Name: בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת DiI בהכנות-ספר פתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: למדו שיטת אלקטרופורציה אובו לשתיקת גנים בצינור העצבי של עוברי תרנגולת באמצעות פלסמידים מבוססי מיקרוRNA. טכניקה זו מאפשרת הערכת מומחי הכוונת אקסונים בפיתוח עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה במעבדה של ES נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע השויצרית. ברצוננו להודות לד&quot;ר Beat קונץ לקבלת סיוע בצילומים.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
<li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21(2009).</li>
<li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific%2C+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133(2011).</li>
<li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li>
<li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
<li>Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li>
<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אסטרטגיה זו פשוטה, וקטור מבוססת מלאכותית מירנה ביטוי יכולה לשמש לביטוי גני מציאת אנדוגני בצינור העצבי העוף. כלים אלה תפקודיים להציע השתקת גנים מרובות, שליטה זמנית וספציפי תא מסוג, כדי להקל על ההבהרה של מסלולי התפתחות מורכבים. בפרט, אנו הוכחנו את התועלת של פלסמידים אלה בהדרכת האקסון commissural, מאז ניתן להשתמש בפלסמידים למציאת גנים שונים בתאי עצב commissural או ביעד ביניים שלהם, 3 floorplate. העצמה והמ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> 0.5 מ&quot;מ זכוכית נימים </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> זכוכית מחט חולץ </td><td> Narishige </td><td> מחשב-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> אלסטומר סיליקון Sylgard </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> תיל טונגסטן, 0.075 מ&quot;מ </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> סיכות חרקים, 0.20 מ&quot;מ </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> סיכות חרקים, 0.10 מ&quot;מ </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> מספרי האביב </td><td> מדע פיין כדיOLS </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> דומון # 55 מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> מהר DiI </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופי פלורסנט </td><td> אולימפוס </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת dii בהכנות-ספר פתוח

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

dI1 נוירונים Commissural נחקרו רב על מנת להבהיר את המנגנונים בבסיס הדרכת האקסון במהלך 1,2 פיתוח. נוירונים אלה ממוקמים בחוט השדרה הגבה ולשלוח האקסונים שלהם לאורך מסלולים סטריאוטיפיים. אקסונים Commissural תחילה להקרין כלפי ventrally ולאחר מכן מעבר לfloorplate. אחרי שחצה את קו האמצע, אקסונים אלה לעשות תפנית חדה ומקורית פרויקט longitudinally לכיוון המוח. כל אחד משלב אלה מוסדר על ידי הפעילות המתואמת של רמזי הדרכה אטרקטיביות ודוחים. הפרשנות הנכונה של הרמזים הללו היא חיונית להדרכה של אקסונים לאורך המסלול המתוחם שלהם. לפיכך, התרומה הפיזיולוגית של מולקולה מסוימת להדרכת האקסון commissural הוא נחקר באופן אידיאלי בהקשר של החיים בהתהוותו. בהתאם לכך, מציאת גן בvivo חייבת להיות נשלטה במדויק כדי להבדיל פעילויות הדרכת האקסון של גנים שעשויים לשחק בזהירות מרובהתפקידים במהלך פיתוח. כאן, אנו מתארים שיטה למציאת ביטוי גנים בצינור העצבי העוף באופן ספציפי לסוג תא, למעקב. אנו משתמשים בוקטורי פלסמיד רומן 3 מטפחים יזמי תאים ספציפיים לסוג / משפרים המניעים את הביטוי של סמן חלבון פלואורסצנטי, ואחרי ישירות על ידי תמליל miR30-RNAi 4 (הממוקם בתוך-UTR 3&#39;של קידוד cDNA חלבון פלואורסצנטי) ( איור 1). כאשר electroporated לתוך הצינור העצבי פיתוח, הווקטורים האלה לעורר downregulation היעיל של ביטוי גנים ולבטא חלבוני סמני ניאון בוהקים כדי לאפשר מעקב ישיר של התאים חווים מציאה 3. ערבוב וקטורי RNAi שונים לפני electroporation מאפשר מציאה סימולטנית של שניים או יותר גנים באזורים עצמאיים של חוט השדרה. זה מאפשר אינטראקציות תאיות ומולקולריות מורכבות לבחינה במהלך פיתוח, באופן שהוא מהיר, שלimple, מדויק וזול. בשילוב עם DiI איתור של מסלולי האקסון commissural בהכנות של ספרים פתוחים 5, שיטה זו היא כלי שימושי עבור במחקרי vivo של מנגנונים התאיים ומולקולריים של צמיחת האקסון commissural והדרכה. בעיקרון, כל אמרגן / משפר יכול לשמש, באופן פוטנציאלי ביצוע הטכניקה מתאימה יותר נרחבת במחקרי vivo של תפקוד גן במהלך 6 פיתוח. סרטון זה מדגים ראשון כיצד לטפל וביצים של חלונות, ההזרקה של פלסמידים DNA לתוך הצינור העצבי והליך electroporation. כדי לחקור הדרכת האקסון commissural, חוט השדרה הוא להסיר את העובר כהכנת ספר פתוח, קבוע, והוזרק לי DiI לאפשר מסלולי האקסון לנודעו עקבותיו. חוט השדרה הוא רכוב בין coverslips ודמיין באמצעות מיקרוסקופ confocal.

שיטה שבאמצעותה ביטוי גנים בצינור העצבי יכול להיות downregulated באופן ספציפי לסוג תא, מעקב מתוארת. אנחנו מדגימים איך<em&gt; באוב</em&gt; Electroporation של פלסמידים microRNA מבוססים שיעוררו התערבות RNA spatiotemporally מבוקרת יכול לשמש כדי לחקור הדרכת האקסון commissural בצינור העצבי פיתוח.

בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת DiI בהכנות-ספר פתוח

נוירונים קומיסוראליים מסוג dI1 נחקרו רבות כדי להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיס הניווט האקסונלי במהלך ההתפתחות1,2. נוירונים אלו הם...

מטרת הליך זה היא להעריך פגמים בהנחיית האקסונים בצינור העצבי של עוף לאחר דיוון (downregulating) של ביטוי גנים באופן עקבי וספציפי לסוג תא. הדבר מבוצע על ידי הכנת ביצי עוף מופיות לאלקטרופורציה in ovo, באמצעות חיתוך חלון בקליפת הביצה. השלב השני הוא הזרקה ואלקטרופורציה של מבני DNA המקודדים ל-microRNAs אל תוך הצינור העצבי.בשלב הבא, חוט השדרה של החולדה המחושמלת מבודד ומקובע בהכנות של הרכבה שטוחה (flat mount) במבנה של ספר פתוח. השלב הסופי הוא הזרקת צבע פלואורסצנטי כדי להמחיש את השליחות האקסונית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להראות הן את התאים שבהם התרחש השתקה גנטית והן כדי להעריך את ההשפעות העוקבות על הנחיית האקסונים של הקומיסורה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא השתקה של גנים באופן ספציפי לסוג התא. להכנת הפלסמידים, עיין בהוראות בפרוטוקול הכתוב. דגרי את הביצים בטמפרטורה של 38.5 °C ובלחות של כ-45% עד להגעה לשלב ההתפתחות הרצוי. כדי לחקור את הנחיית האקסונים של נוירונים קומיסוראליים, דגרי את העוברים למשך כ שלושה ימים עד שיגיעו לשלבים 17 עד 18 לפי סיווג Hamburger and Hamilton.לאחר הגעה לשלב הפיתוח הרצוי ולפני הצטברות החלבון המבוקש בתוך העובר, הוציאו את הביצים מהמדגרה והניחו אותן במצב אופקי יציב למשך 20 דקות כדי למקם מחדש את העובר בחלקו העליון של החלמון בצדו העליון של הביצה. לאחר שהעוברים מומקמו מחדש מעל החלמון, הוציאו את הביצים מהמדגרה ונגבו אותן ב-70% ethanol. לאחר מכן, הדביקו רצועת דבק לאורך הציר הארוך של הביצה והשתמשו בסכין מנתח כדי ליצור חור קטן בקצה הקהה של הביצה וחור נוסף בפינת האזור המיועד לחליצה (windowing).לאחר מכן, הכניסו מזרק עם מחט בקוטר 18G אל החור בקצה הקהה של הביצה בזווית של 45 מעלות, ושאבו כ-3 milliliters של אלבומין תוך הקפדה שלא לפגוע בחלמון. השתמשו במספריים קטנים המוחזקים באופן אופקי כדי לחתוך את החלון בביצה מבלי לפגוע בעובר. לאחר מכן, אטמו את החלון באמצעות הסרט הדביק.לבסוף, השתמשו במברשת כדי למרוח שעוות פאראפין מומסת לאיטום החור בקצה הקהה של הביצה, ואיטמו באותו אופן כל סדקים בביצה. לאחר מכן, החזירו את הביצה למדגרה. חזרו על התהליך עבור כל הביצים המיועדות לאלקטרופורציה.הסירו את הסרט מאחת הביצים בעלות החלון וקבעו את שלב התפתחותו של העובר לפי מדד Hamburger and Hamilton. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להרים את הקרומים החו-עובריים מהחצי הגביי של העובר באזור שבו נפגשים ורידי חוט החלמון (vitelline veins) הימני והשמאלי הראשיים. חדרו לגו של העובר, קרעו או גזרו בעדינות את הקרומים בעזרת מספרי קפיץ ודחפו אותם לכיוון הזנב.כעת השתמשו בשאיבה עדינה כדי להעמיס את תערובת ה-DNA המיועדת לאלקטרופורציה לתוך מיקרו-קפילרית זכוכית עם צינור מחובר. הכניסו את המיקרו-קפילרית לתעלת המרכז של צינור העצבי, ממש מעל הגפיים האחוריות, והזריקו את תמיסת ה-DNA תוך כדי בקרה על נפח ההזרקה באמצעות הפה. הצבע הכחול אמור להתפשט מקצה הזנב ועד לחדר של המוח המתפתח.הוסיפו מספר טיפות של PBS סטרילי על העובר והניחו את האלקטרודות במקביל לציר הקדמי-אחורי של העובר, ללא מגע עם העובר או עם כלי דם כלשהם. לאחר מכן, החזיקו את האלקטרודות באופן יציב ובצעו אלקטרופורציה. לאחר האלקטרופורציה, הסירו את האלקטרודות ושטפו במהירות במים סטריליים כדי להסיר חלבונים דנטורביליים מחלבון הביצה.לבסוף, טפטפו כמות קטנה נוספת של PBS סטרילי על העובר ולאחר מכן אטמו שוב את הביצה בעזרת סרט דבק. כפי שצוין קודם לכן, איטום תקין הוא קריטי כדי למנוע התייבשות של העובר. לאחר מכן, החזירו את העובר לאינקובטור עד להגעה לשלב הפיתוח הרצוי.כאשר העובר מגיע לשלב 25 עד 26 לפי מדד Hamburger Hamilton, השתמשו בפינצטה כדי להוציא את העובר מהביצה והניחו אותו בצלחת פטרי מצופה באלסטומר sil guard. השתמשו בפינצטה להסרת הקרומים חוץ-עובריים והניחו את העובר כאשר הצד הגבי פונה כלפי מטה. כעת השתמשו בסיכות קיבוע לחרקים בקוטר 0.2 מילימטר כדי למתוח בעדינות את העובר ולקבע אותו באמצעות סיכות דרך הצוואר והזנב.לאחר מכן, קבעו את גפיו של העובר באמצעות סיכות, כאשר הסיכות מוחדרות בזווית כך שלא יפריעו לנתיחה שתבוא בהמשך. האירו את הצלחת המכילה את העובר מלמטה, כדי שניתן יהיה להבחין בצפיפות הרקמה. השתמשו במספרי קפיץ כדי לפתוח את חלל הבטן ובגירוד עדין באמצעות פינצטה כדי להסיר את הלב ואת האיברים הפנימיים.לאחר שכל האיברים הוסרו לחלוטין, החוליות המגולמות וחוט השדרה יהיו גלויים. בשלב הבא, סובבו את העובר ב-180 מעלות והשתמשו במספרי קפיץ כדי לבצע חתך רדוד דרך החוליות המכסות את חוט השדרה באזור הצוואר. לאחר מכן, בצעו שני חתכים אורכיים קצרים דרך החוליות משני צדי חוט השדרה, מהצוואר ועד הזנב.השתמשו בפינצטה כדי להרים את חוליות הגב הרחוקות מהחוט האחורי, ולאחר מכן קלפו את החוליות כרצועה אחת לכיוון הזנב. לאחר מכן, מתחו בעדינות והנעיצו מחדש את העובר דרך הזנב והגפיים. כעת זהו את קרומי העטיפה של החוט האחורי, שצריכים להופיע כקו רקמה כהה וצפוף בין צינור העצבים לבין גנגליות השורש הדורסליות, ולאחר מכן השתמשו במחט סטרילית או בסכין מיקרו-כירורגי עדין כדי לחתוך את קרומי העטיפה לאורכן לאורך כל צד של החוט, מהצוואר ועד הזנב.הקרומים צריכים להיפרד בקלות מהחוט השדרני בעקבות מתיחתו של העובר המוצמד. לבסוף, חתכו את החוט השדרני בגובה ניצן הכנף ובצורה רוחבית לניצן הגפה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להוציא את החוט השדרני בתנועה מהחלק הרוסטראלי לכיוון הזנב, תוך הבטחה שהחוט יישאר טבול ב-PBS תחילה.פרסו את חוט השדרה המבודד על שפכטל והעבירו אותו לכלי חדש מצופה ב-Sylgard המכיל 4% paraformaldehyde ב-PBS. לאחר מכן, הצמידו בזהירות את חוט השדרה בעזרת סיכות חרקים במידה של 0.1 millimeter, באופן רדיאלי למרכז ובכל רבע, כדי ליצור תכשיר של הרכבה שטוחה (flat mount), והקרינו ב-paraldehyde למשך 30 דקות עד שעה אחת. היזהרו מקיבוע יתר.מכיוון שפעולה זו תגביר את הרקע ותפחית את יעילות הדיפוזיה של הצבע. לאחר מכן, שפכו בזהירות את הפאראלדהיד והחליפו אותו ב-PBS. לאחר הכנת תמיסת fast di בריכוז של five milligrams per milliliter בתוך אתנול, שברו את הקצה של מיקרו-פיפט זכוכית בעל קוטר קטן המחובר לצינורית פלסטיק, ושאבו את התמיסה לתוך הפיפט.החדירו את המחט הממולאת לצלחנית עם PBS ובדקו שהצבע אינו דולף מהמחט. אם הוא דולף, הקוטר רחב מדי ויש להכין מחט חדשה. ודאו שדגימת ה-open book מוארת מלמטה וכי הפס האורכי הצפוף של הרקמה ממוקם בכחמיש בערך מרוחב ה-Hemi book מהשפה הלטראלית; גופי התאים של הנוירונים הקומיסורליים נמצאים ממש דורסלית לקו כהה זה.החדירו את קצה מיקרו-פיפט הזכוכית לרקמה, ובזמן נסיגת המחט, נשפו כמות קטנה של D eye באמצעות פיפט פה. חזרו במהירות על הפעולה בכל 0.5 millimeters לאורך הספר הפתוח. עם סיום ההזרקות, השתמשו בפיפט העברה כדי לשאוב ולהשליך כל עודף di; אי ביצוע שלב זה יוביל לרקע גבוה.חזרו על הפרוצדורה עבור כל אחת מהכנות ה-open book. לאחר מכן, הניחו את הצלחת המכילה את ההכנות המוזרקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך כ שלושה ימים, כדי לאפשר לצבע להתפשט לאורך האקסונים. לאחר פרק זמן זה, ביצעו הרכבה (mount) של ההכנות בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב.חתכים רוחביים וחתכי "ספר פתוח" הופקו מעוברי עוף בשלבים 25 עד 26 לפי סולם Hamburger Hamilton, אשר עברו אלקטרופורציה בשלב 18 לפי סולם Hamburger Hamilton. כפי שניתן לראות כאן בחתך רוחבי, מקדם beta-actin מניע ביטוי רחב (ubiquitous expression). החץ מצביע על הכיוון הגבי-בטני (dorsal ventral).תמונה זו מציגה דוגמה לדפוסי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי שהתקבלו לאחר אלקטרופורציה של וקטורי פלסמיד. כאן נראה ביטוי אוניברסלי מהפרומוטר של beta actin בהכנה של ספר פתוח. החץ מצביע על הכיוון הקורדלי הרוסטרלי.תמונה זו מראה חתך רוחב לאחר אלקטרופורציה עם קונסטרוקט המכיל enhancer של math1. זהו מניע ביטוי בנוירונים של di1. כאן ניתן לראות ביטוי מהקונסטרוקט של math1 enhancer בהכנת ספר פתוח (open book preparation).חתך רוחבי זה מראה ביטוי של ה-hawk A one enhancer לאחר אלקטרופורציה דו-צדדית של המבנה. ה-hawk A one enhancer מניע ביטוי באופן ספציפי בלוח הרצפה (floor plate). הכנה זו בשיטת "ספר פתוח" מראה את דפוס הביטוי של מבנה ה-hawks a one בלוח הרצפה.תמונה זו מציגה תמונת שדה בהיר (bright field) של אתרי ההזרקה של Dai. בהכנה מסוג "ספר פתוח" (open book preparation), Dai הוזרק בדפוס נקודתי קרוב לשוליים הלטרליים של הספר הפתוח. בצד המרוחש, תמונה זו מציגה ויזואליזציה של ביטוי GFP באותה הכנה, ובכאן ניתן לראות את ה-Dai.לאחר שלושה ימים של דיפוזיה, ניתן יהיה להדגים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי את השחרור של הקומסורות (commissures) מהמסלולים. מסלולי אקסונים נורמליים יגדלו לכיוון לוח הרצפה (floor plate), יחצו את לוח הרצפה, ולאחר מכן יפנו ויגדלו. כך זה נראה כאן.ניתן להשוות פנוטיפים חריגים הנובעים מהשקת גנים (gene knockdown), כפי שמוצג כאן, למסלול הארכיטיפי. בדוגמה זו, חלק מהאקסונים נעצרים ברצפת התא (floor plate) או מקבלים החלטות פנייה שגויות בצד הקונטרלטרלי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לגלות זהירות וסבלנות לאורך שלבי ההזרקה העדינה והדיסקציה.פעולות אלו דורשות מעט תרגול. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ההזרקה וההחדרה של פלסמידים של RNAI כדי לחקור תפקוד גנים במהלך התפתחות צינור העצבים באופן ספציפי לסוג התא.

in-ovo-electroporation-mirna-based-plasmids-developing-neural-tube

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס...

פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ&#39;יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה...

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

ביטוי מחוץ לרחם הוא טכניקה אחת על מנת להבהיר את תפקיד רנ"א בהתפתחות המוח. עם זאת, מיקוד באזורים מסוימים באמצעות ב electroporation אובו הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים דרך יעילה לאזורי המוח התיכון הגחון ועל גב באופן סלקטיבי electroporate.

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

אנו מציגים transgenesis חולף מציאת גן ב intestinalis Ciona, קבוצת אחות chordate לבעלי חוליות, תוך שימוש בטכניקות microinjection ו electroporation. שיטות כאלה להקל גנומיקה תפקודית חסר חוליות הפשוטות הזה כולל מאפיינים בסיסיים של בעלי חוליות, כולל notochord ו epithelia ראש חושים ועל orthologs הרב של הגנים הקשורים למחלות אנושיות.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

למדו שיטת אלקטרופורציה אובו לשתיקת גנים בצינור העצבי של עוברי תרנגולת באמצעות פלסמידים מבוססי מיקרוRNA. טכניקה זו מאפשרת הערכת מומחי הכוונת אקסונים בפיתוח עצבי.

בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת DiI בהכנות-ספר פתוח

גלה סרטונים נוספים