7 במרץ 2013
השתלת הכבד orthotopic בחולדות היא מודל ניסיון הכרחי למחקר ביו. כאן אנו מציגים הניתוחים שלנו להשתלת כבד חולדת orthotopic עם שחזור עורק כבד באמצעות 50% שתל חלקי.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ביצוע השתקת כבד אורטוטופית חלקית בחולדות, כמודל ניסויי הדיר במידה רבה למחקר השתלות. דבר זה מושג תחילה על ידי הוצאה (explantation) של הכבד מהחולדה התורמת. השלב השני הוא הכנת הש Transplant ex vivo, הכוללת כריתת 50% מהכבד.
בשלב הבא, כבד המקור של חולדת המקבל מוסר. השלב הסופי הוא השתלת הש Transplant של חלק מהכבד אל תוך חולדת המקבל. לבסוף, נמדדים רמות של alanine aminotransferase בסרום כדי להעריך את הנזק התאי הכבדי של הש Transplant של הכבד לאחר ההשתלה.
בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בפרוצדורה זו מתקשים בשל המורכבות הכללית הדורשת מיומנויות מיקרו-כירורגיות מתקדמות. כדי להתחיל בפרוצדורה, הניחו את חולדת התורם המורדמת על משטח חימום לאחר שווידאתם באמצעות לחיצה על בהונות שהבעל חיים מורדם לחלוטין, וקבעו את הזרועות העליונות באמצעות מערכת קיבוע ומתיחה מגנטית. גדלו את הפרווה מכל אזור הבטן של החולדה וחטרו את העור המתאים באמצעות תמיסת פובידון יוד.
פתח את הבטן באמצעות חתך בקו האמצע עם הרחבות דו-צדדיות. הנח מזרק של 5 mL מתחת לגבו של החולדה כך שה-supra hepatic vena cava יהיה מורם ונטראלית; השתמש בתפסן Mosquito כדי למשוך את התהליך לכיוון הראש, והחלף מסיחים סובקוסטליים כדי לפתוח את השטח הכירורגי. בשל הצורך למניפולציות תכופות במסיחים ובמזרק ה-5 mL במהלך הפרוצדורה, לא נעשה שימוש בסדינים כירורגיים סביב החתך. תחת מיקרוסקופ כירורגי בהגדלה של 16x, נתק את ה-falciform ligament ואת ה-left triangular ligament, והפרד את ה-left phrenic vein. הסיח את האונה המדיאלית והאונה הלטרלית השמאלית כלפי מעלה באמצעות תחתומי גזה רטובים.
באמצעות פינצטה ביפולרית, צורבו והפרידו את כלי הדם הפרא-ספיגאליים (paraesophageal) שבין האונה הלטרלית השמאלית לאונה הקדמית. העבירו את המעיים מחוץ לבטן לצדו השמאלי של החולדה וכסו אותם בתשבץ גזה רטוב. קרצפו והסיטו את האונה הלטרלית הימנית כלפי מעלה באמצעות תשבץ גזה רטוב.
בודד את ה-infra hepatic vena caver מהרקמה הרטרו-פריטוניאלית וקשור את הווריד האדרנלי הימני, אשר יחולק מאוחר יותר ממש לפני הסרת הש transplanted כדי להחדיר סטנט לתוך תעלת המרה; ראשית, קשור את תעלת המרה בגובה ההתפצלות של העורק הגסטרו-דודנלי. בצע חתך קטן בדופן הקדמית של תעלת המרה פרוקסימלית לנקודת הקשירה, ולאחר מכן, תוך כדי החזקת הדופן הקדמית של החתך עם מיקרו-פינצטה ישרה ביד שמאל, השתמש במיקרו-פינצטה קמורה ביד ימין כדי להחדיר סטנט לתוך התעלה.יביא אותו למקומו וקבע אותו באמצעות חוט משי במידה שש אפסים.
השאירו את אחד הקצוות החתוכים של חוט התפירה על תעלת המרה באורך של ארבעה מילימטרים, כדי שניתן יהיה להחזיק את החוט במהלך האנסטומוזיס המאוחרת. שחררו את הווריד הפורטלי מהוורידים הפורטליים והספלני על ידי קשירה וחיתוך שלהם; קשרו וחתכו את העורק הגסטרו-דודנלי. לאחר מכן, בודדו את העורק הכבדי המשותף מראש הלבלב ועד לשורשו.
סובבו את הכבד ימינה באמצעות מקלוני צמר ובצעו דיסקציה לרצועה סביב גב הכבד והוושנית עם השלמת ההכנות. להוצאת הכבד, הסירו את המגבים, את פינצטות היתוש ששימשו לקיבוע תהליך החרב (xiphoid process) ואת המזרק בנפח 5 ml שהונח מתחת לגבו של החולדה.
החזיר את המעיים לחלל הבטן. הזרק 500 IU של heparin natrium בשני מיליליטר של תמיסת סலைன் נורמלית דרך וריד הפין. כעבור שלוש דקות בערך, נקה את המזרק של חמישה מיליליטר, את פינצטת היתוך ואת הרטרקטור, וקשור את העורק הכבדי המשותף פרוקסימלית לשורשו.
השאירו את אחד הקצוות הגזורים של החוט קשור עבור העורק הכבדי המשותף. זמן רב לאחר קשירת הווריד הנבוב התת-כבדי. סגרו קרוב לווריד הכליתי הימני באמצעות פינצטת Mosquito.
סגרו את הווריד הפורטלי באמצעות תפס מיקרו-כליים חד-פעמי מתחת לגזע של וריד הטחול. חתכו את הדופן הקדמית של הווריד הפורטלי והחדירו קטטר בכיול 18 gauge אל תוך הווריד הפורטלי. בצעו פרפוזיה לכבד in situ עם 60 milliliters של תמיסת histidine tryptophan ketoglutarate קרה.
בלחץ הידרוסטטי של 20 סנטימטרים, חתוך באופן מיידי את הסרעפת, את הווריד המערך תוך-בית-החזה ואת הדופן הקדמית של הווריד המערך התת-כבדי כדי לאפשר שטיפה של תמיסת הפרפוזיה מהכבד. סגור את הווריד המערך התת-כבדי באמצעות תסמיך כלי דם מיקרוסקופי פחות מהכבד. הסר את הכבד על ידי דיסקציה של הווריד המערך התת-כבדי.
הווריד הפורטלי, הסרעפת, הרצועות הנותרות, ווריד האדרנל הימני והעורק הכבדי המשותף. יש להניח את הכבד שהוצא בתוך תמיסת HTK קרה בכוס מתכת המותקנת בקופסת פלסטיק מלאה בקרח גרוס. הפרוצדורות עבור הש transplanted של הכבד מבוצעות בכוס המתכת המלאה בתמיסת HTK קרה מאוד; לצורך חיבור של cuff לווריד הפורטלי, יש לסגור את גזע הווריד הפורטלי באמצעות תפס bulldog של DeBakey ולהניח את התפס בעמדת גישור מעל הכוס.
העבירו את הווריד הפורטלי דרך השרוול וסגרו שוב את הווריד הפורטלי יחד עם הארכה של השרוול בעמדת השעה 12, הכניסו את דופן הווריד הפורטלי מעל השרוול כדי למקם את קצה ווריד הטחול מחוץ לשרוול בעמדת השעה 7, ואבטחו את הווריד הפורטלי באמצעות חוט משי 6-0 כדי להחדיר סטנט לעורק הכבדי. קבעו את הכבד על ידי תפיסת שני קצות הסרעפת באמצעות פינצטות ומתוחו את העורק הכבדי המשותף על ידי החזקת החוט הקשור באמצעות תפסן DeBakey bulldog ומספרי מיקרו ישרים. בצעו חתך קטן בדופן הקדמית של העורק הכבדי המשותף באמצעות יד שמאל.
החזיקו את הדופן הקדמית של החתך בעזרת מיקרו-פינצטה ישרה וביד ימין הכניסו סטנט לעורק הכבדי המשותף. בעזרת מיקרו-פינצטה מעוקלבת, קשרו את הסטנט באמצעות חוט משי 6/0 והשאירו אחד מקצות החוט הגזוזים באורך של 4 mm. בצעו שטיפה של הכבד דרך הקטטר העורקי עם 5 mL של תמיסת HTK קרה עבור כריתת כבד של 50%.
ראשית, קבעו את האונה האחורית באמצעות פינצטת Mosquito כדי להחזיקה במקומה. לאחר מכן, קשרו את השומת שלה באמצעות חוט משי בדרגת 4-0 והסִירו את האונה.
את האונה הקוראטית הקדמית מסירים באותו אופן. לאחר מכן, סובב את קופסת הפלסטיק ב-90 מעלות. הדק את הקצה הימני של הסרעפת ואת החלק השמאלי של האונה המדיאלית.
בצעו חתך קטן בקצה העליון של הגבול של החלקים הבילטרליים של האונה המדיאלית, ולאחר מכן הסירו את החלק השמאלי לאחר ליגציה. לאחר ליגציה של הפדיקל באמצעות חוט משי במידה 4/0, הסירו את האונה הלטרלית השמאלית וצרבו בזהירות את פני השטח של הכבד שהוסר בעזרת פינצטת ביפולארית. מסת הכבד מופחתת כעת בכ-50% לצורך פלסטיקה של vena cava supra hepatica.
ראשית, קבעו את מיקום הכבד על ידי תפיסת שני קצות הסרעפת בעזרת פינצטת Mosquito. לאחר מכן, קצצו את הדופן הקדמית של הווריד החלול העליון (supra hepatic vena cava) על ידי הסרת הסרעפת התואמת. הצמידו תפרירי polypropylene 2 7 0 מהחוץ פנימה בשתי הפינות כתפרי קיבוע (stay sutures) לצורך האנסטומוזה המאוחרת.
לאחר מכן, גזמו את הדופן האחורית של ה-supra hepatic vena cava. שמרו את השתל הכבדי בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius בתמיסת HTK בתוך אמבט מים קרים. הכינו את המקבל לניתוח באופן דומה לניתוח התורם ופתחו את הבטן באמצעות חתך בקו האמצע.
הניחו תחביש גזה רטוב מעל הצד הימני של התריסריון והמעיים כולם. כדי להשיג שדה ניתוחי סביב הווריד הנישבי התת-כבדי (infra hepatic bena caver), הכניסו את האונה השמאלית והאונה המרכזית לחלל התת-סרעפתי השמאלי, והסיטו את האונה הצידית הימנית כלפי מעלה באמצעות תחביש גזה רטוב.
בודד את הווריד הרחב התת-כבדי (infra hepatic vena cava) מהרקמה הרטרו-פריטוניאלית באמצעות ליגציה, וחלק את וריד יותרת הכליה הימני בעזרת גזה לחה ומקלוני צמר. סובב את הכבד שמאלה ונתח את הרצועה שמאחורי הכבד. חתוך את תעלת המרה ממש מתחת לענף מהאונה הלבבית (chordate lobe).
השאירו את אחד הקצוות החתוכים של החוט קשור עבור הצינור המרה באורך ארבעה מילימטרים; קשרו וחלקו את העורק הגסטרו-דואודנלי ואת העורק הכבדי הפרופרי במרחק של שלושה מילימטרים מההסתעפות מהעורק הכבדי המשותף, כדי ליצור מבנה רחב של העורק בקצה העורק הכבדי המשותף. סגרו את הווריד החלול התחתון (infra hepatic vena cava) באמצעות תפסן מיקרו-כליים מתכתי מעט מעל הווריד הרנאלי הימני, ואת הווריד הפורטלי בגובה ההסתעפות שלו בhilum של הכבד באמצעות תפסן מזבנב (mosquito forceps). סגרו את הווריד החלול העליון (supra hepatic vena cava) יחד עם הסרעפת באמצעות תפסן כלי דם פריפריאלי וקבעו את התפסן בגוש של פלסטלינה על בסיס שמן. הפחיתו את ההרדמה ב-isof fluorine ל-0.4 אחוז נפח. הסִירו את הכבד המקבל המקורי על ידי דיסקציה של הווריד החלול העליון בגבול שבין הווריד החלול העליון לכבד.
וריד הפורטלה מעט מעל ללסת של פינצטת היתוש, והוריד הנבוב התת-כבדי מעט מתחת לנקודת האמצע שבין הכבד לווריד הכליתי הימני. מקמו את שתל הכבד באופן אורטוטופי. שחזור כלי הדם הוא החלק הקשה והחשוב ביותר בהליך זה.
יש לבצע זאת בזהירות רבה אך במהירות, עבור האנסטומוזיס של ה-supra hepatic vena cava באמצעות תפר רציף. מקמו את תפר העיגון (stay suture) ב-supra hepatic vena cava של המקבל, מפנים החוצה, באמצעות חוט polypropylene 7/0 המצורף, בפינה הימנית של השתל, ולאחר מכן קשרו קשר באותה צורה. מקמו את תפר העיגון השני בפינה השמאלית.
זו תהיה התפר הפותח של תפר רץ. כדי להרחיב את האנסטומוזיס, אחזו ושמרו את התפרים באמצעות תפסני דה-בייקי (DeBakey bulldog clamps) בשתי הפינות, תוך הפעלת מתיחה עדינה כלפי מעלה ולצד. לאחר מכן, חרצו את התפר בפינה השמאלית דרך הדופן בצד השת transplanted graft, מהחוץ פנימה ובסמיכות לקשר שבחוץ, ותפרו את השורה האחורית של ה-satic vena caver תוך כדי תפר תוך-לומנלי (intraluminal) באמצעות שבעה עד שמונה תפרים עד לפינה הימנית.
בצע את התפרים הראשונים בזהירות, כך שהלומנים הפנימיים יפנו זה לעומת זה בפינה הימנית. העבר את חוט הפוליפרופילן 7-0 דרך כלי הדם מצד השתל כלפי חוץ. תפר את השורה הקדמית מבחוץ, מימין לשמאל, בכ-10 תפרים.
שטפו את החלק הפנימי בתמיסת lactated ringer. כדי להסיר בועות אוויר, בצעו את התפר האחרון קרוב לתפר הייצוב (stay suture) ולאחר מכן קשרו אותם יחד. לצורך שחזור וריד הפורטלה, קבעו את וריד הפורטלה באמצעות תסמיך לכלי דם מיקרוסקופיים וחבקו את פינצטת המוסיקיטו (mosquito forceps) בחימר. לאחר מכן, חתכו את הדופן הקדמית של וריד הפורטלה בדיוק מתחת ללסנפי פינצטת המוסיקיטו.
שטפו את החלק הפנימי של וריד השער המקבל ואת השרוול (cuff) באמצעות תמיסת Lactated Ringer. הכניסו את השרוול אל וריד השער והדוקו אותו באמצעות תפר היקפי של חוט משי במידה 6/0. לסיום, בצעו פרפוזיה מחדש לכבד.
הוציאו את המזרק בנפח 5 ml מגב החולדה והעלו את ריכוז ה-isoflurane ל-0.8% נפח לצורך שחזור העורק הכבדי בטכניקת סטנט. ראשית, אחזו בחוט של העורק הכבדי הנכון (proper hepatic artery) באמצעות פינצטת Mosquito וקבעו אותו בחימר. לאחר מכן, סגרו את העורק הכבדי המשותף (common hepatic artery) של המקבל באמצעות תפסן.
בצעו חתך קטן בפיצול של מבנה ה-Y בקצה העורק הכבדי המשותף (common hepatic artery) כדי ליצור פתח בצורת משפך. החזיקו את הסטנט שמוצב בעורק הכבדי המשותף של השתל באמצעות מיקרו-פינצטה מעוקלת. החליקו את הסטנט אל תוך העורק הכבדי המשותף של המקבל והדקיפו אותו באמצעות קשירה בחוט משי במידה 6/0. קשרו קצה אחד של חוט זה יחד עם החוט במידה 4 מ"מ שעל העורק הכבדי המשותף של השתל, כך ששני העורקים הכבדיים המשותפים יתקרבו זה לזה תוך הפחתת המתח באתר האנסטומוזה.
לאחר מכן, שחררו את התפסן עבור האנסטומוזה של ה-infra hepatic vena cava באמצעות תפר רציף באותה צורה שבה בוצעה האנסטומוזה של ה-supra hepatic vena cava, אך השתמשו ביותר תפרים עם נשיכות עדינות יותר. לאחר שחרור התפסנים, הגבירו את ריכוז ההרדמה ל-1.0 volume percent לצורך שחזור תעלת המרה. החזיקו את חוט תעלת המרה של הרסיפיינט באמצעות פינצטת Mosquito וקבעו אותו בחימר.
בצעו חתך קטן בצינור המרה בגובה המתאים, כך שצינור המרה המשוחזר לא יהיה ארוך מדי. הכניסו את התומך (stent) ואבטחו אותו בעזרת חוט משי במידה 6/0. קשרו חוט זה לחוט שעל צינור הש transplanted (graft duct).
כעת הושלמו כל הלימודי השחזור. סגרו את החתך הבטני באמצעות תפרים רציפים מסוג Vicryl 4-0 בשכבות. מיד לאחר הניתוח, טפלו בחולדה המקבלת באמצעות הזרקה תת-עורית של sphero sodium ו-buprenorphine בנפח כולל של 1.5 milliliters של תמיסת סליין פיזיולוגית.
יש לאפשר לחולדה להתאושש במשך 60 דקות בכלוב יחידה לטיפול נמרץ מיוחד עם אוויר חם ואספקת חמצן לפני החזרתה לכלוב רגיל. כל החולדות המקבלות שרדו עד להדמימה המתוכננת לצורך דגימת דם בפרקי זמן של 1, 3, 24 ו-168 שעות לאחר reperfusion של השער הנשרי. דגימות סרום נסרקו לבדיקת רמות alanine aminotransferase, המשקפות את מידת הנזק ההפטוצולרי של השתלי הכבד לאחר ההשתלה.
כפי שמוצג בגרף זה, רמות ה-LT הגיעו לשיא לאחר 24 שעות ולאחר מכן ירדו חזרה לגבולות הנורמה בתוך 168 שעות. לאחר סרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע השתלת כבד חלקית ותחלית בחולדות כמודל ניסויי הדיר למחקר השתלות.
מאמר זה מציג פרוצדורה כירורגית מפורטת לביצוע השתלת כבד אורטוטופית בחולדות, עם דגש על שחזור העורק הכבדי עם גרפט חלקי של 50%. מודל זה חיוני לקידום מחקרים בתחום ההשתלות.
הקמה של מודלים פרה-קליניים הניתנים לשחזור היא קריטית להפחתת סיכונים באסטרטגיות של השתקת כבד ולהערכת טכניקות לשימור השטבל. מודל חולדה זה להשתקת כבד אורתוטופית חלקית עם שחזור של העורק הכבדי מספק פלטפורמה סטנדרטית למחקרי מנגנונים של פגיעה מרפרפוזיה-איסכמיה, תגובות אימונולוגיות ותסמונת "קטן מדי עבור הגודל" (small-for-size syndrome). הפרוצדורות המיקרו-כירורגיות המפורטות תומכות בתיקוף של מטרות בנתיבים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להערכה עקבית של נזק לתאי הכבד באמצעות מדידות של alanine aminotransferase בסרום.
המודל משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובמיוחד עבור תרופות ביולוגיות או מכשירים שמטרתם להקל על פגיעות הקשורות להשתקה.