Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את הכיול היומי הנכון ואת ניתוח הדגימות במכשיר CyTOF. ראשית, המכשיר מורכב ומופעל. לאחר מכן, הגדרות המכשיר מותאמות לכיול כדי להגיע לאות מקסימלי.

כעת המכונה מוכנה להרצת הדגימות. בשלב הסופי, המכונה מנוקה ומכובה. בסופו של דבר, ניתן להפיק נתוני תאים אופטימליים בהתאם לדרישות זמן ספציפיות.

הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית. קשה ללמוד את נהלי ההגדרה היומיים, הכיוונון והניקוי מתוך המדריך, שכן הם כוללים מספר שלבים תוכנתיים המבוצעים בו-זמנית.

עליכם לרכוש ניסיון כדי להתרגל לרמות הרקע ועוצמות האות המתאימות. לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי, פתחו את תוכנת ה-CyTOF ובחרו ב-instrument setup. לאחר מכן, בלשונית card cage, לחצו על כפתור ה-heater on כדי לאפשר למעטפת תא הריסוס להגיע ל-200 °C.

החליפו את המזרק במשאבת המזרקים במזרק חדש מלא במים מזוקקים (milli cube water). לאחר מכן, נקו את הנבולייזר על ידי שטיפה אחורית עם 5% Citron פעמיים דרך כל פתח. כדי להסיר שאריות של Citron, חזרו על השטיפה האחורית עם מי Milli Q.

בשלב הבא, פתח את שסתום מיכל גז הארגון, מה שיגרום לנורית הארגון בחזית המכשיר להידלק. לאחר מכן, חבר את הנבולייזר לכניסת גז הפיצוי (makeup gas) וחבר את הנבולייזר לצינור הכנסת הנוזלים. הכנס את קצה הנבולייזר לתוך הפתח הלבן במעטפת החימום בלשונית בקר ה-RFG בחלון הגדרות המכשיר.

לחצו על start plasma, ולאחר מכן לחצו על okay. לאחר סיום ההפעלה, לחצו שוב על okay בחלון הקופץ. כעת הפעילו את משאבת המזרקים.

בעת מילוי מחדש של המזרק, לחץ על כפתור העצירה (stop) במקום על כפתור ההפסקה (pause) כדי לאפס את מונה הנפח. לפני כיול הציטומטר המסי (mass cytometer), ודא שהמכשיר חומם במשך 20 דקות. לאחר שהמכונה התייצבה, לחץ על כפתור הגדרות הרכישה כדי לפתוח את חלון הגדרות רכישת הנתונים. בלשונית האנליטים (analytes).

לחץ על הטבלה המחזורית כדי לפתוח את פאנל בחירת האיזוטופים. לאחר מכן, בחר את האיזוטופים הנמצאים בתמיסת הכיול של DVS sciences המפורטים במדריך ולחץ על שמירה. לאחר מכן, לחץ על כפתור האיזוטופים לקריאה כדי לפתוח את חלון המסות לקריאה.

בחרו את מספר הפולסים ושנו את קנה המידה של ציר ה-y על ידי הזנת מספר חדש ולחיצה על enter. כעת מלאו מזרק הזרקה רגיל של 1 mL בצבע ירוק בתמיסת כיוונון. סובבו את בורר יציאת הדגימה למצב טעינה (load).

הזריק 450 µL של תמיסת כיול (tuning solution), ולאחר מכן סובב את הבורר למצב הזרקה. המתן עד שאיזוטופי תמיסת הכיול יחלו להופיע כפסים בתצוגה זו. האותות באזור זמן התעופה (time of flight) שבין 9,400 ל-9,800 נובעים מאיזוטופי xenon בגז ה-argon.

כעת חזרו למסות לכל חלון קריאה ולחצו על כפתור הנגינה הירוק. כל קו צבעוני מייצג איזוטופים שנבחרו מלשונית האנליטים. כאשר רמות האיזוטופים יציבות, כווננו את הזרם הנבחר מהתפריט הנפתח בלשונית הפרמטרים של חלון הגדרות רכישת הנתונים.

בחלון ההתחלה, הזן 0 עבור סיום, והזן 10. עבור ערך הצעד, הזן 0.5, ועבור זמן ההתייצבות, הזן 200. לאחר מכן לחץ על שמירה.

לאחר מכן, לחצו שוב על חלון המסות לכל קריאה (masses per reading) ולחצו על play. לאחר סימון נקודות השיא של אותות האיזוטופים, עברו ללשונית הגדרת ערוץ ה-DAC בחלון הגדרות המכשיר. גללו מטה לזרם (current) והזינו את ערך שיא האיזוטופ.

לחצו על set actual current value, ולאחר מכן שמרו. כעת, שנו את התפריט הנפתח ל-make up gas. הזינו 0.55 בחלון ההתחלה (start), 0.95 בחלון הסיום (end), 0.05 בחלון ערך הצעד (step value) ו-200 בחלון זמן ההתייצבות (settling time).

לחצו על save. לאחר החזרה לחלון ה-masses per reading ולחיצה נוספת על play, ציר ה-x יציג כעת את קצב זרימת גז הפיצוי (makeup gas flow rate). שימו לב לערכים שבהם אותות האיזוטופים מגיעים לשיא, והבחינו בעלייה המהירה של אות ה-GD 1 55 לקראת הסוף.

לאחר מכן, חזרו ללשונית הגדרות ערוץ ה-DAC. גללו מטה ל-makeup gas, והזינו את ערך שיא האיזוטופ החדש. לחצו על set actual current value.

לאחר מכן, לחצו שוב על save כדי לתעד את היחס בין האיזוטופ הרצוי לתחמוצת. ראשית, בצעו הזרקה שנייה של 450 microliter של תמיסת כיוונון (tuning solution). לאחר מכן, בלשונית הפרמטרים (parameter tab), בחרו time מהתפריט הנפתח והזינו אפס בחלון ההתחלה (start), 10 בחלון הסיום (end), 1 בערך הצעד (step value), ו-200 בחלון ההתייצבות (settling).

לאחר לחיצה על play בחלון המסות לכל קריאה (masses per reading), השתמש בסמן כדי לקרוא את הערך הגבוה יותר עבור TM 1 69 או TB 1 59, וכן את ערך ה-GD 1 55. כעת הזרק שלושה מיליליטר של מי Milli Q דרך לולאת הדגימה, ולאחריהם 500 microliters של תמיסת שטיפה DVS. בלשונית כיול המסה (mass calibration), לחץ על run כדי לעקוב אחר התקדמות שטיפת הניקוי עד שעוצמת הפסים תתחיל לרדת.

לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של מי m Milli-Q ועקבו עד שהפסגות יירדו לרמות הרקע. התחילו בהזנת האיזוטופים של הדגימה שהודגמו כעת עבור האיזוטופים של תמיסת הכיול, ולאחר מכן לחצו על שמירה. בשלב הבא, פתחו את חלון הרכישה ושנו את הגדרות הרכישה בהתאם לנפח הדגימה.

לדוגמה, דגימה של 450 µL תמלא את לולאת הדגימה ותיקח 600 שניות להרצה כדי לאפשר עיכובים ברכישת נתוני התאים. הגדירו את עיכוב הרכישה (acquisition delay) ל-30 שניות לפחות ואת עיכוב יציבות הגלאי (detector stability delay) ל-20 שניות לפחות לפני ההרצה. שטפו את דגימות התאים לפחות פעמיים במים מזוקקים (milli cube water), ולאחר מכן השהו מחדש את הדגימה בריכוז מקסימלי של 10⁶ תאים למילליליטר וסננו את תמיסת התאים שהתקבלה דרך מסננת תאים של 35 µm.

כדי להסיר אגרגטים כלשהם. כעת הזן שם קובץ חדש עבור הדגימה הנוכחית. שים לב שיש לשמור את כל הקבצים בכונן E.

לאחר מכן העבירו את שסתום לולאת הדגימה למצב טעינה (load), הזריקו את הדגימה, העבירו את שסתום לולאת הדגימה בחזרה למצב הזרקה (inject), ולאחר מכן לחצו על run. בחלון הרכישה, התאים ייוצגו בחלון הצילום (snapshot) כאוספים אופקיים של סימונים בכל ערוץ איזוטופי אנכי, ויציגו את הרזולוציה הטובה ביותר סביב 300 עד 500 תאים לשנייה, כפי שמוצג כאן.

בסיום רכישת הנתונים של הדגימה, יופיע חלון קופץ. לחצו על אישור כדי לאשר את סיום הרצת הדגימה, ולאחר מכן מזריקו לפחות 500 µL של מי MQ בין דגימה לדגימה כדי לסייע בצמצום שאריות דגימה (carryover) ולניקוי המכשיר. לאחר השימוש, מזריקו 450 µL של תמיסת שטיפה ללולאת הדגימה. עקבו אחר שחרור המתכת החופשית ולאחר מכן שטפו את לולאת הדגימה עם 3 mL של מי milli Q, תוך ניטור השטיפה עד להשגת רמות רקע של הפסים.

כדי לכבות את המכשיר, בחרו בלשונית בקר ה-RFG בחלון הגדרות המכשיר ולחצו על stop plasma. כאשר הפעולה מסתיימת, לחצו על okay בחלון הקופץ, הממליץ להסיר את הנבולייזר תחת לשונית ה-card cage. כבו את המחמם, סגרו את השסתום באספקת ה-argonne, ולאחר מכן משכו בזהירות את הנבולייזר לאחור כדי להוציאו מתא הריסוס.

בשלב הבא, שחררו את הברגת צינור הכנסת הדגימה והניחו אותו בצד. שחררו את חיבור הכנסת גז המייקאפ עד שיתרופף מעט, ולאחר מכן משכו החוצה את הנבולייזר. לבסוף, באמצעות אותה מזרקה וצינור כפי שהודגם קודם לכן, נקו את שני הפתחים של הנבולייזר באמצעות 5%Citron ואחסנו את הנבולייזר כשהוא מכוסה ב-5%Citron עד לשימוש הבא.

שטיפה מספקת של הציטומטר ההמוני (mass cytometer) במים מסוג UE ובתמיסת שטיפה DVS תפחית את רמות ספיגת המתכת לצינורות ולחלקים אחרים של המכשיר, ובכך תסייע להפחית כל רקע כפי שניתן לראות בגרפים אלו. כיוון (tuning) לא תקין, המיוצג על ידי הקו המגנטה, הגביר משמעותית את היווצרות התחמוצות ב-m plus 16 בהשוואה לדגימה מכוונת כראוי, כפי שמוצג על ידי הקו הכחול הכהה. לכך יש השפעה של הפחתה קלה של האותות הרצויים ב-m והגברה משמעותית של הפרעות הרקע הבלתי רצויות ב-m plus 16.

שטיפה נכונה ודילול תקין של הדגימות במים מזוקקים (Milli Q) יבטיחו רקע מינימלי ורזולוציה מרבית של תאים, תוך איזון הצורך במהירות. בדומה לנתונים מניסוי מייצג המוצגים כאן, בניסוי זה הועברו חרוזי פוליסטירן המכילים שפע טבעי של lanthanum 1 39 ODIUM one 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 ו-LUTETIUM 1 75 במצב רכישת תאים. הנתונים נותחו באמצעות FlowJo, וחלקיקים משאריות של חרוזים שבורים הוצאו מהניתוח באמצעות gating.

נקבע כי הדגימה המכוונת כראוי נמצאת בקצב זרימה של 0.74 liters per minute, כפי שמוצג בקו הכחול הכהה. עוצמות אות גבוהות יותר נצפו בקצב זרימה זה מאשר בקצבי זרימה נמוכים יותר, ונצפה כי לדגימה המכוונת כראוי זו יש אות גבוה יותר במסות המתכת M ואות נמוך יותר במסות התחמוצת m plus 16 בהשוואה לאותות שלא כווננו כראוי. תצוגה מקריבה של האות במסה M של LANTHANUM 1 39 ו-THULIUM 1 69 מוצגת כאן.

שימו לב שקצב זרימת גז ההשלמה משפיע על עוצמת האות של LANTHANUM 1 39 יותר מאשר על עוצמת האות של thulium 1 69. גרפים אלו מראים את האות במסות תחמוצת m פלוס 16 של 1 55 ו-180 5, המתאימות לתחמוצות של LANTHANUM 1 39 פלוס oh 16 ו-thulium 1 69 פלוס oh 16 בהתאמה. שימו לב שקצב זרימת גז ההשלמה מגדיל את האות במסה 1 55 הרבה יותר מאשר את האות במסה 180 5, כיוון ש-lanthanum 1 39 מתחמצן בקלות רבה יותר מאשר thulium 1 69.

עוצמות האות של m ו-m פלוס 16 כפונקציה של קצב זרימת גז המילוי מוצגות כאן. הסמלים המלאים מייצגים את MASS M, בעוד שהסמלים הפתוחים מייצגים את המסה M פלוס 16, וצבעי הקווים תואמים למסה M הרלוונטית. שימו לב שעוצמות האות של LANTHANUM 1 39 ו-PRASEODYMIUM 1 41 מושפעות מאוד מקצב זרימת גז המילוי, עד לרמה שבה קיימת כמות גדולה יותר של תחמוצת המסה m פלוס 16 מאשר של מסה M. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להפעיל את ה-CyTOF, לכווננו כראוי, להריץ את הדגימות שלכם, ולבסוף לנקות ולכבות את המכשיר כראוי בסיום ההרצות היומיות.