולת ביסודיות במהירות נמוכה למשך כ 15 שניות כדי לערבב. דחוף את המכסה כלפי מטה בחוזקה לנעילת עמדה בצינור וחותם עם סרט מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הצינור ב-65 ° C עד -95 ° C עד המדגם הוא מוכן למשלוח למעבדה המרכזית הניתוח או לניתוח בבית. דוגמאות הן יציבות בשלב זה לפחות ארבעה שבועות. אם משלוח או assaying immediately, צעד זה יכול להיות מושמט. </li></ol> 3. משלוח הערה: בהנחיות הבאות לנצל מערכת משלוח מבודד מSaf-T-פאק, Inc תוכננה במיוחד עבור קטגורית חומרים ביולוגיים פטורים B משלוח בהתאם לאוויר הבינלאומי ותחבורה אגודה (IATA) תקנות. אם מנתח את הדגימות באותו המיקום כמו הכתמים התרחשו, עבור לסעיף 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות ניתן להעבירה מייד לאחר צביעה או ברגע שהם קפאו ב-65 ° C עד -95 ° C. עוטף כל צינור לחלוטין בנייר הכסף ומניח בתיבת הדגימה המוכתמת. הנח את תיבת הדגימה המוכתמת בתוך שקית פולי leakproof עם חומר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שקית פולי leakproof והתוכן לתוך שקית Tyvek וחותם עם כאוויר קטן ככל האפשר בתיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את חבילת הדגימה (דגימה בתוך אריזה משנית) בתוך קופסא החומה הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החום הפנימי בשור בתוך חזה הקלקר, לקבע אותו בכניסה כדי למנוע תזוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא חזה הקלקר עם קרח יבש (כ 8 ק&quot;ג) ומניח את המכסה בחוזקה על החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח קלטת תיבת המשלוח והספינה כחומר ביולוגי, הקטגוריה B (UN3373) עם הקרח היבש הנאות (UN1845) סימונים; לעקוב-650 PI הוראות IATA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הקבלה, דגימות נשמרות ב-65 ° C עד -95 ° C עד שהם נתחו. </li></ol> 4. מפשיר וניתוח זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגימה המוכתמת מהמקפיא להפשיר בטמפרטורת חדר בחושך לפני האיסוף על cytometer הזרימה. אם איסוף נתונים על מדגם אחד או יותר, סטנדרטיזציה של התהליך עבור כל הצינורות על ידי מדהים הפשרה כך שהצינורות לא יושבים בטמפרטורת חדר למשך יותר משעה 1 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות יש רכשה באמצעות cytometer זרימת ליזר 4 מצויד במסננים מתאימים, כגון BD LSRהשני. השתמש כיול cytometer סטנדרטי ושיטות תגמול קרינה לנתוני גבייה 4. </li></ol> הערה: אין להגדיר סף פיזור פיזור או צד קדימה במהלך איסוף 5. חרוזי Trucount יכולים לרדת מתחת לסף הגדרה הנמוכה ביותר האפשרית עבור פרמטרים אלו גורמים לקבוצת משנה של חרוזים כדי לא תטופל בזמן הניתוח. אם נדרש על ידי המכשיר לקביעת סף, קבע את הסף הנמוך ביותר האפשרי Am ציאן הערוץ. בגלל CD45 + leukocytes מגואלים בפנל יהיה Am ציאן חיובי, וחרוזי Trucount גם לזרוח בAm ציאן הערוץ, זה אמור לאפשר לכל הנתונים הרלוונטיים שנאסף כראוי. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צינור המדגם למשך 5 שניות לפני הטעינה על cytometer הזרימה. חרוזי Trucount לזרוח מאוד בערוצים רבים. שער החרוזים במהלך איסוף על ידי מציאת האוכלוסייה, כי הוא מאוד כפול חיובי עבור PE Cy5 וAPC (2 קולוRS שרוב להבחין בקלות את החרוזים מהתאים עשוי להשתנות בהתאם למכשור). בחר את שער החרוז כשער העצירה שלך, ונתוני שיא לפחות עד 20,000 חרוזים הם נרכשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה, כגון FlowJo (Treestar; אשלנד, או). איור 1 מציג את ערכת gating מנוצלת לניתוח של אוכלוסיות שונות ליקוציט מתיקו דם שליטת נציג. </li></ol> 5. חישובי Trucount <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שפופרת מכילה Trucount גלולת lyophilized של חרוזי ניאון. לאחר הוספת נוזל לצינור וvortexing, החרוזים צריכים להיות מופצים באופן שווה בכל המדגם. מספר החרוזים בגלולה משתנה במקצת על ידי מספר רב וניתן למצוא בשקית האחסון לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער חרוזי Trucount ואוכלוסיות תאים כפי שמוצג באיור 1 כדי לקבוע ספירות אירוע לכל אוכלוסייה. השוואת מספר האירועים אניn שער החרוז למספר הכולל של חרוזים במקור בצינור יאפשר לך לקבוע את יחס הדגימה שנאספה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז המוחלט (כלומר, תאים / μl) לכל אוכלוסייה. המשוואה הבאה יכולה לשמש למטרה זו: = [אירועים # / אוכלוסייה (אירועים # # / חרוזי חרוזים כלל בגלולה)] / 100 μl ריכוז תאים (תאים # / כל דם μl). </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> איור 1. ערכת gating מנוצלת לניתוח של אוכלוסיות גדולות ליקוציט מראים נתונים מייצגים מן מתנדב בריא. ) חרוזי Trucount (i) הם מגודרים והוצא מתאים. גרנולוציטים (ii) מסומנים וlympohcytes ומונוציטים מחולקים 3 popluations: CD14הלימפוציטים שליליים (ג), כל התאים CD14 השליליים (ד), ושאינו לימפוציטים (v). B) CD14 ימפוציטים שליליים הם מגודרים להבחין CD4 + תאי T (vi), CD8 + תאי T (ז), תאי B (ח), CD56 תאי NK בהירים (לט), CD56 תאי NK עמומים (X), וCD56 תאי NK שליליים (יא). ג) כל התאים CD14 השליליים הם מגודרים להבחין מיאלואידית (יב) ו( XIII) תאי דנדריטים plasmacytoid. D)-lympocytes עישון הנו מגודרים להבחין (XIV), ביניים (XV), וקלסיים מונוציטים הלא קלסיים (XVI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> תת תא ספציפי יותר שאינם מוצגים באיור 1 (לדוגמה, תאים או נויטרופילים NKT) גם ניתן להבחין באמצעות לוח אנו מציגים, וערכת gating ניתן להרחיב או שונה כדי לענות על צרכי הלימוד ספציפיים. צעדי gating מסוימים המוצגים הם ייחודיים לשיטה זו. שים לב במיוחד, שער והכללהשער הדרה נמשך סביב חרוזי Trucount ומונח על גבי זה, אחד לשער החרוזים לספירה, ואחד שלא לכלול את החרוזים מהניתוח הסלולרי (איור 1 א). כמו כן, משום לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים לא הבחינו בקלות בדם כולו כפי שהם בתאי דם היקפיים mononuclear ידי פיזור קדימה וצד פיזור, gating התאים האלה באמצעות CD45 ביטוי ופיזור צד לעתים קרובות יש צורך (איור 1 א). גרנולוציטים מזהמים (מוקף בעיגול) שלא יכול להיות מופרד מלימפוציטים ומונוציטים באמצעות CD45 ופיזור צד ניתן להבחין בחלקות מסוימות על ידי CD16 הביטוי הגבוה שלהם (התרשים 1C ו1D איור). מספר גרנולוציטים מזהמים הוא בדרך כלל קטן, והם לא מפריעים לgating התא monocyte ונ&quot;ק.

<ol><li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells%3A+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li>
<li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+granulocytes%3A+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li>
<li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li>
<li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li>
<li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li>
<li>Kantor, A. B., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKantor%2C+AB+%22The+handbook+of+Experimental+Immunology%22">The handbook of Experimental Immunology</a>. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).</li>
<li>Hulspas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+the+stability+of+phycoerythrin-tandem+dye+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates.</a> Cytometry A. 75, 966-972 (2009).</li>
<li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li>
<li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).</li>
<li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li>
<li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis%3A+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li>
<li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets%3A+the+dendritogram%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בדו&quot;ח זה, אנו מציגים שיטת חרוז מבוססת על ספירת אוכלוסיות שלמות ליקוציט בדם טרי על ידי cytometry זרימה ולכסות את הפרמטרים דרושים לשימוש בו בניסוי קליני רב מרכזי בניתוח מדגם ריכוזי. שיטה זו מתבססת על ומייעלת את פרוטוקול Trucount BD ומאפשר השימוש האמין שלה בהגדרת ניסוי רב מרכזית קלינית. Assay המכתים הוא פשוט ולוקח כ 45 דקות לביצוע, מה שהופך את זה אפשרי עבור טכנאי מעבדה לעיבוד דם כדי לבצע אותו ולהקפיא ולשלוח את הדגימות למעבדת assay מרכזית לניתוח. הבדיקה דורשת רק 100 μl של דם מלא,...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> Trucount צינורות ספירה מוחלטים </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> FACS 10X Lysing פתרון </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> הקטגוריה B &amp; מערכת משלוח פטורה, מבודדים </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי CD45 AmCyan </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי CD3 FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8 PerCp-סיי 5.5 נוגדן חד שבטי </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa פלואוריד 700 antibo חד שבטיdy </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי HLA-DR ECD </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14 v450 נוגדן חד שבטי </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי CD19 PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> APC-CD16 H7 נוגדן חד שבטי </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> PE-CD56 Cy7 נוגדן חד שבטי </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC נוגדנים חד שבטיים </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> PE-Cy5 נוגדן חד שבטי CD123 </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות assay phenotyping דם מלא

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation של לויקוציטים דם ההיקפי נמצא בשימוש נרחב לשימור תאים להערכות תגובה חיסוניות בניסויים קליניים, ומציע יתרונות רבים לנוחות וסטנדרטיזציה של הערכות חיסוניות, אך השפעות מזיקות של תהליך זה נצפה בכמה תת קבוצות של תאים, כגון גרנולוציטים, תאי B , ותאים דנדריטיים 1-3. Assaying לויקוציטים הטרי נותן תמונה מדויקת יותר של המצב בvivo של התאים, אבל לעתים קרובות קשה לביצוע בהקשר של ניסויים קליניים גדולים. מבחני תא טריים תלויים התחייבויות התנדבות ולוחות זמנים, ואם זמן רב, היישום שלהם יכול להיות מעשי בשל שעתי העבודה הנדרשות מאנשי מעבדה. בנוסף, כאשר ניסויים נערכים במרכזים מרובים, מעבדות עם המשאבים וההכשרה הדרושים כדי לבצע את המבחנים לא יכולות להיות ממוקמות בקרבה מספיקה לאתרים קליניים. כדי לטפל בבעיות אלה, יש לנו develלאומי למטרולוגיה חוקית פנל מכתים נוגדנים 11-צבע שניתן להשתמש בו עם Trucount צינורות (הקיטון דיקינסון, סן חוזה, קליפורניה) לפנוטיפ ולמנות את אוכלוסיות ליקוציט מרכזיות בתוך הדם ההיקפי, מניב מידע ספציפי תא מסוג חזק יותר ממבחנים כגון ספירת דם מלא (CBC) או מבחנים עם לוחות, זמינים מסחריים המיועדים לצינורות Trucount שמכתימים אותו רק לכמה סוגי תאים. הליך ההכתמה הוא פשוט, דורש רק 100 μl של כל דם טרי, ולוקח כ 45 דקות, מה שהופך את זה אפשרי עבור מעבדות סטנדרטיות דם לעיבוד שיש לבצע. זה מותאם מגיליון BD Trucount צינור הנתונים הטכני <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">(גרסה 8/2010).</a> קוקטייל הנוגדן המכתים יכול להיות מוכן מראש בכמויות גדולות במעבדת assay מרכזית ונשלח למעבדה לעיבוד באתר. צינורות מוכתמים ניתן לתקןוקפא למשלוח למעבדת הבדיקה המרכזית לניתוח cytometry זרימה ססגונית. נתונים המופקים מפנל מכתים זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר שינויים בריכוזים ליקוציט לאורך הזמן ביחס להתערבות ויכול היה בקלות להיות מפותח יותר להעריך מצבי הפעלה של סוגי תאים ספציפיים של עניין. בדו&quot;ח זה, אנו מדגימים את התהליך בשימוש על ידי טכנאי מעבדת דם עיבוד לבצע צביעה על כל דם טרי ואת הצעדים כדי לנתח דגימות מוכתמות אלה במעבדת assay מרכזית תומכת בניסוי קליני רב מרכזי. פרטי וידאו ההליך כפי שהוא מתבצע בהקשר של תיקו דם ניסוי קליני בחיסון ה-HIV משפטי הרשת (HVTN).

בדו&quot;ח זה, אנו מדגימים את שלבי צביעה וניתוח של assay phenotyping מבוצע על כל דם טרי למנות אוכלוסיות מולד אדפטיבית עיקריות יקוציט. אנו מדגישים שיקולים לביצוע הליכים אלה בהקשר של ניסוי קליני רב מרכזי.

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

שימור בהקפאה (Cryopreservation) של לוקוציטים מדם פריפריאלי נמצא בשימוש נרחב לשימור תאים עבור הערכות של תגובה חיסונית בניסויים קליניים ומציע יתרונות רבים...

סרטון זה מתאר את הפרוצדורה שפותחה על ידי רשת ניסויי חיסוני ה-HIV במרכז מחקר הסרטן פרד האצ'ינסון (Fred Hutchinson Cancer Research Center) לצביעת דם שלם טרי בניסויים קליניים רב-מרכזיים לצורך ניתוח במעבדה מרכזית. הפרוצדורה עושה שימוש במבחנות tru count מבית Becton Dickenson biosciences, שכל אחת מהן מכילה כדורית ליפיליזציה שמתמוססת במהלך הכנת הדגימה כדי לשחרר מספר ידוע של חרוזי פלואורסצנציה. נוגדנים פלואורסצנטיים משמשים לצביעת סמני שטח הספציפיים לאוכלוסיות תאים שונות.ניתן להשוות את מספר התאים באוכלוסיות שונות אלו למספר החרוזים הפלורסצנטיים במהלך ניתוח בציטומטריה זורמת, וניתן לעקוב לאורך זמן אחר ריכוזים מוחלטים של אוכלוסיות לוקוציטים שונות בדם מלא ביחס להתערבות טיפולית. שלום, שמי אריקה אנדרסון ניסן ואני מדענית צוות ברשת ניסויי חיסוני ה-HIV. הפרוצדורה שאתם עומדים לצפות בה היא כזו שפיתחנו לשימוש בניסויים הקליניים הרב-מרכזיים שלנו.בניסויים אלה, טכנאי מעבדה לעיבוד דם מקבלים דגימות דם מלא טריות, צובעים אותן באמצעות נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית, ולאחר מכן שולחים את הדגימות למעבדה מרכזית המסוגלת לנתח אותן באמצעות Cytometer flow. דם מלא טרי אינו מנותח לרוב במסגרת ניסויים קליניים בשל בעיות של עלות והיתכנות, אך פיתחנו פאנל צביעה של נוגדן בודד שיכול לזהות את אוכלוסיות הלוקוציטים העיקריות בדם הפריפר

enumeration-major-peripheral-blood-leukocyte-populations-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מכשיר אוטומטי microfluidic פותחה עבור במחזור העשרה תא גרעיני מן הדם ההיקפיים באמצעות תמוגה כדורית אדומה המבטיח בידוד המדגם באיכות גבוהה ללא אובדן התא.

תמוגה אוטומטי Microfluidic דם פרוטוקול העשרה של מחזורי תאים גרעיני

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה באמצעות שני פלואורוכרום לזיהוי תאי T CD4+ ו- CD8+, תאי T γδ, תאי B, תאי הרג טבעי (NK) ומונוציטים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). לאחר הדגירה על התאים עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום כנגד סמני פני השטח, תת-קבוצות התא מזוהות באמצעות אסטרטגיית גטינג ציטומטרית אופטימלית של זרימה.

בדיקת ציטומטריית זרימה לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

אימונופנוטיפ בדם מלא הוא הכרחי לניטור מערכת החיסון האנושית. עם זאת, מספר הריאגנטים הנדרשים וחוסר היציבות של פלואורוכרומים ספציפיים בקוקטיילים מעורבבים מראש מחייבים הכנת ריאגנטים יומית. כאן אנו מראים כי הכנה אוטומטית למחצה של קוקטייל נוגדנים מכתים עוזרת לבסס אימונופנוטיפ אמין על ידי מזעור השונות בחלוקת ריאגנטים.

גישה אוטומטית-למחצה הכנת קוקטיילי נוגדן עבור ניתוח Immunophenotypic של אדם דם היקפי

גילוי של מחלה שיורית מינימלית או מדיד (MRD) הוא סמן prognostic חשוב זיקוק הערכת סיכונים, חיזוי relapse ב לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). אלה מקיף הנחיות והמלצות עם שיטות עבודה מומלצות עבור זיהוי עקבי ומדויק וזיהוי של MRD, עשויים לסייע בקבלת החלטות לטיפול יעיל של AML.

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור אפיון מונוציט קבוצות משנה על-ידי cytometry זרימה של דם מלא. זה כולל חלוקה לרמות שער תת-קבוצות של להעריך את הבעות פניהם של סמני פני שטח נותן דוגמה ההערכה של התבטאות (דלקתיות) M1 ו- M2 סמנים (אנטי דלקתיות).

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

פרוטוקול זה מפרט הכנה קלינית ליישום של דגימות PBMC ופלזמה באיכות גבוהה באתר הניסוי הקליני שניתן להשתמש בהן לניתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.

הכנת כדורי תאים מונונוקולריים בדם היקפי ופלזמה מהגרלת דם אחת באתרי ניסוי קליני לניתוח סמנים ביולוגיים

פרוטוקול למדידת לויקוציטים בדם היקפי באמצעות מנתח לויקוציטים מבוסס כרטיס POCT מוצג כאן. אותן דגימות דם נבדקו על ידי שני מנתחי המטולוגיה אוטומטיים כדי להעריך את העקביות והדיוק של התוצאות. התוצאות הראו כי למנתח המוערך היה מתאם טוב עם מערכת הייחוס.

הערכה של מנתח בדיקת נקודת טיפול למדידת לויקוציטים בדם היקפי

כדי ללמוד ביעילות את הפונקציה של אוכלוסיות תאים חיסוניים טיהור שלהם נדרש לעתים קרובות. דלדול משלים היא טכניקה מהירה וזולה עבור בידוד של אוכלוסיות תאים חיסוניים עם טוהר גבוהה.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

למדו שיטת צביעה סטנדרטית לספירת אוכלוסיות לויקוציטים בדם שלם טרי באמצעות ציטומטריית זרימה. השיטה מיועדת לניסויים קליניים רב-מרכזיים ומאפשרת מעקב מדויק אחרי תגובות חיסוניות לאורך זמן.

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

גלה סרטונים נוספים