הדמיה תהודה מגנטית תפקודית (fMRI) עם גירוי שמיעתי בציפורי שיר

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים פרוטוקול מותאם להדמיה מוצלחת של תפיסה ועיבוד קול באזורי השמיעה ובקרת השירה במוח של ציפור שירה. באמצעות MRI תפקודי, מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת גירויים שמעיים באיכות גבוהה, אשר ניתן לשלב בפרדיגמה של בלוקים (on-off) להצגה בפני הציפור במהלך סריקת MRI תפקודי או fMRI. השלב השני הוא הכנת הציפור לסריקה, תחילה על ידי הרדמה, ולאחר מכן על ידי מיקומה על מיטת בעלי חיים מותאמת, שמונחת לאחר מכן בתוך חור הסריקה של מכשיר ה-MRI. לאחר מכן ניתן לרכוש תמונות fMRI במהלך גירוי שמעי.

השלב הסופי הוא עיבוד מקדים של נתוני ה-MRI שנרכשו, כולל נורמליזציה של התמונות לאטלס של התוכי זברה (zebra finch). בסופו של דבר, נעשה שימוש בניתוח סטטיסטי מבוסס ווקסלים (voxel based analysis) כדי לאפשר ויזואליזציה של התוצאות שהתקבלו ואיתור של הפעלות המוחיות שהושרות על ידי הגירויים השמיעתיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות נפוצות יותר במחקר של ציפורי דבש, כגון אלקטרופיזיולוגיה, היסטולוגיה וטכניקות של מיפוי מולקולרי, הוא ש-FMRI היא שיטה לא פולשנית in vivo, המאפשרת לחקור את אותו נבדק לאורך זמן ולבחון את המוח כולו בבת אחת, ללא השערה מוקדמת לגבי המיקום של התשתיות העצביות המעורבות בתהליך הנחקר.

אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להיתקל בקשיים, שכן יישום MRI פונקציונלי בעופות שונה מאוד ומאתגר הרבה יותר מאשר שימוש באותה שיטה בבני אדם או במכרסמים. זאת לא רק בשל גודלם הקטן של מוחותיהם של נבדקים אלו, אלא גם משום שגולגולתם מורכבת מחללי אוויר רבים הגורמים לארטפקטים של סוסיבליות (susceptibility artifacts); באמצעות שימוש ברצף spin echo, שפחות רגיש לארטפקטים אלו בהשוואה לרצף gradient, ניתן לבצע הדמיה פונקציונלית של המוח השלם של ציפור השיר ברזולוציה מרחבית טובה מאוד. חור הסורק הוא חלל סגור שעלול לעוות את הגירויים השמיעתיים.

לכן, כדי להתחיל בהכנות לפרוטוקול זה, הקליטו את גירויי הקול בזמן שהם מושמעים בתוך פתח המערכת של ה-seven T MR באמצעות מיקרופון סיב אופטי, ואמתו את העיוותים עבור מערכת ה-MRI שבה נעשה שימוש. כאן ניתן לראות את התדרים שהוגברו ואלו שדוכאו, כפי שמופיע בהקלטות של רעש לבן שבוצעו מחוץ לסורק ובמיקום של ראש הציפור בתוך פתח המגנט. כדי לפצות על הגברה מלאכותית זו, החילו פונקציית איקוולייזר על כל גירוי באמצעות תוכנת wave lab עבור ההגדרות המוצגות.

בפרוטוקול זה, הפונקציה מורכבת מגרעין גאוסיאני (Gaussian kernel) עם הפרמטרים המוצגים על המסך. כאן, גירויי השירים צריכים להיות מורכבים ממספר מוטיבים של שיר בודדים של ציפור ספציפית, כאשר ביניהם שולבו תקופות של שתיקה; יש להתאים את משך תקופות השתיקה הללו כדי לשמור על כמות זהה של קול ושתיקה בכל הגירויים. האורך הכולל של כל גירוי הוא 16 שניות, מה שמתאים לזמן הרכישה של שתי תמונות FMRI.

השתמשו בתוכנת הכנה כדי לנרמל את העוצמה של כל שיר במונחים של matched root means square ולחלץ תדרים נמוכים בעזרת מסנן מעביר גבוה (high pass filter) ב-400 hertz לפני השילוב לתוך גירוי שלם. ניתן לתכנן את הניסוי באמצעות תוכנת הצגה תוך שימוש במבנה בלוקים של on off, שבו תקופות של גרייה שמיעתית יחליפו תקופות מנוחה. כל בלוק צריך להימשך 16 שניות, בהתאמה לזמן הרכישה של שתי תמונות; הציגו כל סוג גירוי 25 פעמים, מה שיוביל לרכישה של 50 תמונות לכל גירוי ולכל נבדק.

יש להגריל את סדר הצגת התנאים הן בתוך נבדקים והן בין נבדקים. כמו כן, יש להגדיר את הפרדיגמה הניסויית כך שתקבל טריגרים מהסורק. דבר זה מבטיח שבמהלך הסריקה בכל חזרה בתוך רצף ה-FMRI, תוכנת הסורק תשלח טריגר לתוכנת ההצגה השמעית, אשר בתורה תרשום את מספר הסריקה ותבצע את הפקודה המתאימה.

כאן אנו מציגים פרוטוקול המותאם במיוחד לשימוש בפינצ'ים זברה בוגרים. יש לשכן את פינצ'י הזברה בכלובים תחת מחזור תאורה של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, עם גישה חופשית למזון ומים לאורך כל המחקר. המספר המינימלי של פרטים לניסוי הוא 15.

מספר זה לוקח בחשבון את הרגישות של spin echo FMRI ואת השונות הבינ-אינדיבידואלית הטבעית של התופעות הביולוגיות שנמדדו בניסוי. כדי להיערך לניסוי, ראשית, חברו את מסכת המקור למכשיר בקר הגז באמצעות צינורות פלסטיק והתקינו אותה על מיטת ה-MRI של מערכת MR בעוצמה של שבע T. פתחו את שני בקבוקי הגז של החמצן והחנקן והפעילו את מכשיר בקר הגז.

כמו כן, הפעילו את המערכת בעלת בקרת המשוב ואת מכשיר זרימת האוויר המחומם. לאחר מכן, הרדימו את הזיבר-פינץ' (zebra finch) באמצעות 3% isof fluorine בתערובת של חמצן וחנקן, על ידי הכנסת מקורו למסכה והחזקת הראש עד שהציפור מורדמת לחלוטין. ניתן לוודא זאת על ידי משיכה עדינה של כף הרגל.

כאשר העוף נמצא תחת טשטוש מלא, הוא לא יסוג ברגל. בנוסף, עיניו של העוף יהיו עצומות. הכניסו חיישן טמפרטורה לקלואקה כדי לעקוב אחר טמפרטורת הגוף לאורך הניסוי, והניחו חיישן פנאומטי תחת הבטן כדי לנטר את קצב הנשימה.

לאחר מכן, הניחו רתמה כדי לקבע את גוף הציפור לאורך כל הניסוי. שמרו על קצב נשימה שבין 40 ל-100 נשימות לדקה ושמרו על טמפרטורת גוף קבועה של 40 מעלות. אם טווח הנשימה נמוך או גבוה מדי, התאימו את רמת ההרדמה בהתאם.

אם הבעיה נמשכת, יש להפסיק את הניסוי ולהוציא את בעל החיים מהמערך. כדי לסייע בהתאוששות, מקמו רמקולים דינמיים לא-מגנטיים משני צדי ראשו של ה-zebra finch וחברו אותם למגבר. ודאו שכבלי הרמקולים מרוחקים מגשוש הטמפרטורה, שכן הדבר עלול להשפיע על קריאת הטמפרטורה.

כאשר המרחק קרוב מספיק, מקמו את סליל RF הפשטי (surface RF coil) על ראשו של הזיברה פינץ'. לאחר מכן, מקמו את הזיברה פינץ' במרכז המגנט. לבסוף, הפחיתו את רמת ההרדמה ל-1.5% ISO fluorine לפני הסריקה.

כדי להתחיל בסריקה, קבעו תחילה את מיקום המוח במגנט. רכשו סט אחד של תמונות scout בעלות gradient ו-echo של פרוסה בודדת במישורים הסגיטלי, האופקי והקורונלי, וכן תמונות scout של מספר פרוסות המשמשות לאחר מכן למיקום הסריקות הפונקציונליות. לאחר מכן, הפחיתו את הרעש של הגרדיאנטים על ידי הגדלת זמני ה-ramp שלהם ל-1000 microseconds.

בשלב הבא, הכינו רצף fMRI המשוקלל ל-T2 מסוג rapid acquisition relaxation enhanced, המכונה גם rare. הגדירו 15 פרוסות סגיטליות המכסות כמעט את כל המוח. כעת, בחרו בפרוטוקול השמע בתוכנת ההצגה כדי להבטיח שתוכנת הצגת השמע לא תפספס אף טריגר מהסורק.

הפעילו תחילה את הפרוטוקול השמיעתי. לאחר שהפרוטוקול נטען במלואו, התחילו את רצף ה-FMRI. לפני כל ניסוי FMRI יש לבצע רכישה של 10 תמונות דמי (dummy images) כדי לאפשר לאות להגיע למצב יציב לפני תחילת הגירוי השמיעתי.

לאחר השלמת הרכישה, בצעו אפס. השלימו את הנתונים ל-64 על 64. כדי לקבוע את איכות הנתונים, בצעו סקירה ראשונית של התוצאות באמצעות הכלי הפונקציונלי.

בתוכנת ParaVision, חשבו את תגובת ה-BOLD הדיפרנציאלית בין כל בלוקי הגירוי (on blocks) לבין קו הבסיס (baseline). אם לא נצפתה אקטיבציה באזורי השמיעה הראשוניים, ייתכן שהציפור לא שמעה או עיבדה את הגירויים השמיעתיים בשל בעיות טכניות או רמת ההרדמה. יש לאמת את ההגדרות ולחזור על המדידה.

לאחר רכישה פונקציונלית, בצעו רצף T2-weighted אנטומי תלת-ממדי באותה אוריינטציה כשל סריקות ה-fMRI הקודמות. לאחר מכן, בצעו zero-fill לנתונים אלו לרזולוציה של 256x256x256.

לבסוף, הוציאו את פינקש הזיברה ממיטת ה-MRI ואפשרו לו להתאושש מההרדמה בכלוב תחת מנורת חימום. בדרך כלל, ההתאוששות של פינקש זיברה מהרדמה ב-ISO fluorine אורכת פחות מחמש דקות. לאחר מספר דקות בלבד, הציפור תנסה לעמוד, וברגע שהציפור תהיה בהתאוששות מלאה, היא תעמוד על ענף במקום לשבת בתחתית הכלוב, וניתן יהיה להתחיל בעיבוד הנתונים.

ראשית, המירו את נתוני ה-MR לפורמט analyze או nifty. לאחר מכן, לפני תחילת עיבוד הנתונים ב-SPM, יש להתאים את נתוני ה-FMRI של הציפורים על ידי הכפלת גודל הווקסל ב-10. מאחר שתוכנת ניתוח ה-FMRI פותחה לעיבוד נתוני FMRI שנרכשו מבני אדם, הדרך הפשוטה ביותר להתקדם היא להגדיל באופן מלאכותי את גודל הווקסל של נתוני ה-FMRI של הציפורים באמצעות תוכנת MRI Crow.

שימו לב כי התאמה זו אינה משפיעה על הנתונים עצמם. לא בוצע דגימה מחדש או כל שינוי אחר בנתונים. בשלב הבא, הנתונים שנרכשו עוברים עיבוד מקדים.

בעזרת SPM eight, בצעו תחילה יישור מחדש (realignment) של נתוני ה-FMRI וביצעו רישום משותף (coregistration) של מערך הנתונים האנטומיים התלת-ממדי לסדרת הזמנים של ה-FMRI. לאחר מכן, נרמלו את הנתונים התלת-ממדיים ואת סדרת זמני ה-FMRI שעברה רישום משותף לפי האטלס של מוח זברה-פינץ' (zebra finch brain MRI Atlas).

החיל את מטריצת הטרנספורמציה על מערך נתוני ה-FMRI והחלק את הנתונים באמצעות גרעין גאוסי של 0.5 millimeter. לאחר מכן, בצע ניתוח סטטיסטי מבוסס ווקסלים ב-SPM eight, תחילה ברמה של הציפורים הבודדות, ולאחר מכן ניתוח ברמת הקבוצה. לבסוף, כדי להמחיש את התוצאות ולאתר את ההפעלה הפונקציונלית, השליך את המפה הפרמטרית הסטטיסטית על אתלס הזיברפינץ', אתלס המוח התלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של הזיברפינץ'; הקואורדינטות הסטריאוטקטיות ששימשו בניתוח המתואר של תוצאות ה-FMRI של הזיברפינץ' תוכננו לניסוי זה במעבדת ה-Bioimaging, במערך נתוני ה-MRI Atlas.

תיחומי המוח ותיחומי הגרעינים זמינים באופן חופשי דרך האתר המופיע כאן. כאן מוצג מבט צדי של ייצוג תלת-ממדי של ההמיספירה השמאלית, עם מבנים מתוחמים מהאטלס המוקרנים על החתך המיד-סגיטלי שלה. כאן ניתן לראות דוגמה לתגובת BOLD ב-fMRI באזור השמיעתי הראשוני, שדה L, ובאזורים שמיעתיים משניים סמוכים, אשר עוררו על ידי גירויים שמיעתיים שונים בהשוואה למצב המנוחה.

ערכי T מקודדים בצבעים על פי הסולם המוצג בדמות, ורק ווקסלים שבהם נמצא כי מבחן T הוא מובהק מוצגים. זוהי דוגמה נוספת לניסוי FMRI בתוכי זברה. התמונות מראות תגובות סלקטיביות לשירת הציפור באזורי המוח XMLD ו-HVC.

המספרים שמתחת לתמונות מציינים קואורדינטות במילימטרים מקו האמצע. סימן חיובי מציין כי הפרוסות והתוצאות הסטטיסטיות הן מההמיספירה הימנית. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול המתואר בסרטון זה ליישומים בציפורי שיר אחרות, כגון זרימורים.

זוהי דוגמה לתוצאות של ניסוי FMRI כזה. בזרינק, הדמות מראה הפעלות שנוצרו על ידי גירויים שמיעתיים לעומת מנוחה באותו פרט לאורך עונות השנה. היישום והאופטימיזציה של MRI תפקודי בציפורים שרות פותחים נתיבי מחקר חדשים בתחום המחקר של ציפורים שרות.

כבר הוכח כי זוהי טכניקה בעלת ערך עבור ניתוח ניסיוני של תהליכים קוגניטיביים, סנסוריים ומוטוריים מורכבים העומדים בבסיס התקשורת הקולית במודלים בעלי חיים אלו. בנוסף, הודות לאופיה הבלתי פולשני ולגישתה המקיפה את כל המוח, ניתן להשתמש ב-FMRI כשיטה משלימה להספק מידע עבור שיטות פולשניות ומקומיות המבוצעות בנפוץ יותר. המספר הגדל של ניסויי FMRI בציפורי שיר מעיד על ישימותה לשאלות מחקר קוגניטיביות, ומאמץ עתידי שיש להשקיע כדי להרחיב עוד יותר את ניסויי ה-MRI מעבר לעיבוד שמיעתי, שהוא תהליך שנותר פעיל תחת הרדמה, הוא השימוש בנבדקים ערים שהתרגילו לפרוטוקול ההדמיה.

דבר זה עשוי להציע אפשרויות מחקר חדשות שבהן ציפורים יוכלו להשתתף באופן פעיל בניסויי EMI, ושבהן ניתן יהיה להשפיע באופן ניסויי על קשב הציפורים.