השתלת אב עורקים בעכברי orthotopic לחקר מחלת כלי דם
28 בנובמבר 2012
אנו מתארים טכניקה שבה קטע של אב העורקים בבטן מעכבר הושתל orthotopically ממש מתחת לעורקי הכליה בנמען אלוגנאית או syngeneic. טכניקה זו יכולה להיות שימושית במחקרים בם השתלה של עורקים גדולים של גודל אחיד נחשבת יתרון.
מטרת הליך זה היא להשתיל אביקום בטני של עכבר תורם אל עכבר רקיב אלוגנני. הדבר משיג תחילה על ידי השגת האביקום מהתורם, ולאחר מכן, על ידי הכנת אתר השתלה בחיה הרקיבה.
לאחר מכן מנתחים ומחלקים את האורטה המקורית של בעל החיים המקבל. השלב הסופי הוא ביצוע שתי אנסטומוזות וסקולריות מקצה לקצה (end-to-end) להשתלת אורטת התורם. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהליך זה כדי לחקור את התפתחותן של מחלות וסקולריות לאחר השתלה בשילובי זנים אלוגנאיים.
היתרון של שיטה זו על פני השתלה הטרוטופית של לב, למשל, הוא שהניתוח המורפומטרי קל יותר לביצוע מכיוון שהכלי דמים הם בגודל אחיד. בנוסף, כלי הדם אינו מוקף ברקמה פרהנכימלית, שעלולה להיות מוקפת בתסננת תאית ובגורמים אחרים שעלולים לסבך את ניתוח הנתונים שהתקבלו. שימוש בטכניקה זו עשוי להיות מועיל במיוחד להדגמת המנגנונים המעורבים במחלות וסקולריות לאחר השתלה, המהוות בעיה שקשה לטיפול בהשתלות קליניות בבני אדם.
כדי למזער את השפעות הלחץ ולהמקסם את מאגרי האנרגיה שלהם, החזיקו את בעלי החיים בביבליום למשך 72 שעות לפחות לפני הניתוח. ביום הניתוח, הניחו לוח ניתוח מתכתי על גבי פד חימום המכוון ל-35 עד 38 °C. לאחר ההרדמה, הסירו את הפרווה מהבטן הוונטרלית של בעל החיים.
השתמשו בסרט הדבקה למעבדה כדי לקבע את בעל החיים בתנוחת פריסה (spread eagled) על שולחן הניתוח, ולאחר מכן חטאו את כל האזור הגולח של בעל החיים שלוש פעמים באמצעות חומר חיטוי ולאחריו אתנול, תוך שימוש במספריים סטריליים. לאחר מכן, בצעו חתך דרך דופן הגוף כדי לחשוף את איברי הבטן. לאחר מכן, השתמשו במקלון צמר גפן סטרילי כדי לדחוק את האיברים ה פנימיים הצידה על גבי פיסת גזה סטרילית הלחה בתמיסת סלין חמה, ובכך לחשוף את כלי הדם הגדולים של הבטן.
כעת, בזהירות רבה, בצעו דיסקציה קהה להרחקת אבי העורקים הבטני (abdominal aorta) מהרקמות הסובבות, כולל הווריד החלול התחתון (inferior vena cava), ולאחר מכן הרימו בזהירות ובצעו כauterization לעורקי המותניים (lumbar arteries). קטע אבי העורקים המיועד לדיסקציה צריך להימצא מתחת לכלי הדם הכליתיים ומעל לפיצול של אבי העורקים לעורקי הפמור (femoral arteries). לאחר זיהוי האזור, קשרו תפר אחד ממש מתחת לעורקים הכליתיים ותפר נוסף ממש מעל לפיצול.
בשלב הבא, השתמש במספריים כדי לחתוך את האורטה ולאחר מכן אחז בזהירות רבה בקצה אחד של כלי הדם וטפטף תמיסת סליין עם הפרין כך שתזרום דרך כלי הדם בכוח הכבידה. לאחר מכן, השתדל לגעת בקצוות כלי הדם כמה שפחות. הוצא את השתל והנח אותו מיד במיכל עם תמיסת סליין קרה מאוד (בקרח).
לאחר מתן הרדמה ושיכוך כאבים לבעל החיים המקבל, גדלו את הבטן הוונטרלית כפי שהודגם. מרחו משחה עינית של gentamicin על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש, ולאחר מכן חטאו את הבטן כפי שהודגם כדי להבטיח חיטוי הולם. כעת בצעו חתך בקו האמצע דרך העור ודופן הגוף בשלבים.
לאחר מכן, הכניסו מורחב כדי להחזיק את החתך הבטני פתוח, כאשר מכלול הבור פונה לעבר החלק האחורי של בעל החיים כדי להרחיק את גוף התפס מדרך העבודה. לאחר מכן, הניחו גזה סטרילית ספוגה בתמיסת סלין על המעיים. לאחר מכן, החזיקו את הגזה בעדינות במקומה באמצעות אצבע.
החדירו מקלון צמר סטרילי מתחת למעיים, והסיטו אותם בעדינות כך שהמעיים ינוחו על הגזה. הניחו פיסת גזה סטרילית נוספת על המעיים והרטיבו אותה בתמיסת סליין. לאחר הסרה עדינה של כל רקמה שומנית המכסה את ה-ATA ואת ה-inferior vena cava, השתמשו בפינצטה כדי לנתח בזהירות את ה-infrarenal aorta מה-inferior vena cava.
כעת פנו שטח גדול מספיק כדי לאפשר מקום לשני תפסנים, עם מספיק כלי דם כך שבעת החלוקה, יישאר מספיק כלי דם שניתן יהיה לתפור אליו את הש transplanted graft. שימו לב שניתן להשתמש בתפר השחור כדי להרגיש את המשקל לאורך כלי הדם. בעת הדיסקציה חפשו ענפים של כלי דם, וכבשם באמצעות מכשיר כבישה (cauterizer) בטמפרטורה נמוכה לפי הצורך.
בשלב הבא, הכניסו סגור כלי דם אחד ממש מתחת לעורק הכליה וסגור כלי דם נוסף ממש מעל הפיצול (bifurcation). לאחר מכן, גזרו את האורטה. במקרה זה, הגזירה מבוצעת קרוב יותר לפיצול מכיוון שכלי דם מסתעף נצרב בקרב המרחק שבין שני הסגורים, מה שהפך נקודה זו לבלתי מתאימה לאנסטומוזה; קצות האורטה יסוגו בדרך כלל, וישאירו רווח של כ-5 מילימטרים.
בדוק את ההמוסטזיס. אם התופסנים פועלים כראוי, רק כמות קטנה של דם אמורה לחדור החוצה לאחר החיתוך. לאחר מכן, שטוף את הקצוות החתוכים של האאורטה בתמיסת סליין עם הפרין וספוג את עודפי התמיסה.
כעת קבעו את השתל למקומו באמצעות שלוש תפרים נפרדים בכל קצה. לאחר מכן, תפרו צד אחד של האנסטומוזה בכל קצה והשלימו את השאר באמצעות שבעה עד שמונה תפרים נפרדים. אם מועדפת תפירה רצופה, יש להקפיד שדפנות כלי הדם יישארו רפויות ושלא תיווצר היצרות באנסטומוזה.
כעת הסירו בזהירות את התסמין מקצה האורטה הקראניאלי ובדקו אם קיימות דליפות בקו התפרים. לאחר מכן, לחצו בעדינות על האורטה מעל אתר האנסטומוזה באמצעות מקלוני צמר ספוגים והסירו את התסמין השני. לחצו בעדינות ושחררו את האורטה מספר פעמים כדי לוודא שהכלי פתוח (patent). השתל יקבל זרימה מיידית וניתן יהיה לראות דופק.
כעת, הסירו את הגזה המכסה את המעיים והחזירו אותם למקומם, תוך שמירה על הכיוון האנטומי הרגיל ומניעת פיתול. השתמשו בתפר Vicryl במידה 5-0 כדי לסגור את שכבת השריר, ולאחר מכן סגרו את העור באמצעות תפר proline במידה 5-0 או 6-0. טפלו בעכבר תת-עוריים ב-carprofen כדי להגביר את האנלגזיה לפני סיום ההרדמה, ולאחר מכן הגבישו לעכבר 0.5 עד 0.8 milliliters של סליין באותו נתיב.
לבסוף, מקמו את העכבר בכלוב מחומם להתאוששות ועקבו אחר בעל החיים בקפידה. 12 ו-24 שעות לאחר הניתוח, ניתן לבעל החיים בופרנורפין וקרפרופן באופן תת-עורי, בהתאמה. איור ראשון זה מציג שסתום אאורטלי.
שימו לב לקווי התפרים כפי שסומנו על ידי החצים הלבנים כאן. מוצג ניסוי טיפוסי שבו נערך מעקב אחר הישרדות הרכיבים למשך תקופה של 56 ימים. קבוצת הביקורת כללה עכברים רכיבים מסוג wild type C 57 BL six by FVB שהושתלו בהם אאורטות של bowel C.
הקבוצה הניסויית כללה מקבלים מסוג C 57 BL six by FVB, עם Deficiency בביטוי של heme oxygenase one. נוקאאוט זה מוביל לטרומבוזה של השתלים בתוך 24 שעות. ראוי לציין כי הדבר הוביל למותם של כל המקבלים.
איור זה מראה את מדידות האקו של הוריד הרחב התחתון, הוריד החלול והאבי aorta הבטנית בבעלי חיים בריאים ובמקבל השתלה. שימו לב שהשתל פתוח ודומה במראהו ל-aorta שאינה מושתלה. כפי שראיתם, הרקמות עדינות וקטנות מאוד, ולכן עליכם לזכור שפרוצדורה זו היא בהחלט מיומנות נרכשת, ולפיכך יידרש תרגול רב לפני שניתן יהיה לבצע את הפרוצדורה בהצלחה ובצורה שגרתית, לאחר השליטה בה.
ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה להשתלה אורתוטופית של מקטע מהאביאלט הבטני מעכבר תורם לעכבר מקבל. שיטה זו מועילה במיוחד לחקר התפתחותה של מחלה וסקולרית לאחר השתלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- טכניקות השתלה
- ביולוגיה של כלי דם
- מודלים של עכברים
רקע
- השתלה של עורקים גדולים יכולה לספק תובנות לגבי מחלות וסקולריות.
- הבנת סיבוכים לאחר השתלה היא קריטית לשיפור תוצאות ההשתלות.
- מודלים אלוגנאיים וסינגנאיים מסייעים בחקר תגובות חיסוניות.
- טכניקה זו מאפשרת גודל השתלה אחיד, ובכך משפרת את העקביות הניסויית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה להשתלת אבי העורקים הבטני בעכברים.
- סיוע במחקרים על מחלות וסקולריות לאחר השתלה.
- בדיקת ההשפעות של שילובים שונים של זנים בהשתלות אלוגניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קצירת אבי העורקים הבטני מתור עכבר.
- הכנת אתר השתלת הש graft בעכבר המקבל.
- הסרה וחלוקה של אבי העורקים המקורי של המקבל.
- ביצוע אנסטומוזיס וסקולרית מקצה לקצה להשתלת אבי העורקים של התור.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת ביצוע מוצלח של השתלה של אבי העורקים הבטני (abdominal aorta).
- ניתן לחקור מחלות כלי דם לאחר השתלה באמצעות מודל זה.
- שילובי זנים שונים מספקים תובנות לגבי תגובות חיסוניות.
- השיטה מבטיחה אחידות בגודל הש Transplant למטרות ניסיוניות.
מסקנות
- טכניקת השתלה זו בעלת ערך למחקר כלי דם.
- היא מספקת פלטפורמה לחקר סיבוכים לאחר השתלה.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להגביר את ההבנה של ביולוגיה של כלי דם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
השתלה אורתוטופית של אבי העורקים בעכברים מספקת מודל פרה-קליני חסון לחקר מנגנונים של מחלה וסקולרית לאחר השתלה, המהווה אתגר מרכזי בהשתלות של איברים מוצקים. המודל מאפשר ניתוח מורפומטרי כמותי והשוואה ישירה בין כלי דם מושתלים לכלי דם טבעיים, ובכך תומך בביטחון חיזוי במחקרים של ביולוגיה וסקולרית. השחזוריות שלו ותכונות הבקרה הופכות אותו לבעל ערך לגילוי מוקדם ולהפחתת סיכונים מכניסטיים במסלולי פיתוח לטיפול במחלות וסקולריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח (R&D) בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מנגנוני פגיעה וכירור של כלי דם הרלוונטיים לפתולוגיה של השתלה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות גנטיות או פרמקולוגיות המעורבות בהיפרפלזיה אינטימלית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה בין תגובות אלוגניות לסינגניות.
- מספק מערכת מבוקרת למחקרים מונחי-השערה על התקדמות של מחלות כלי דם.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקימה פלטפורמה ניתנת לשחזור in vivo להערכת התערבויות פוטנציאליות המכוונות לשינוי מבני של כלי דם (vascular remodeling).
- תומכת בתוצרי מורפומטריה כמותיים להערכה סטנדרטית של נקודות סיום של מחלה.
- מאפשרת פיתוח בדיקות (assays) לפתולוגיה וסקולרית לאחר השתלה תוך שימוש בגודל ואנטומיה אחידים של כלי הדם.
- מקל על סריקה של מודלים גנטיים או סוכנים טיפוליים בהקשר וסקולרי מבוקר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים רלוונטיים למחלה שנצפו בווסקולופתיה של השתלה בבני אדם.
- מספק רציפות מממצאי שלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות כלי דם.
- תומך בקידום מותאם-סיכונים של מועמדים טיפוליים המכוונים לסיבוכים וסקולריים.
- מאפשר פיתוח של ביומרקרים תרגומיים באמצעות דימוג ואנליזה ישירה של רקמות.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
מודל זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, תיקוף המטרה והערכה פרה-קלינית למחקר של מחלות כלי דם, במיוחד בהקשר של השתלה.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על פגיעה בכלי דם, תגובה חיסונית ומנגנוני תיקון.
- סריקה: מספקת בדיקה (assay) סטנדרטית הניתנת לשחזור לצורך הערכת התערבויות ושינויים גנטיים.
- אנליטיקה: מאפשרת קריאות מורפומטריות כמותיות ומבוססות דימיון לצורך השוואה חסונה של נתונים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמה למשפיעני קצה קליניים במחקרי וסקולופתיה לאחר השתלה.
- שימוש חוזר בארגון: מציעה פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה למחקרי מחלות כלי דם מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במידול של מחלות כלי דם.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה בין קבוצות ניסוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go עבור תרופיהות המכוונות לכלי דם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים המטפלים בסיבוכים וסקולריים הקשורים להשתלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות והכשרה מתקדמת במיקרו-כירורגיה כדי להשיג תוצאות עקביות.
- דורש כלים כירורגיים מיוחדים ותשתית דימות לצורך ניתוח מורפומטרי.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאית של פרוטוקולים כירורגיים ואנליטיים בין צוותים שונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זני עכברים שונים או רקעים גנטיים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את עקומת הלמידה הטכנית ושיקולי רווחת בעלי החיים.
