חקירות על שינויים בתפקוד המעגל היפוקמפוס בעקבות פגיעה מוחית טראומטית קלה
19 בנובמבר 2012
גישה רבת פנים לחקר שינויים הפונקציונליים למעגלי היפוקמפוס מוסברת. טכניקות אלקטרו מתוארות יחד עם פרוטוקול פציעה, בדיקה התנהגותית ושיטת נתיחה אזורית. שילוב של טכניקות אלה יכול להיות מיושם באופן דומה לאזורים אחרים במוח ושאלות מדעיות.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון שינויים בתפקוד הרשת של אזורי המוח המושפעים ממודל ניסויי של פגיעת ראש טראומטית קלה. הניסויים מתחילים בהסבת פגיעת פרקוסיות של נוזלים לטרלית בעכבר, המדמה הן את הפתולוגיה והן את הסימפטומטולוגיה של פגיעת ראש טראומטית קלה בבני אדם. כשלב שני, נעשה שימוש בתגובת פחד מותנית הקשרית, התנהגות תלויה בהיפוקמפוס, כדי להעריך ליקוי קוגניטיבי שנגרם כתוצאה מפגיעת המוח. לאחר מכן, נעשה שימוש בהקלטות חוץ-תאיות ותוך-תאיות יחד עם צבעים רגישים למתח כדי לקבוע את השינויים הספציפיים לאזור במאזן הסינפטי בין תמסירה סינפטית מעוררת למעכבת. באזור העניין, ההיפוקמפוס, התוצאות מראות שינויים ספציפיים לתת-אזורים ביעילות הסינפטית נטו בהיפוקמפוס, בהתבסס על הבדלים בין עכברי הביקורת לעכברים עם פגיעת מוח בשלוש טכניקות ההקלטה המתוארות.
היתרון המרכזי של גישה זו הוא היכולת להבחין בהשפעות של המצב הפתולוגי ושל הטיפולים הפוטנציאליים במספר סדרי גודל פיזיולוגיים, מה שמאפשר תמונה קוהרנטית יותר של הליקויים במעגל זה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לפגיעה מוחית טראומטית, כגון אילו נוירונים רגישים ביותר לפגיעה באופן ספציפי, ולפיכך תורמים במידה המרבית לתפקוד לקוי של ההיפוקמפוס לאחר הפגיעה. ההשלכות של הגישה שלנו נשמרות לגבי הטיפול בפגיעה מוחית טראומטית, שכן היא מאפשרת לנו לאפיין תחילה את המנגנונים הבסיסיים, ולאחר מכן לפתח טיפולים פוטנציאליים להחזרת פיזיולוגיה תקינה באזורים שנפגעו כתוצאה מפגיעה מוחית.
בנוהל זה, הרדימו את העכבר באמצעות תערובת של ketamine ו-xylazine הניתנת באופן תוך-peritoneal. לאחר מכן, בצעו craniectomy בצורת C מעל האזור הפריאטלי הימני באמצעות מקדח בעל קוטר חיצוני של 3 mm. לאחר מכן, קבעו את בסיס המחט (lure lock needle hub) מעל ה-craniectomy בצורת C באמצעות cyanoacrylate ואקריליק דנטלי.
24 שעות לאחר מכן, הרדמו את העכבר באמצעות isof fluorine בשאיפה. לאחר שחוזרת נשימה תקינה, אך לפני שהעכבר הופך רגיש לגירויים, הגש פולס של 20 millisecond של מי מלח לגולגולת באמצעות מכשיר הפגיעה בלחץ נוזלי (fluid percussion injury device). הסר את המחובר (hub) מיד לאחר הפגיעה. לאחר מכן, הרדמו שוב את העכבר באמצעות isof fluorine ותפר את הקרקפת.
טפלו בעכבר במשך יומיים רצופים לפני האימון לתגובת פחד מותנית. ביום האימון, הניחו את העכבר בתא ההתניה למשך שלוש דקות לפני מתן שוק רצפתי של 1.5 amp למשך שניות שתיים. לאחר מכן, השאירו את העכבר בתא למשך 30 שניות נוספות לפני הוצאתו.
לאחר תקופת השהיה של 24 שעות, החזירו את העכבר לתא ההתנייה למשך חמש דקות, ולאחר מכן העריכו את רמת ההקפאה במרווחי זמן של חמש שניות שבעה ימים לאחר הפגיעה. הכינו ליטר אחד של נוזל חוט שדרה מלאכותי ו-250 מיליליטר של תמיסת חיתוך סוכרוז. ודאו שכל המכשירים והתמיסות המשמשים להכנת פרוסות המוח קרים מאוד על קרח.
הרד את העכבר באמצעות isof fluorine במהירות ובעדינות. הוצא את המוח מהעכבר והנח אותו בסוכרוז. לאחר מכן, קצץ את המוח.
הניחו את פני השטח החתוכים והטריים של המוח על טיפה של דבק מהיר (superglue) על במת ה-Vibram, לפני בלוק של אגר. חתכו פרוסות קורונליות בעובי 350 micron. ניתן להפיק ארבע או חמש פרוסות עם מעגל היפוקמפאל שלם.
לאחר מכן, דגרו את הפרוסות למשך שעה אחת לפחות ב-37 °C. כעת, הכינו מספר אלקטרודות זכוכית בורוסיליקט בהתנגדות של 2 עד 5 MΩ. באמצעות השובך האנכי (vertical puller), העבירו פרוסה לתא, ולאחר מכן הניחו אלקטרודה על תומך האלקטרודות להקלטת פוטנציאל שדה חוץ-תאי.
מקם את אלקטרודת הגירוי מעל למסלול האקסונים בתוך הפרוסה, כגון נתיב ה-perent או ה-Shafer collaterals. לאחר מכן, המשך להוריד את אלקטרודת ההקלטה אל תוך הפרוסה. לבסוף, העבר פולס חשמלי בודד כדי לעורר את פוטנציאל הפוסט-סינפטי החוץ-תאי (field extracellular postsynaptic potential).
המשך בגירוי תוך שינוי עומק אלקטרודת ההקלטה בין הגירויים עד להשגת התגובה המקסימלית. דבר זה מעיד על כך שהאלקטרודות נמצאות באותו מישור Z. הניתוח כולל בדרך כלל מדידות המשוות את אמפליטודת ה-fiber volley בעכברים עם פגיעה מוחית ובכאלה שעברו ניתוח דמה (sham) כדי להעריך אקטיבציה פרה-סינפטית, וכן השוואה של שיפוע ה-F-E-P-S-P כדי להעריך אקטיבציה פוסט-סינפטית. עבור הקלטת patch clamp, העבר שוב פרוסה לתא והורד את אלקטרודת ההקלטה.
התקרבו לתא כאשר על האלקטרודה מופעל לחץ חיובי, כדי להבטיח שהאלקטרודה המקליטה לא תיסתם בזמן תנועתה כלפי מטה דרך הרקמה. כאשר האלקטרודה נוגעת בעדינות בתא, הפעילו לחץ שלילי כדי ליצור giga seal בין האלקטרודה לקרומי התא. לאחר מכן, הפעילו פרצים קצרים של לחץ שלילי כדי לקרוע את קרומי התא ולהגיע לקונפיגורציית whole cell.
בטלו את הטרנזיינט של הקיבול (capacitance transient) באמצעות המגבר ופצו על התנגדות טורית כדי להבטיח מדידות מדויקות. לאחר מכן, כמתו והשוו את הקצב והגודל של זרמים סינפטיים ספונטניים בעכברים עם פגיעת מוח וביחסי בקרה שעברו ניתוח דמה (sham). בשלב זה, הכינו את תמיסת המלאי של הצבע על ידי ערבוב של 1 mg של צבע dye three onap DHQ ב-50 µL של אתנול.
חלקו מנות של 2 µL למבחנות עטופות ברבדי רפאל (foil), ואחסנו בטמפרטורה של 20°C- . הכינו מדי יום את תמיסת הצבע לעבודה בדילול של 1:200 ב-A CSF. לאחר מכן, הדגירו פרוסה על נייר סינון טבול ב-A CSF וצבעו עם 90 µL של צבע למשך 16 דקות.
לאחר מכן, שטוף זאת והנח את הדגימה בתא הקלטת הממשק. מקם את אלקטרודות הגירוי וההקלטה כפי שמתואר בשיטה להקלטת פוטנציאל שדה חוץ-תאי.
כווננו את עוצמת גירוי האור עד שהתגובה תהיה ממורכזת במרכז המצלמה. תמונות טווח נרכשות בדרך כלל בקצב של 500 עד 1000 פריימים לשנייה. הפעילו את התריס לגירוי האור 200 milliseconds לפני הגירוי החשמלי כדי לאפשר לייצוב של הבהרה פוטוכימית (photo bleaching) ראשונית ומהירה.
המתנה של 10 שניות בין הניסויים. יש להחליף בין ניסויי הרכישה של גירוי חשמלי לבין ניסויי רכישה ללא גירוי חשמלי, כדי לאפשר חיסור מאוחר יותר של הרקע ללא הגירוי החשמלי. לאחר מכן, רשום את עוצמת האור במצב מנוחה לפני פתיחת התריס.
ניתן לנתח כל ניסוי VSD כסרט של קריאות פלואורסצנציה. כלומר, כל ניסוי הוא מטריצת נתונים תלת-ממדית עם ערכים בממדים מרחביים X ו-Y לאורך זמן. הקליטו 10 עד 12 ניסויי VSD בכל תנאי בדיקה, וחשבו את השינוי הפלואורסצנטי הנורמלי למצב שלפני ההארה בתוך הפיקסל (intra pixel pre illumination normalized fluorescence change) בהתאם לכתב היד המצורף.
איור זה מציג דוגמה להקלטת F-E-P-S-P באזור CA1. הסטייה הראשונה כלפי מטה היא ארטיפקט הגירוי, ואחריה ה-presynaptic fiber volley, ולאחר מכן ה-F-E-P-S-P. כאן מוצגות עקומות קלט-פלט המתארות ירידה ביעילות הסינפטית נטו ב-CA1 בעקבות פגיעת זעזוע נוזלית (fluid percussion injury).
והנה עקומות הקלט-פלט המתארות עלייה ביעילות הסינפטית נטו ב-dentate gyrus בעקבות FPI. להלן דוגמה לזרם פוסט-סינפטי עירורי ספונטני מתא parametal ב-CA1. להלן דוגמה לרצף פוטנציאלי פעולה מתא parametal ב-CA1 ומנוירון ביניים בעל פריקה מהירה (fast spiking) ב-CA1.
זהו נוירון מעכב מסוג ca one ממולא ב-Lucifer yellow ללא קוצים דנדריטיים, וכאן מופיע נוירון פירמידלי מסוג ca one ממולא ב-Lucifer yellow עם קוצים דנדריטיים. דמויות אלו מציגות פלח קורונלי של היפוקמפוס של עכבר. הפיקסלים הצהובים עד האדומים מייצגים את הפעילות המעוררת באזור ca one כ-14 milliseconds לאחר גירוי של ה-shafer collateral האפרנטי.
צבע אדום מציין דפולריזציה רבה יותר, בעוד שצבע צהוב מציין דפולריזציה פחותה אך עדיין משמעותית. הפיקסלים הכחולים מייצגים את אתרי הפעילות המעכבת באזור ca 1 כ-56 מילישניות לאחר אותה גרייה של ה-Afferent Shafer collateral, כאשר כחול כהה יותר מציין היפר-פולריזציה רבה יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן השילוב של מספר טכניקות הקלטה ex vivo כדי להתמודד עם מצב פתולוגי רלוונטי קלינית הכולל תפקוד לקוי של מעגלים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג גישה מקיפה לבחינת שינויים תפקודיים במעגלי ההיפוקמפוס בעקבות פגיעה מוחית טראומטית קלה. הוא מפרט את השימוש בטכניקות אלקטרופיזיולוגיות, פרוטוקולי פגיעה, הערכות התנהגותיות ושיטות נתיחה אזוריות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- פגיעה מוחית טראומטית
רקע
- פגיעת ראש טראומטית קלה עלולה להוביל לליקויים קוגניטיביים.
- ההיפוקמפוס חיוני לזיכרון וללמידה.
- הבנת שינויים סינפטיים יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות.
- הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מספקות תובנות לגבי הולכה סינפטית.
מטרת המחקר
- לבחון שינויים בתפקוד הרשת בהיפוקמפוס לאחר פגיעה.
- להעריך ליקויים קוגניטיביים באמצעות מבחנים התנהגותיים.
- לחקור שינויים במאזן הסינפטי בין תמסורות מעוררות למעכבות.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- מודל פגיעה במוח באמצעות מכת פטיש לטרלית בעכברים.
- הערכה התנהגותית של תגובת פחד מותנית לפי הקשר.
- הקלטות חוץ-תאיות ותוך-תאיות.
- שימוש בצבעים רגישים למתח כדי לנתח שינויים סינפטיים.
תוצאות עיקריות
- נצפו שינויים ביעילות סינפטית הספציפיים לתתי-אזורים.
- הבדלים בהעברה סינפטית נרשמו בין עכברים של קבוצת הביקורת לעכברים פגועים.
- גישה זו מאפשרת להבין את השפעות הפגיעה על תפקוד ההיפוקמפוס.
- התובנות שנרכשו עשויות להנחות התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.
מסקנות
- המחקר שופך אור על המנגנונים העומדים בבסיס התפקוד הלקוי של ההיפוקמפוס לאחר פגיעה.
- הוא מדגיש את חשיבותן של אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות בתגובה לפגיעה.
- הממצאים עשויים להנחות אסטרטגיות טיפוליות עתידיות עבור פגיעות ראש טראומטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות למגזר התעשייה
הבנת התפקוד הלקוי של מעגלי ההיפוקמפוס היא קריטית להפחתת הסיכונים בפיתוח טיפולים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS) עבור פגיעות ראש טראומטיות קלות. גישה קומבינטורית זו של ex vivo מאפשרת בחינה מכניסטית של חוסר איזון סינפטי בין תתי-אזורים בהיפוקמפוס, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים. באמצעות קישור שינויים ברמת המעגל לתוצאות התנהגותיות, השיטה מספקת מידע לקבלת החלטות מותאמות סיכון בשלבי הקידום של תהליכי הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות בדיקת שינויים ביעילות סינפטית ספציפית לתתי-אזורים ב-dentate gyrus וב-CA1 לאחר פגיעה.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה ישירה של האיזון הסינפטי מעורר-מעכב במעגלים היפוקמפליים הרלוונטיים למחלה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי אוכלוסיות נוירונליות הרגישות ביותר לפגיעה ואלו התורמות לליקויים קוגניטיביים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות פרוסות היפוקמפוס עובריות להערכה של תרכובות בהמשך, באמצעות קריאות של פוטנציאל שדה חוץ-תאי, patch-clamp וצבע רגיש למתח.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מוכנות הבדיקה באמצעות דיסקציה ספציפית לאזור ותנאי הקלטה יציבים ex vivo במצבי בקרה ומצבי פגיעה.
- מוכנות לסריקה: מאפשר סריקה אמינה של תרכובות על ידי כימות הפעלה טרום-סינפטית ועקבית באמצעות מדידות של אמפליטודת fiber volley ושיפוע F-E-P-S-P.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מקשר בין ניתוח מעגלים בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח נוירוכימי ומטבולי מפורט של תתי-אזורים בהיפוקמפוס לאחר TBI.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקד בהפחתת סיכונים חזויה על ידי קביעת המנגנונים האחראים לפתולוגיה הקשורה ל-TBI, מעבר לאפיון פנומנולוגי.
- מערכת רלוונטית למחלה: משתמשת בפגיעת הפרקה נוזלית לטרלית (lateral fluid percussion injury) בעכברים כדי לדמות מאפיינים של TBI בבני אדם, כולל אובדן נוירונלי, גליוזיס ושיבוש יוני, לצורך ביסוס הביטחון ביעדים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משולבת לאורך כל רצף הגילוי, החל מבדיקת השערות בשלבי הגילוי המוקדמים ועד לפיתוח בדיקות ותיקוף פרה-קלני, ובכך היא תומכת בהחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) בהתבסס על מעורבות המטרה ברמת המעגל.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מדידת שינויים ספציפיים לאזור בהעברה סינפטית בין קלטים מעוררים למעכבים בהיפוקמפוס.
- סריקה: מבטיחה שחזור של הבדיקה ופלט כמותי באמצעות הכנה סטנדרטית של פרוסות, תנאי הקלטה יציבים ומדדים אלקטרופיזיולוגיים רב-פרמטריים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות השוואתיות, כולל אמפליטודה של fiber volley (פרה-סינפטית) ושיפוע של F-E-P-S-P (פוסט-סינפטית), להערכת שינויים ביעילות הסינפטית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח ספציפי לתתי-אזורים לצורך אנליזה נוירוכימית ומטבולית התואמת לליקויים קוגניטיביים התנהגותיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תפקוד לקוי של מעגלים במודלים של מחלות CNS מעבר ל-TBI, כולל אפילפסיה והפרעות נוירודגנרטיביות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי פתרון עמימות מכניסטית בתפקוד לקוי של מעגלים בהיפוקמפוס לאחר פגיעה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות טכניקות ex vivo שילוביות המיושמות במודל TBI מתוקף.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור שינויים סינפטיים לליקוי קוגניטיבי, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות של CNS.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון על ידי זיהוי תתי-אזורים בהיפוקמפוס ואוכלוסיות נוירונליות המניעות תפקוד לקוי של רשתות הקשור לפגיעה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, מודלים של פגיעות נוירוכירורגיות והתנייה התנהגותית לתגובת פחד הקשרית.
- תלוי בציוד למתן פגיעות פלואידיות (fluid percussion), חיתוך רטט (vibratory slicing), מגברי patch-clamp ומערכות דימות של צבעים רגישים למתח.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין תהליכי עבודה של התנהגות in vivo, אלקטרופיזיולוגיה ex vivo ואנליזה ביוכימית.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת פרוטוקולים של חיתוכי היפוקמפוס לאזורי מוח אחרים או למודלים של מחלות.
- מוגבל על ידי אילוצי חיוניות הרקמה בהקלטות ex vivo, הדורשים דיסקציה קפואה בקרח ודגירה מתוזמנת ב-37°C לשמירה על יציבות סינפטית.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:08
Lateral Fluid Percussion Injury
3:04
Behavioral Analysis- Conditioned Fear Response
3:42
Acute Hippocampal Slice Preparation
4:41
Extracellular Field Potential Recording and Visualized Patch-clamp Recording
6:43
Voltage Sensitive Dye Imaging
8:39
Results: Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury
10:33
Conclusion
