בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, לאפיין ולהבדיל בין תאי גזע אנושיים של דופק גוי לבין שיניים קבועות באמצעות שתי שיטות. זה מושג על ידי איסוף שיני בינה כלואות בריאות, חיתוך שלהן סביב צומת המלט לאמייל בהתחלה. תאי גזע פולי דנטליים D PSCs מבודדים בשתי שיטות שונות.

בשיטה הראשונה, רקמות פוליפ מתעכלות אנזימטית על ידי דגירה בקולגנאז מסוג אחד פלוס תמיסת חלל דיסק. כאן אנו קוראים להם אד. בהתחשב בשיטת הבידוד בשיטה השנייה, רקמות מישוש מונחות רק לתוך הבקבוק ללא כל עיכול.

באופן זה, dpss מתחילים לנדוד מרקמה לבקבוק. תאים אלה הנקראים OG מתייחסים לשיטת בידוד הצמיחה. השלב השני של ההליך הוא זיהוי תאי גזע באמצעות ציטומטריית נפילה.

השלב השלישי של ההליך הוא אינדוקציה של התמיינות אודונטובלסטים, והשלב האחרון של ההליך הוא הערכה השוואתית של בידול אודונטובלסטים בין שתי קבוצות על ידי צביעה אדומה ו-QBCR. אני RA Kde מהמחלקה לתאי גזע וביולוגיה התפתחותית במכון ריאן. היום אני הולך להראות לכם את הבידוד, האפיון וההתמיינות ההשוואתית של תאי גזע מזנכימליים אנושיים באמצעות שתי שיטות.

שלום, אני ד"ר רזאיאן ממכון ריו. אנו עובדים על פרויקט שקשור לתאי גזע של מוך שיניים אנושי. תאים אלה הם סוג של תאי גזע מכיים, שקל להשיג אותם במינימום כאב ותחלואה.

תאי גזע מכיים מגדירים יכולת אראן פלסטית, היווצרות מושבות ויכולת התמיינות מרובה. שלום, אני ד"ר עמי מהמחלקה לתאי גזע. במכון, אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לבודד תאי גזע לצורך מחקרים ויישומים עתידיים.

ברפואה רגנרטיבית, הצעד הראשון לשימוש במקור זה של תאי גזע לטיפול עתידי מבוסס תאי גזע הוא בחירת הפרוטוקול הטוב ביותר לבידוד תאי גזע מרקמת החלק האנושי. על מנת להשיג מטרה זו, חיוני לחקור היבטים מסוימים של התנהגות תאית בתנאי בידוד תאי גזע שונים. ראשית, אני הולך לבודד תאי גזע אנושיים של מוך השן על ידי שימוש בדיסוציאציה אנזימטית של מוך השן או צמיחה של תאי גזע משתלי רקמה.

לאחר מכן לאפיין ולהבדיל אותם לפיצוץ עוגן. אז בואו נתחיל. דרך ראשונה, חלל וקולגנאז סוג 1 מתמוססים שניהם ב-PBS.

לאחר מכן סנן אותם באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרון. משוך את שניהם לצינור חרוטי. לאחר מכן הוסף עט ו-PBS כדי להשיג ריכוז סופי.

להעביר שיני בינה בריאות למעבדה במדיום הבסיסי הקר בתנאי פלדה. נקו את פני השן ב-70% אתנול לפני הלימודים. הקפידו לנקות את הרוח מפני השטח של השן.

חותכים שן סביב צומת אמייל המלט באמצעות דיסק דנטלי מעוקר כדי לחשוף את תא המוך. יש לקחת בחשבון כי יש לבצע תהליך חיתוך לאט כדי להפחית התחממות יתר של רקמת השיניים. לאחר מכן הפרד בעדינות את רקמת העיסה מהכתר פירושו רקמת מוך השן לחתיכות של מילימטר עד שניים עם להב סקרפה.

העבירו חתיכות קטנות של רקמות מוך השן לתמיסת אנזים אחת של מיליליטר למשך שעה אחת במערבולת של 37 מעלות צלזיוס כל 30 דקות כדי לסייע בפירוק רקמות מוך השן. לאחר מכן, הסר אגרגטים גדולים על ידי העברתם דרך זן תאים של 70 מיקרון. לאחר מכן הוסף PBS המכיל צנטריפוגות PENER ב -1, 200 סל"ד למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנאט בזהירות. לאחר מכן אנו משעים את הצלחת במדיום הריבוי pm מעבירים אותה לבקבוק התרבות ומוסיפים מדיום. ואז לדגור דגירה.

החלף את המדיום כל שלושה ימים עד להשגת מפגש התאים לשיטת העבודה. חזור על תהליך החיתוך. לאחר חיתוך שן פירושו לפוצץ רקמות למקטע של מילימטר אחד עד שניים.

לאחר מכן הכניסו אותם לתרבות. הבזק עם התפשטות, בינוני ומודגר. יש לקחת בחשבון כי הנפח הכולל של מדיום הריבוי חייב להיות תומך בהצמדה של כל החלקים לצמיחת תאים נוספת.

החלף את המדיום לאחר התבוננות בצמיחה ולאחר מכן כל שלושה ימים עד להשגת מפגש התאים. לאימונופנוטיפ, דגרו את שני סוגי ה-D PSCs עם נוגדנים מצומדים PE או FITC למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן הוסף תצוגות PBS וסנטי ב -1, 200 סל"ד למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט וההחייאה, תלה את הצלחת ב-PBS ולבסוף העריך את סמני פני השטח באמצעות תת-תרבית ציטומטר זרימה, שני סוגי DPCs לשלושה מעברים. לאחר מכן טריפ קרח והעביר אותם לשש מנות תרבית אדומות בשטף Co של 60% מחליף PM במדיום אודונטוגני. שלוש בארות נשארות כבקרה שלילית על ידי הוספת pm.

החלף את המדיום כל שלושה ימים ביום 21 תאי שטיפה עם PBS. ואז תקן אותם במיליליטר אחד לבאר. 10% גובה ג'ל פורמלי למשך 15 דקות בטמפרטורת הבית.

לאחר 15 דקות, הסר את הקיבוע בזהירות ואת תאי הרוח שלוש פעמים במים מזוקקים. לאחר מכן החלף מים במיליליטר אחד לכל אלזה אדומה בתמיסת כתם אדום. לאחר 20 דקות אנו מסירים עודפי צבע ושוטפים תאים ארבע פעמים במים נטולי יונים.

לאחר מכן הוסף מילימטר אחד לכל מי באר כדי למנוע את התייבשות התאים. לאחר הצביעה, אתה יכול לראות שלוש מסילות למעלה הופכות לאדום בהשוואה לפקדים תחת המיקרוסקופ, אתה יכול לראות ספיגת צבע דיסינג סביב התא על ידי הגדלה גדולה לכימות של צביעה אדומה. לאחר הוצאת מים, מוסיפים מיליליטר אחד לבאר, 10% חומצה חומצית, ואז מודגרים למשך 30 דקות בניעור.

לאחר מכן מגרדים בעדינות את התאים מהצלחת באמצעות מגרד תאים. ואז העבירו אותם לצינורות הנפרדים. VOR לוקח במרץ במשך 30 שניות.

לאחר מכן מחממים אותם ל 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כדי להימנע מצינורות איטום אידוי עם צינור העברה ParaView לקרח למשך חמש דקות, הם השתמשו בהם ב-20,000 גרם למשך 15 דקות. בינתיים, הפוך את אלצהיימר אדום לדילול סדרתי סטנדרטי על פי פרוטוקול האזור.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את החטף והעביר אותם לצינורות החדשים. לנטרל את ה-pH עם 10% אמוניום הידרוציט. לאחר מכן הוסף תקנים וגם דוגמאות ל-96.

צלחת היטב ואז למדוד את הספיגה ב-405 ננומטר ולנתח נתונים על פי הדילול הסדרתי הסטנדרטי. כאן תוכלו לראות DPCs, המבודדים על ידי דיסוציאציה אנזימטית ביום ה-10, ה-15 וה-18, וגם DPCs שגדלו ביום החמישי, ה-10, ה-13 וה-18. שני סוגי ה-dpss ב-sase 3 הם כמעט באותו גודל ומורפולוגיה תוצאות אימונופנוטיפ מראות נוכחות של סמן תאי גזע מזנכימליים כגון CD 44, CD 73 ו-CD 19, והיעדר סמנים המטופויאטיים ואנדותליים כגון CD 34, CD 45 ו-CD 11 B.מעניין שהביטויים של CD 1 0 5 ו-CD 146 הם יותר ב-d PSCs שגדלו בהשוואה ל-D-P-S-C-E-D, כימות הצביעה האדומה של האנזים ביום ה-21 של התמיינות אודונטובלסטים מראה יותר שקיעת סידן ב-D-P-S-C-E-D בהשוואה ל-CON DENTAL TOP של תאי גזע.

תוצאות QPCR מצביעות גם על ביטויים גבוהים משמעותיים יותר של MEP ו-A LP כסמני המינרליזציה ב-D-P-S-C-D בהשוואה לשיניים היוצאות של תאי גזע. בינתיים, שני הגנים מווסתים במהלך ההתמיינות וגם הביטוי של DSPP כאשר הסמן האודונטוגני גדל במהלך ההתמיינות. עם זאת, אין שונות משמעותית בביטוי של DSVP בתאים מובחנים בין קבוצות ED ו-OG.

זה עתה הראינו לכם כיצד לבודד תאי גזע של חלקי שיניים אנושיים על ידי שימוש בדיסוציאציה אנזימטית של מוך השן או צמיחה של תאי גזע מאקספלן רקמות. אז זהו. אני מאחל לך בהצלחה לנסות להשתמש בהליך זה בניסוי שלך.

תודה.