הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים בחי
5 בדצמבר 2012
שיטה חדשה זו מאפשרת הקלטה התאית סימולטני של motoneuron אחת מבוגר עכבר והמדידה של הכח הנוצר על ידי סיבי השריר שלה. החקירה בשילוב של תכונות החשמליות ומכאניות של יחידות מוטוריות בבעלי חיים רגילים ועבר שינוי הגנטי היא פריצת דרך בחקר מערכת התוקפת.
המטרה הכללית של הליך זה היא ללמוד את התכונות האלקטרופיזיולוגיות והמכווצות של יחידה מוטורית בודדת בעכבר, באמצעות ביצוע הקלטות תוך-תאיות של נוירונים מוטוריים in vivo. זאת מושג תחילה על ידי חשיפת חוט השדרה והשריר הרלוונטי, ולאחר מכן באמצעות חיבור של מתמר כוח לגיד השריר.
בשלב הבא, מעבדה את הנוירון המוטורי באמצעות אלקטרודה תוך-תאית, ובכך גורמים להתכווצות של היחידה המוטורית המוקלטת. בסופו של דבר, ניתן לאפיין את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירון המוטורי במקביל לתכונות ההתכווצות של היחידה המוטורית שלו. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, שכן שלבי המיקרו-כירורגיה קשים מאוד ללמידה בשל גודלו הקטן של בעל החיים.
כדי להתחיל בפרוצדורה, הרדימו עכבר על ידי הזרקת pentobarbital sodium או תערובת של ketamine ו-xylazine באופן תוך-פעריטוני. ודאו כי העכבר אינו מגיב לרפלקס צביטה באצבעות. לאחר מכן, בצעו חתך מעל הקנה באמצעות מספריים קהים והסיטו את העור לשני הצדדים.
לאחר מכן, קרעו את בלוטת הרוק באמצעות פינצטה קהה. כדי לחשוף שני שרירים דקים המכסים את הקנה, הפרידו בין שני השרירים כדי לחשוף את הקנה. השתמשו בפינצטת Dumont 7.
השחילו שני חוטים של תפר משי aut בעובי 4 מתחת לקנה הנשימה. לאחר מכן, בצעו חתך רוחבי בקנה הנשימה בין שתי טבעות סחוס. אך היזהרו שלא לנתק את קנה הנשימה באופן מלא.
כעת, הכניסו את הצינור הקנה (tracheal tube) אל תוך הקנה. קבעו את שני צדי פתח ההחדרה על ידי קשירת התפרים מעליו. לאחר מכן, חברו את צינור הקנה למנשם לעכברים ולמד-פחמן (capnograph).
לאחר מכן, חברו את המנשם למקור חמצן נקי באמצעות שק תאימות (compliance bag). כוון את פרמטרי המנשם כך שהעכבר לא יילחם נגד ההנשמה המלאכותית, ושהלחץ החלקי של הפחמן הדו-חמצני בסוף הנשיפה (end tidal carbon dioxide partial pressure) יהיה יציב בין 4% ל-5%. בשלב זה, חשפו את הוריד הג'וגולרי (jugular vein) בצד אחד של הצוואר באמצעות טכניקות של דיסקציה קהה.
הוריד הג'וגולרי (jugular vein) מתפצל לשני גזעים עיקריים, וריד הפנים הקדמי והאחורי. הפר carefully את הווריד מרקמת החיבור הסובבת אותו. לאחר מכן, השחל שני חוטים של תפר משי (silk suture) במידה 6 מתחת לווריד, והרחק אותם זה מזה ככל האפשר לאורך הווריד.
בשלב הבא, מקמו תפס כלי דם קטן בצד הפרוקסימלי של הווריד וקשרו את הצד הדיסטלי של הווריד. באמצעות מספרי איריס עדינים מאוד, בצעו חתך רוחבי קטן בווריד. היו זהירים מאוד שלא לחתוך את הווריד באופן מלא.
לאחר מכן, הכניסו קטטר French 1 שמולא מראש לתוך הפתח עד לתליב כלי הדם המחזיק את הווריד ואת הקטטר יחד. הסירו בזהירות את תליב כלי הדם. לאחר מכן, דחפו את הקטטר מספר מילימטרים נוספים לתוך הווריד. קבעו את הקטטר על ידי קשירתו באמצעות התפרים משני צידי נקודת ההחדרה.
בשלב הבא, חברו את אחד הקתטרים למזרק או למזרק חשמלי להזרקת מנות משלימות של חומרי הרדמה כגון פנטובארביטל נתרן או קטמין קסילזין. חזרו על הפעולה עבור וריד נוסף וחברו את הקתטר השני למזרק חשמלי להזרקה תוך-ורידית איטית של תמיסת גלוקוז 4% המכילה 1% נתרן ביקרבונט ו-14% פלסמון. לבסוף, סגרו את עור הצוואר באמצעות תפרים.
לאחר מכן, החזירו את העכבר למצב שכיבה על הבטן. כעת בצעו חתך מהחלק העליון של הירך ועד לגיד אכילס. הפרידו את העור מהשרירים שמתחתיו והקפידו לא לפגוע בכלי הדם.
בשלב הבא, זהו את השפה הקדמית של שריר ה-biceps femoris, הנראית כקו לבן העובר לאורך הירך. לאחר מכן, פתח בזהירות לאורך הקו מהברך ועד לעצם הירך. הפרד את השרירים כדי לחשוף את עצב ה-sciatic שמתחת לשריר ה-biceps femoris.
בצעו דיסקציה זהירה של ה-biceps femoris והסירו אותו. כדי לחשוף את העצב הסיאטיקה (sciatic nerve) ואת שרירי ה-triceps surae, זהו את העצב הטיביאלי (tibial nerve) בין העצב הפרוניאלי המשותף (common peroneal nerve) לבין העצב הסוראלי (sural nerve). מבין הענפים השונים של העצב הטיביאלי, זהו את הענפים המעצבבים את ה-triceps surae מבין הענפים העמוקים יותר.
בעזרת חוט משי OTT בעובי שמונה, קשרו את כל ענפי העצב הטביאלי יחד, תוך השארת הענפים המעצבבים את שריר ה-tricep surae שלמים. גזרו את העצב הטביאלי במרחק הרב ככל האפשר מהקשר. זהו את החוליות T 13 ו-L 1, כאשר T 13 היא החוליה האחרונה שאליה מחוברות צלעות.
לאחר מכן, קבעו את עמוד השדרה באמצעות תפסני חוליות Cunningham עבור השפיכה משני צדי T 13 ו-L 1. היזהרו לא לדחוס את השפיכה, אך הפילו מתח קל על הציר האורכי. ודאו שעמוד השדרה מקובע היטב על ידי לחיצה עדינה כלפי מטה באמצעות פינצטה.
באמצעות פינצטות עדינות, הסר את զקיקי העמוד השדרה ולאחר מכן את הלמינות מעל T 13 ו-L one כדי לחשוף את חוט השדרה. לאחר מכן, הנח אמבט פלסטיק בהתאמה אישית כדי להקיף את חוט השדרה. לאחר מכן, קבע את האמבט במקומו באמצעות חוט משי במידה four aught.
לבסוף, ודאו שהאמבטיה אטומה למים על ידי איטמה עם חומר איטום quick cast. לאחר שה-quick cast התייבש, הסירו את הכותנה המכסה את חבל השדרה ומלאו את האמבטיה בשמן מינרלי. השתמשו במלחץ חולרי נוסף כדי לסגור זקיף של אזור הש publicaciones (sacral region).
על מנת לתמוך באזור הגב של בעל החיים, השתמש בתפס שלישי כדי לקבע את הגפה האחורית הימנית ואת הקרסול בכפיפה של 90 מעלות בברך, כאשר הגפה כפופה ב-90 מעלות בברך ובקרסול. הסר את הגזה המכסה את אזור הגפה האחורית. בצע דיסקציה לגיד אכילס מהרקמה שסביבו.
נתקו את השריר התלת-ראשי מהרקמות הסובבות ככל האפשר באמצעות מחט הובלה. השהילו תפר משי במידה 6-0 אל תוך גיד אכילס וצרו קשר משולש מסביב לגיד. לאחר מכן, מקמו את חיישן הכוח (force transducer) קרוב לקשר.
לאחר מכן, חברו את הגיד למתמר הכוח באמצעות חוט משי, וחתכו את החלק הדיסטלי של הגיד. לאחר מכן, הכניסו שני תרחילי פלדה אל חלל התת-פשיה של שרירי ה-triceps surae. תרחילים אלו מחוברים למגבר AC חוץ-תאי.
להקלטת EMG, הניחו את עצב ה-triceps surae על הקתודה של אלקטרודת וו (hook electrode), כאשר האנודה נוגעת בשריר סמוך. לאחר מכן, גרו את עצב ה-triceps surae באמצעות פולס מרובע של 50 microsecond בעוצמה עולה ובתדר נמוך, עד להשגת אמפליטודת התכווצות (twitch amplitude) מקסימלית. לאחר מכן, גרו את עצב ה-triceps surae באמצעות פולס מרובע של 50 microsecond בעוצמה עולה ובתדר נמוך, עד להשגת אמפליטודת התכווצות מקסימלית.
איורים אלו מדגימים כיצד לזהות נוירון מוטורי מקבוצת השריר התלת-ראשי (tricep suryi). לאחר חדירה ב cường độ גירוי נמוך, ניתן להבחין ב-EPSP מונוסינפטי רק בעצימות גבוהה יותר. ה-EPSP עשוי להיות גדול מספיק כדי לעורר ספייק אורתוטרופי בעצימות גירוי גבוהה עוד יותר, בהתאם לחוק "הכל או כלום".
ספייק אנטידרומי מופיע עם לטנציה קצרה יותר מאשר ה-EPSP המונוסינפטי. אם מוזרם זרם מספיק דרך המיקרו-אלקטרודה כדי לעורר ספייק, ניתן להקליט פעילות EMG בשריר לאחר השהיה קצרה, שלאחריה תתרחש התכווצות שריר.
לאחר זיהוי הנוירון המוטורי, ניתן לאפיין את תכונותיו האלקטרופיזיולוגיות. לדוגמה, איור זה ממחיש כיצד ניתן למדוד את התנגדות הקלט באמצעות פולסים של זרם בהיפר-פולריזציה ודפולריזציה, ואת שרטוט השינויים בפוטנציאל ממברנה לעומת כמות הזרם המוזרק. ניתן ללמוד גם על התכונות התכווציות של היחידה המוטורית באמצעות פרוטוקולי גרייה שונים.
לדוגמה, ניתן להפיק את קשר הכוח-תדר באמצעות הזרקת פולסים קצרים של זרם בתדרים שונים לנוירון המוטורי. ניתן להוסיף לאחר מכן את כוח המצב היציב (steady state) אל מול תדר פולסי הזרם כדי לחשוף עקומת כוח-תדר סיגמואידית. לאחר רכישת מיומנות בניתוח, ניתן לבצע חלק מטכניקה זו בתוך שלוש שעות במידה והדבר בוצע כהלכה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטה זו מאפשרת הקלטה תוך-תאית סימולטנית של נוירון מוטורי בודד בעכבר בוגר ומדידה של הכוח המופק על ידי סיבי השריר שלו. חקירה משולבת זו מהווה התקדמות משמעותית בלימוד המערכת הנוירו-שרירית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- פיזיולוגיה של השריר
רקע
- הבנת יחידות מוטוריות היא קריטית למחקר נוירו-משרי (neuromuscular).
- תכונות אלקטרופיזיולוגיות יכולות לספק תובנות לגבי תפקוד הנוירונים המוטוריים.
- לימוד תכונות התכווצות מסייע בהבנת מכניקת השרירים.
- קיימים אתגרים בביצוע מיקרו-כירורגיה בבעלי חיים קטנים.
מטרת המחקר
- לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של יחידה מוטורית בודדת בעכבר.
- למדוד את תכונות הכיווץ של סיבי השריר הקשורים לנוירון המוטורי.
- להעמיק את ההבנה של האינטראקציות בין הנוירון המוטורי לשריר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חשיפה של חוט השדרה והשריר המדובר.
- חיבור של מתמר כוח לגיד של השריר.
- גירוי של הנוירון המוטורי באמצעות אלקטרודה תוך-תאית.
- הקלטה סימולטנית של הפעילות החשמלית וההתכווצות של השריר.
תוצאות עיקריות
- אפיון מוצלח של התכונות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירון המוטורי.
- מדידה של תכונות ההתכווצות של היחידה המוטורית הקשורה.
- הדגמת היתכנות הטכניקה במודל של בעל חיים חי.
- תובנות לגבי הדינמיקה של האינטראקציות בין הנוירון המוטורי לסיבי השריר.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מקיפה לחקר יחידות מוטוריות.
- היא מאפשרת ניתוח סימולטני של תכונות חשמליות ומכניות.
- הטכניקה בעלת ערך הן למחקרים בבעלי חיים רגילים והן בבעלי חיים שעברו שינוי גנטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמכים ניהוליים
טכניקה זו מאפשרת בחינה ישירה של הקשר התפקודי בין האלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים לבין תפוקת הכוח של היחידה המוטורית בעכברים בוגרים, ובכך מספקת מערכת רלוונטית פיזיולוגית לתיקוף יעדים במחקר נוירו-שרירי. על ידי קישור הפעילות העצבית לתפקוד מכני, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של היפותזות טיפוליות הנוגעות למעגלים מוטוריים בעמוד השדרה. גישה זו בעלת ערך ניבוי להערכת השפעת תרכובות על שלמות היחידה המוטורית במודלים של מחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי הקורלציה בין תכונות אלקטרופיזיולוגיות של נוירוני תנועה לבין ייצור כוח ביחידה המוטורית.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת מעורבות המטרה (target engagement) במודלים גנטיים או פרמקולוגיים של שיבוש מוטורי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות וסימולטניות של עירור עצבי והתכווצות שרירים לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תומך במדידה הדירה של תפקוד היחידה המוטורית תחת תנאים ניסיוניים שונים לצורך סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על סריקה פנוטיפית במודלים של עכברים בוגרים להערכת ההתאמה של סממנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים בין פעילות עצבית לבין פלט תפקודי.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף מגילוי המטרה ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מדידת נקודות קצה אלקטרופיזיולוגיות ונקודות קצה של התכווצות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת מדדים תפקודיים המגשרים בין מודולציה של מטרות עצביות לבין תוצאה פיזיולוגית, ובכך היא תומכת בקבלת החלטות בנוגע לזיהוי מובילים (leads).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי קישור תכונות קלט של מוטוניורונים לפלט של כוח יחידת מוטור, ובכך מבהיר את תפקוד המסלול.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות בעלי שני פרמטרים (אלקטרופיזיולוגיות וכוח) המוכנות לבדיקה, לצורך הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליזה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תגובות יחידות מוטור תחת תנאים שונים באמצעות איסוף סימולטני של נתונים אלקטרופיזיולוגיים ונתוני התכווצות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מודולציה של מטרה עצבית לתוצאות תפקודיות במערכות הרלוונטיות למחלה, ובכך תומך ברציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת שלמות יחידות מוטור במגוון מודלים של מחלות ורקעים גנטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי צמצום העמימות המכניסטית בין הת targeting העצבי לבין התפקוד המוטורי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הערכת היחידה המוטורית באמצעות רישום אלקטרופיזיולוגי ורישום כוח מסונכרנים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת מדדים תפקודיים ישירים של מודולציית המטרה, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על השפעתן על הפיזיולוגיה של היחידה המוטורית במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, אלקטרופיזיולוגיה ושילוב של חיישני כוח (force transducers) עבור עבודות in vivo בבעלי חיים קטנים.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מגברים תוך-תאיים, חיישני כוח ומגברי AC חוץ-תאיים עבור EMG.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין קבוצות של מדעי העצבים, פיזיולוגיה ופרמקולוגיה לצורך פרשנות עקבית של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הטכניקה על זני עכברים שונים או מודלים של מחלות המשפיעים על הגודל או התכונות של היחידה המוטורית.
- מוגבל בשל המורכבות הטכנית של שמירה על יציבות מכנית במהלך הקלטה תוך-תאית בהכנות של בעלי חיים ערים שאינם משושים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Tracheotomy and Artificial Ventilation
2:51
Placement of the Intravenous Lines
5:07
Dissection of the Hind-limb Muscle and Nerves
7:06
Laminectomy
8:53
Achilles Tendon Dissection
11:03
Results: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumber Motoneuron and Force Produced by its Motor Unit
12:51
Conclusion
