סינתזה של Nanoemulsions שלב של משמרות עם הפצות גודל צרות לאידוי Droplet אקוסטית ואבלציה בועה משופרת אולטראסאונד בתיווך

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את ההשפעה של בועות הנוצרות על ידי אידוי אקוסטי של ננו-אמולסיות מצופות ליפידים על אבלציה המתווכת על ידי אולטרסאונד. זאת מושג תחילה על ידי פיזור של ננו-אמולסיות מצופות ליפידים בתוך הידרוג'לים של פולי-אקרילאמיד הטעונים באלבומין. כשלב שני, מתמר ממוקד משדר פולסים קצרים בעוצמה גבוהה אל תוך ההידרוג'ל, אשר מאיידים את הננו-אמולסיות באופן מקומי במוקד. לאחר מכן, הבועות שנוצרו מופעלות באופן רציף על ידי אולטרסאונד, והאנרגיה האקוסטית הקרינה מהבועות נספגת במהירות על ידי ההידרוג'ל, דבר המאיץ את קצב החימום המתווך על ידי אולטרסאונד.

התוצאות מראות כי נוכחות של בועות מפחיתה באופן דרמטי את הזמן והאנרגיה הדרושים לחימום ההידרוג'ל מעבר לטמפרטורת הסף לדנטורציה של חלבונים, מה שמוביל לאבליציה יעילה ומהירה יותר באמצעות אולטרסאונד. גודל הננו-אמולסיה בעלת שינוי הפאזה (phase shift nano emulsion) הוא גורם קריטי הקובע את סף הלחץ. עבור אידוי אקוסטי, פיתחנו פרוטוקול להפקה של ננו-אמולסיות יציבות בעלות שינוי פאזה עם התפלגות גדלים צרה וספי אידוי מוגדרים היטב, וכן מערכת in vitro להערכת ההשפעה על אבליציה של מדיה באמצעות אולטרסאונד.

בעוד שמתואר כאן מערכת in vitro, ננו-אמולסיות בעדית פאזה תוכננו כדי להגיע לרקמות חוץ-כליות ולגידוליים מוצקים באמצעות חלקיקים שניתן להמרים לאיד acoustically. ניתן להשתמש בבועות שנוצרות ליישומים דיאגנוסטיים או טיפוליים בניהול מחלת הסרטן. כדי להתחיל את הליך ההכנה של ננו-אמולסיית מעבר פאזה (PSNE), ערבבו תחילה את הליפידים יחד על ידי המסה של 11 mg של DPPC ו-1.7 mg של DSPE.

Peg 2000 בכלורפורמה בתוך בקבוק ת round bottom מזכוכית. הנח את הבקבוק באמבט מים בטמפרטורה של 50 degrees Celsius בתוך מותיר כימיים, והשתמש בזרם של גז Argonne כדי לאדות את הממס האורגני. כדי ליצור שכבה שומנית יבשה, הנח את הבקבוק במייבש והשאר תחת ואקום למשך הלילה כדי לייבש את השכבה השומנית למחר בבוקר.

יש להחזיר את הלביד לשלב ההידרציה באמצעות 5.5 milliliters של PBS. יש לחמם את התמיסה במקלח מים בטמפרטורה של 45 °C עד להמסה של שכבת הלביד. יש להעביר את תמיסת הלביד לבקבוק (vial) בנפח של שבעה מיליליטרים, ולאחר מכן לבצע סוניקציה באמצעות סוניקטור עם פרובה למשך שתי דקות בעוצמה של 20% amplitude.

חלק את התמיסה לשתי בקבוקונים של 2.5 milliliters כל אחד. את 0.5 milliliters הנותרים יש להשליך. הוסף 2.5 milliliters של PBS לכל בקבוקון, ולאחר מכן הנח את שני הבקבוקונים באמבט קרח ומים בטמפרטורה של 0 °C.

הוסיפו 50 µL של doca fluoro pentane, או DDFP, לכל וילבאל (vial). סונונציה (Sonication) של תערובת השומנים עם ה-DDFP באמבט מי קרח היא החלק הקריטי ביותר בפרוצדורה זו.

אמבט מי קרח משמש למניעת התאיידות של הנוזל per fluorocarbon. במהלך תהליך זה, בצעו סוניקציה לכל מבחנה באמבט מי הקרח לפי ההגדרות הבאות: 25% amplitude במצב pulsed mode, למשך זמן כולל של 60 שניות. לאחר הסוניקציה, העבירו את תמיסת ה-PSNE למבחנות סנצילציה בנפח של 20 milliliters, כך שיועברו 5 milliliters של PBS לכל מבחנה, מה שיוביל לנפח סופי של 10 milliliters למבחנה.

הרכיבו את האקסטרודר בהתאם להנחיות היצרן כדי להכין את האקסטרודר לפעולה. העבירו באמצעות פיפטה 10 milliliters של מים דה-יוניים אל פתח הדגימה העליון. סגרו את הפתח בעזרת פקק והדקו את שסתום השחרור.

פתחו לאט את קו גז החנקן כדי להעלות את הלחץ, ובכך לדחוף את הדגימה דרך הממברנות. אספו את הדגימה מצינור היציאה, והעבירו את ה-PSNE 16 פעמים דרך מסנן של 100 ננומטר או 200 ננומטר כדי לקבל התפלגות גדלים צרה. התחילו הליך זה על ידי הכנת הידרוג'ל פוליאקרילאמיד המכיל PSNE.

ראשית, הכינו תמיסת bovine serum albumin או BSA בריכוז 24% על ידי המסה של 2.4 גרם אבקת BSA ב-10 מיליליטר מים דה-יוניים. לאחר מכן, הכינו תמיסת ammonium per sulfate או PS בריכוז 10% על ידי דילול של גרם אחד של אבקת PS ב-10 מיליליטר מים דה-יוניים. ערבבו רכיבים אלו בתבנית פלסטיק בסדר הבא: 2.1 מיליליטר תמיסת אקרילאמיד, 1.2 מיליליטר Tris buffer, 0.1 מיליליטר PS בריכוז 10%, 4.5 מיליליטר תמיסת BSA בריכוז 24%, ו-3.6 מיליליטר מים דה-יוניים. חממו את התמיסה ל-40 °C במקלח, ולאחר מכן הניחו תחת ואקום למשך שעה אחת כדי להוציא את הגזים מהנוזל.

שלב זה נדרש כדי למנוע היווצרות לא רצויה של בועות בתוך ההידרוג'ל לאחר שעה. הוצא את התא מהוואקום, הוסף 480 µL של תרחיף PSNE וערבב היטב על ידי סיבוב עדין של התא הפלסטי. בתוך מasuba כימית, הוסף 12 µL של tetraethyl ethylene diamine או TEMED כדי לפולימר את האקרילאמיד, והנח את התא במקלח מים בטמפרטורה של 12 °C למשך שעתיים.

הפולימריזציה היא תגובה אקסותרמית, לכן נדרש אמבט קירור כדי למנוע התאיידות של PSE במהלך הפולימריזציה. לאחר שהאקרילאמיד עבר פולימריזציה, ממקמים מתמר הספק ממוקד וגשש דימות בתוך מיכל אקרילי מלא במים דה-יוניים של DGAs, כך שמישור הדימות חופף לנפח המוקד של המתמר. לאחר מכן, ממקמים את ההידרוג'ל מפולי-אקרילאמיד הטעון ב-PSNE במוקד של מתמר ההספק, ומאיידים את ה-PSNE בתוך ההידרוג'ל באמצעות פולסים אקוסטיים קצרים, ולאחריהם חשיפה של 15 שניות לגלי רצף עבור אבלציה מוגברת על ידי בועות.

ככל שה-BSA עובר דנטורציה, ההידרוג'ל הופך למעטער בשל בליעת אולטרסאונד ויצירת חום, תוך ניטור התאיידות ויצירת בועות באמצעות סורק אולטרסאונד דיאגנוסטי. בתמוגית לדוגמה זו, החץ מצביע על האזור המוקדי שבו נוצרה ענן בועות כתוצאה מהתאיידות של PSNE. חזור על החשיפה האקוסטית במיקום חדש בהידרוג'ל ללא דף, הגבה את ה-PSNE, והשווה את זמן ונפח האבלציה.

פרוטוקול זה מניב טיפות פרפלוואורקרבון מצופות ליפידים עם התפלגות גודל צרה. התפלגות הגודל שנמדדה באמצעות פיזור אור דינמי מוצגת כאן עבור PSNE שהותז באמצעות מסננים של 100 ו-200 ננומטר. היחידות של צירי הפסודה מבוססות על עוצמת האור המפוזר מחלקיקים בגודל מסוים ביחס לעוצמת האור המפוזר הכוללת מהדגימה.

כאשר קוטר הממוצע וסטיית התקן של PSNE נמדדים באמצעות פיזור אור דינמי (dynamic light scattering) יום אחד ושבעה ימים לאחר דחיסה דרך מסנני 100 ו-200 ננומטר, התוצאות מראות כי ה-PSNE יציבים למשך שבוע לפחות. איור זה מציג תמונות במצב B של PSNE לפני ואחרי אידוי. בתוך הידרוג'ל של פוליאקרילאמיד, החץ מצביע על האזור המוקדי שבו נוצרה ענן בועות כתוצאה מאידוי ה-PSNE.

אלו הן תמונות של הידרוג'ל פוליאקרילאמיד המכיל albumin ו-PSNE לפני ואחרי אידוי וסוניקציה באמצעות אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה או Hy Fu. נגע נוצר על ידי חימום בתיווך Hy Fu למשך 15 שניות. הצורה הבלתי סימטרית של הנגע היא תוצאה של חימום טרום-מוקדי המתרחש עקב נוכחות ענן הבועות בנתיב האולטרסאונד. ניתן למזער חימום טרום-מוקדי ויצירת נגעים עקב פיזור מבועות על ידי הפחתת ההספק האקוסטי המועבר לאחר התפתחותם.

שיטה זו להפקת ננו-אמולסיות יציבות עם מעבר פאזה תסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול המתווך באולטרסאונד לבחון אבלציה של HIFU מוגברת באמצעות בועות בגידולים מוצקים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הפקת ננו-אמולסיות יציבות עם מעבר פאזה בעלות התפלגות גודל צרה, ושל חקר גרעיני בועות ואבלציה מוגברת המתווכת באולטרסאונד.