Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

מטרת השיפוץ של הליך זה היא להדגים את הכוונון היומי הנכון וניתוח הדגימה במכשיר CyTOF. ראשית, המכונה מורכבת ומופעלת. לאחר מכן, הגדרות המכשיר מותאמות לכוונון לאות המרבי.

לאחר מכן המכונה מוכנה להריץ את הדגימות. בשלב האחרון מנקים ומכבים את המכונה. בסופו של דבר, ניתן לרכוש נתוני תאים אופטימליים בהתאם לדרישות זמן ספציפיות.

הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית. קשה ללמוד את הליכי ההגדרה, הכוונון והניקוי היומיומיים מהמדריך. מכיוון שישנם מספר שלבי תוכנה בו זמנית.

אתה צריך לצבור ניסיון כדי לרכוש תחושה של רמות הרקע ועוצמות האות המתאימות לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי. פתח את תוכנת CyTOF ובחר הגדרת מכשיר. לאחר מכן, בלשונית כלוב הכרטיסים, לחץ על כפתור החימום כדי לאפשר למעטפת תא הריסוס להגיע ל-200 מעלות צלזיוס.

החלף את המזרק במשאבת המזרק במזרק טרי מלא במי קוביית מילי. לאחר מכן נקה את הנבולייזר על ידי שטיפה לאחור עם 5% אתרוג פעמיים דרך יציאת הגעה. כדי להסיר שאריות אתרוג, חזור על השטיפה האחורית עם מי Milli Q.

לאחר מכן, פתח את שסתום מיכל הגז ארגון וכתוצאה מכך נורית הארגון בחזית המכונה נדלקת. לאחר מכן חבר את הנבולייזר לכניסת גז האיפור והצמד את הנבולייזר לצינור ההחדרה הנוזלי. הכנס את קצה הנבולייזר לתוך הפתח הלבן במעטפת החימום בכרטיסיית בקר RFG של חלון הגדרת המכשיר.

לחץ על התחל פלזמה ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר סיום ההפעלה, לחץ שוב על אישור בחלון המוקפץ. כעת הפעל את משאבת המזרק.

בעת מילוי מחדש של המזרק, לחץ על כפתור העצירה ולא על לחצן ההשהיה כדי לאפס את מונה עוצמת הקול לפני כיול ציטומטר המסה, ודא שהוא התחמם במשך 20 דקות. לאחר שהמכונה התייצבה, לחץ על כפתור הגדרות הרכישה כדי לפתוח את חלון הגדרות רכישת הנתונים. בכרטיסיה אנליטים.

לחץ על הטבלה המחזורית כדי לפתוח את לוח בחירת האיזוטופים. לאחר מכן בחר את האיזוטופים בפתרון הכוונון של מדעי DVS המפורט במדריך ולחץ על שמור. לאחר מכן, לחץ על כפתור האיזוטופים לכל קריאה כדי לפתוח את המסות לכל חלון קריאה.

בחר ספירת פולסים ושנה את קנה המידה של ציר ה-y על ידי הזנת מספר חדש ולאחר מכן לחיצה על Enter. כעת מלאו מזרק ירוק של נורמה של מיליליטר אחד עם תמיסת כוונון. סובב את בורר יציאות הדגימה לטעינה.

הזרקו 450 מיקרוליטר של תמיסת כוונון, ולאחר מכן סובבו את הבורר להזרקה. המתן עד שהאיזוטופים של תמיסת הכוונון יתחילו להופיע כפסים בתצוגה זו. האותות בזמן הטיסה, אזור 9, 400 עד 9, 800 נובעים מאיזוטופים של קסנון בגז הארגון.

כעת חזור להמונים לכל חלון קריאה ולחץ על כפתור ההפעלה הירוק. כל קו צבעוני מייצג איזוטופים נבחרים מלשונית האנליטים. כאשר רמות האיזוטופים יציבות, כוונן את זרם הבחירה הנוכחי מהתפריט הנפתח בכרטיסיית הפרמטרים של חלון הגדרות רכישת הנתונים.

בחלון ההתחלה, הזן אפס לסיום, הזן 10. עבור ערך שלב, הזן 0.5 ועבור זמן הסדר, הזן 200. לאחר מכן לחץ על שמור.

לאחר מכן לחץ שוב על המסות לכל חלון קריאה ולחץ על הפעל. לאחר שציינת היכן האותות של האיזוטופים מגיעים לשיא, עבור ללשונית הגדרת ערוץ DAC בחלון הגדרת המכשיר. גלול מטה אל זרם והזן את ערך שיא האיזוטופ.

לחץ על הגדר ערך נוכחי בפועל ולאחר מכן שמור. לאחר מכן, שנה את התפריט הנפתח כדי לפצות על גז. הזן 0.55 בחלון ההתחלה, 0.95 בחלון הסיום, 0.05 בחלון ערך השלב ו- 200 בחלון זמן ההתיישבות.

לחץ על שמור. לאחר החזרה להמונים לכל חלון קריאה ולחיצה נוספת על הפעל, ציר ה-x יציג כעת את קצב זרימת גז האיפור. שימו לב לערכים שבהם האותות של האיזוטופים מגיעים לשיא ושימו לב לעלייה המהירה של אות GD 1 55 לקראת הסוף.

לאחר מכן חזור ללשונית הגדרת ערוץ DAC. גלול מטה אל איפור, גז והזן את ערך שיא האיזוטופ החדש. לחץ על הגדר ערך נוכחי בפועל.

לאחר מכן לחץ שוב על שמור כדי לרשום את היחס בין האיזוטופ הרצוי לעומת התחמוצת. ראשית, בצע הזרקה שנייה של 450 מיקרוליטר של תמיסת כוונון. לאחר מכן, בכרטיסיית הפרמטרים, בחר זמן מהתפריט הנפתח והזן אפס בחלון ההתחלה, 10 בחלון הסיום, אחד בחלון ערך הצעד ו -200 בחלון ההתיישבות.

לאחר לחיצה על Play in the mass per reading window, השתמש בסמן כדי לקרוא את הערך הגבוה יותר עבור TM 1 69 או TB 1 59, וגם את הערך GD 1 55. כעת הזריקו שלושה מיליליטר מים של Milli Q דרך לולאת הדגימה, ואחריהם 500 מיקרוליטר של תמיסת כביסה DVS. בכרטיסייה כיול מסה, לחץ על הפעלה כדי לעקוב אחר התקדמות שטיפת הניקוי עד שעוצמת הפסים מתחילה לרדת.

לאחר מכן המשיכו עם שלושה מיליליטר של מים מילי-קוביות ועקבו עד שהפסים יורדים לרמות הרקע. התחל בהזנת האיזוטופים לדוגמה שהודגמו זה עתה עבור איזוטופים של תמיסת הכוונון, ולאחר מכן לחץ על שמור. לאחר מכן, פתח את חלון הרכישה ושנה את הגדרות הרכישה לפי הצורך עבור אמצעי האחסון לדוגמה.

לדוגמה, דגימה של 450 מיקרוליטר תמלא את לולאת הדגימה וייקח 600 שניות לרוץ כדי לאפשר עיכובים ברכישת נתוני התא. הגדר את עיכוב הרכישה ל-30 שניות לפחות ואת עיכוב יציבות הגלאי ל-20 שניות לפחות לפני ההפעלה. שטפו את דגימות התאים לפחות פעמיים במי מילי-קוביות, ולאחר מכן השעו מחדש את הדגימה במקסימום של 10 עד ששת התאים למיליליטר וסננו את תמיסת התאים המתקבלת דרך מסננת תאים של 35 מיקרומטר.

כדי להסיר אגרגטים. כעת הזן שם קובץ חדש עבור הדוגמה הנוכחית. שים לב שיש לשמור את כל הקבצים בכונן האלקטרוני.

לאחר מכן העבר את שסתום לולאת הדגימה לטעינה, הזריק את הדגימה, העבר את שסתום לולאת הדגימה בחזרה להזרקה ולאחר מכן לחץ על הפעל. בחלון הרכישה. התאים יוצגו בחלון התמונה כאוספים אופקיים של סימנים בכל ערוץ איזוטופ אנכי ויציגו את הרזולוציה הטובה ביותר בסביבות 300 עד 500 תאים לשנייה כפי שמודגם כאן.

בסיום רכישת הנתונים של הדגימה, יופיע חלון מוקפץ. לחץ על אישור כדי לאשר את השלמת הפעלת הדגימה, ולאחר מכן הזריק לפחות 500 מיקרוליטר של מים MQ בין כל דגימה כדי לעזור למזער כל העברת דגימה לניקוי המכונה לאחר השימוש, הזריק 450 מיקרוליטר של תמיסת כביסה לתוך לולאת הדגימה. עקוב אחר שחרור המתכת החופשית ולאחר מכן שטוף את לולאת הדגימה בשלושה מיליליטר מים של מילי-Q תוך ניטור הכביסה עד להשגת רמות פס ברקע.

לאחר מכן כדי לכבות את המכונה, בחר בכרטיסייה בקר RFG בחלון הגדרת המכשיר ולחץ על עצור פלזמה. לאחר השלמת ההליך, לחץ על אישור בחלון המוקפץ, וממליץ על הסרת הנבולייזר מתחת לכרטיסייה כלוב הכרטיסים. כבה את התנור, סגור את השסתום על אספקת הארגון ואז משוך בזהירות לאחור את הנבולייזר כדי להסיר אותו מתא הריסוס.

לאחר מכן, הברג את צינור ההקדמה לדוגמה והנח אותו בצד. הברג את חיבור החדרת גז האיפור עד שהוא משתחרר מעט, ולאחר מכן משוך את הנבולייזר. לבסוף, באמצעות אותו מזרק וצינורות כפי שהודגם קודם לכן, נקה את שתי היציאות של הנבולייזר עם 5% אתרוג ואחסן את הנבולייזר מכוסה ב-5% אתרוג עד לשימוש הבא.

שטיפה נאותה של ציטומטר המסה עם מי UE ותמיסת כביסה DVS תפחית את רמות ספיגת המתכת לצינורות ולחלקים אחרים של המכונה ותסייע להפחית כל רקע כפי שניתן לראות בגרפים אלה. כוונון לא תקין המיוצג על ידי קו המג'נטה הגדיל משמעותית את היווצרות התחמוצת ב-m פלוס 16 בהשוואה לדגימה המכוונת כהלכה כפי שמודגם על ידי הקו הכחול הכהה. יש לכך השפעה של הפחתה קלה של האותות הרצויים ב-m והגדלה משמעותית של הפרעות הרקע הלא רצויות ב-m פלוס 16.

שטיפה נכונה ודילול נכון של הדגימות במי Milli Q יבטיחו רקע מינימלי ורזולוציה גבוהה ביותר של התאים תוך איזון הצורך במהירות. בדומה לנתונים מניסוי מייצג המוצג כאן בניסוי זה, חרוזי פוליסטירן המכילים שפע טבעי לנתנום 1 39 ODIUM אחד 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 ו- LUTETIUM 1 75 הופעלו במצב רכישת תאים. הנתונים נותחו באמצעות FlowJo ופסולת מכל חרוזים שבורים הוצאה החוצה.

הדגימה המכוונת כהלכה נקבעה בקצב זרימה של 0.74 ליטר לדקה כפי שמיוצג עם הקו הכחול הכהה. עוצמות אות גבוהות יותר נצפו בקצב זרימה זה מאשר בקצבי הזרימה הנמוכים יותר, ולדגימה מכוונת כהלכה זו נצפה אות גבוה יותר במסות המתכת M ופחות אות ב-m פלוס 16 מסות תחמוצת מאשר האותות המכוונים בצורה לא נכונה. תקריב של האות ב-M Mass LANTHANUM 1 39 ו-THULIUM 1 69 מוצג כאן.

שים לב שקצב זרימת גז האיפור משפיע על עוצמת האות של LANTHANUM 1 39 יותר מאשר על עוצמת האות של תוליום 1 69. גרפים אלה מראים את האות ב-m ועוד 16 מסות תחמוצת 1 55 ו-180 5 המקבילות ל-LANTHANUM 1 39 פלוס oh 16 ותוליום 1 69 פלוס oh 16 תחמוצות בהתאמה. שימו לב שקצב זרימת גז האיפור מגדיל את אות המסה 1 55 הרבה יותר מאשר אות המסה 180 5 מכיוון שלנתנום 1 39 מתחמצן בקלות רבה יותר מאשר תוליום 1 69.

עוצמות האות m ו-m פלוס 16 כפונקציה של קצב זרימת גז האיפור מתוארות כאן. הסמלים הממולאים מייצגים את ה-MASS M.בעוד שהסמלים הפתוחים מייצגים את המסה M פלוס 16, צבעי הקווים תואמים את המסה המתאימה M.שימו לב שעוצמות האות של LANTHANUM 1 39 ומחיר ODIUM 1 41 מושפעות מאוד מקצב זרימת גז האיפור. אפילו הגעה לנקודה שבה קיימת יותר מסה m פלוס 16 תחמוצת מאשר מסה M.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל את ה-CyTOF כראוי, לכוון אותו כראוי, ואז להריץ את הדגימות שלך, ולבסוף לנקות ולכבות כראוי את המכונה בסוף הריצות היומיות שלך.