Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד שינה מוגדרת EEG וריכוז לקטט במהלך גירוי אופטוגנטי בקואורדינטות סטריאוטקסיות מדויקות. השתל בניתוח את המוליכים והקנולות האלקטרואנצפלוגרפיים הדרושים לחיישן לקטט וכבל סיבים אופטיים. לאחר מכן הכנס את כבל הסיב האופטי וחיישן הלקטט המכויל מראש לתוך צינוריות ההנחיה שלהם בגולגולת החיה.

לאחר מכן, התאם את עוצמת גירוי האור הכחול כדי להשיג את התגובה האלקטרופיזיולוגית הרצויה. לאחר מכן המשך לאסוף את הנתונים האלקטרואנצפלוגרפיים, האלקטרומיוגרפיים וריכוז הלקטט בזמן שהחיה רשאית להתנהג או לישון באופן ספונטני. בהשוואה לשיטות אחרות כמו מחקרים פרמקולוגיים של EEG, לגישה ניסויית זו יש יתרון של ניטור ביוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה של המוח בזמן שפעילות הנוירונים מתבצעת מניפולציה בזמן אמת בקנה מידה של פחות משנייה.

לכן הפוטנציאל להניב תובנות חדשות לתחום חקר השינה הוא גבוה. לדוגמה, ניתן לזהות נלווים מטבוליים ואלקטרופיזיולוגיים של שנת גלים איטיים. סוג זה של ניסוי יכול להיות מיושם גם בתחומים אחרים של מדעי המוח, כגון למידה וזיכרון, פלסטיות סינפטית או הפרעות פרכוסים.

הטכניקה הניתוחית מאתגרת מבחינה טכנית. זה דורש מידה רבה של מיומנות, אבל ניתן להשיג זאת באמצעות תרגול. בהדגמה ויזואלית זו, אחזור על השלבים הקריטיים של כמה הליכים כירורגיים מסובכים שיחמיאו לתיאור הכתוב.

לאחר שבעל חיים התאושש מהניתוח, האתגר הוא להכניס כראוי את חיישן הלקטט וכבל הסיבים האופטיים. ג'ונתן ואני נדגים כיצד להשתמש ביד תקיפה בעת ריסון החיה כדי להכניס את שני הציוד העדינים הללו. לבסוף, נראה כיצד לייעל את תגובת ה-EEG על ידי התאמת עוצמת הגירוי בזמן אמת.

עבור ניסוי זה, השתמש בעכברים טרנסגניים המבטאים את תעלת הקטיונים הרגישה לאור כחול. ערוץ מאמץ בשניים בנוירונים בקליפת המוח. ראשית יש להרדים את העכבר באמצעות 5% איזוף פלואור, 95% חמצן לאינדוקציה תוך שמירה על הרדמה עם 3% איזוף פלואור, 97% חמצן.

בצע חתך מדיאלי בחלק העליון של הגולגולת מבין העיניים לחלק האחורי של הגולגולת. נקו את הגולגולת עם מי חמצן ומי מלח סטריליים. אתר וסמן את B ו-Lambda לקביעת קואורדינטות סטריאוטקסיות עבור תצורות גירוי אופטוגנטי של אלקטרודות חורי בורג ראשוניים עם מקדחה דנטלית במהירות גבוהה עם סיבית כדורית של 0.5 מילימטר ואחריה סיבית כדורית של 0.7 מילימטר.

הכנס את ברגי האלקטרודה קלו גרם לתוך החורים בעזרת מברג יד מחורר. הסע אותם בכארבע עד חמש סיבובים כדי להשיג את העומק הרצוי. החזק את צינוריות ההנחיה במקומן עם צינורית סטריאוטקסית, ולאחר מכן הצמד אותן לגולגולת ולעוגנים עם מלט אקרילי כדי לשמור על סבלנות, כל צינורית מנחה צריכה להכיל צינורית דמה או סטילט מרגע הניתוח ועד לזמן הניסוי.

לאחר מיקום EEG וצינוריות מנחה בגולגולת, חבר אותם יחד עם שכבה דקה של מלט אקרילי דנטלי. לאחר שהגדרות המלט ממקמות את מחבר הפלסטיק מעל תלולית המלט המיובשת הנמכרת בקצות החוטים הנובעים מה-EEG מוביל למגעים במחבר הפלסטיק למקרה שהחוט מוביל במלט. לאחר מכן משוך את חוטי האלקטרומיוגרמה דרך שרירי הגרעין על ידי החלקתם לתוך הקנה של מחט בגודל 21.

מנוקב דרך השריר קושר קשר מנתח כפול, תפר ניילון חמש אפס סביב החוטים הללו, רק דיסטלי למקום שבו הם יוצאים מתפר השריר בחזרה יחד, העור שנסוג כדי לגשת לרקמת השריר עם קשרי מנתח בודדים שנקטעו באמצעות חיתוך הפוך, P, שלוש מחטים וחמש אפס ניילון. לאחר שיחידת הגירוי mc מתוכנתת, הפעל אותה כמחולל אותות עצמאי כאות הפעלה-כיבוי בינארי של חמישה וולט. חבר את יחידת הגירוי mc ליחידת הכוח התומכת ב-TTL של הלייזר באמצעות מחברי BNC.

חבר את יחידת כוח הלייזר ללייזר באמצעות כבל סרט. חבר גם את הלייזר למחבר FC הזכר בכבל תיקון הסיב האופטי המקורי. חבר את כבל הסיב האופטי המקורי למפרק הסיבובי.

קומוטטור מפרק סיבובי סיבים אופטיים משמש כקומוטטור. כאשר החיה נעה סביב הכלוב שלה, המפרק הסיבובי מסתובב כדי למנוע שבירה של כבלי הסיבים האופטיים עקב מומנט סיבובי. בעזרת קשרי כבלים מפלסטיק הצמידו את הקומוטטור למעמד מתכת המוצב מעל הכלוב הגלילי בו שוכנת החיה.

רסנו את העכבר באמצעות יד אחת כדי להצמיד את העכבר מתחת לכף היד המכווצת. כוון את הראש בין האצבע האמצעית לאצבע המורה של הנסיין. כעת נקה את צינורית ההנחיה מפסולת, פסולת באמצעות מחט סטרילית בגודל 25.

לאחר מכן הכנס את כבל הסיב האופטי ביד והדק אותו לצינורית מוביל הסיבים האופטיים עם מכסה בורג הברגה. שלוט בעומק ההחדרה של כבל הסיב האופטי למוח על ידי קשר תפר הקשור על כבל הסיב האופטי במרחק קבוע מהקצה השסוע השטוח. החיישן מושווה למי מלח חוצץ פוספט ונחשף לשלושה ריכוזים של L לקטט בצורה מדורגת.

לפי פרוטוקולי היצרן, הכנס את החיישן המכויל מראש לתוך צינורית מוביל הלקטט המותקנת על הגולגולת באופן זהה להליך החדרת כבל הסיב האופטי. חבר את חיישן הלקטט לקדם ampחיים יותר של החיישן הביולוגי פסגה 8, 400 עם מחברי תקע דו קוטביים. לאחר מכן חבר את המגבר המקדים הזה למחבר שמונת הפינים על תושבת הראש המושתלת בניתוח.

לפני איסוף נתונים, השתמש בכפתור בקרת עוצמת הלייזר כדי להתאים את עוצמת הגירוי האופטוגנטי. משרעת תגובת ה-EEG תשתנה בין בעלי חיים עקב גורמים שלא נחקרו באופן שיטתי. לכן יש צורך להתאים את עוצמת הגירוי האופטוגנטי ולוודא שתגובת ה-EEG מספקת כאשר התגובה הרצויה מושגת.

אסוף נתונים באמצעות מערכת Pinnacle 8, 400 עם ציון הנוירו. ממשק SEIA מסווג את מצבי השינה על ידי בדיקה ויזואלית של תהליך הנתונים EEG ו-EMG. הנתונים בתקופות של עשר שניות כמו תנועת עיניים לא מהירה, שינה או תנועת עיניים מהירה על סמך EEG ו-EMG.

תצורת גירוי אופטוגנטי ביו-חיישן זו מציגה את אלקטרודות ה-EEG המושתלות בניתוח, חיישן הלקטט והצינורית לגירוי אופטוגנטי. בהיעדר גירוי אופטוגנטי, עכבר זה עבר שינה ספונטנית. מעברי מצב ערות בזמן ש-E-E-G-E-M-G וריכוז הלקטט המוחי נוטרו ברציפות ערות ושני תת-סוגי השינה.

תנועת עיניים מהירה ותנועת עיניים לא מהירה מוגדרות על סמך ה-EEG וה-EMG. מעניין שזרם החיישן הביולוגי של לקטט עולה כפונקציה של EEG במשרעת נמוכה, ויורד כפונקציה של EEG במשרעת גבוהה. שני ערוצי ה-EEG מגיבים לגירויים אופטוגנטיים המועברים בקליפת המוח הקדמית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתיל עכבר בניתוח לצורך מניפולציה אופטוגנטית בו זמנית ומדידה של האלקטרואנצפלוגרמה, האלקטרומיוגרמה וריכוז הלקטט במוח. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה כירורגית זו כראוי תוך 90 עד 120 דקות. זכור לעקוב כל הזמן אחר הנשימה של החיה כמדד לעומק ההרדמה.

אם בעל החיים נושם בתדירות נמוכה יותר מפעם בארבע עד חמש שניות, ההרדמה עלולה להיות עמוקה מדי. אם החיה נושמת בתדירות גבוהה יותר מפעם בשתי שניות, ההרדמה עלולה להיות קלה מדי. זכור לנקוט באמצעי הבטיחות המתאימים בעת שימוש בחומר ההרדמה בגז הוא פלואור.

הקפידו על אוורור נאות בחדר הכירורגי כדי להגן על הרשתית מפני הלייזר המשמש לגירוי אופטוגנטי. הרכיבו משקפי מגן או סגרו את החיה בארון אטום לאור. תרצה לתרגל השתלת חיישן הלקטט הביולוגי וכבל הסיב האופטי בעכבר ער לחלוטין.

עכברים אינם עומדים בנהלים אלה ויש לשתק אותם. עם זאת, הריסון אינו יכול להיות כה חזק עד כדי פגיעה בבעל החיים או מניעת נשימה.