מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את תדירות החבטה של אורגניזמים מיקרוסקופיים השוחים בחופשיות. זה מושג על ידי הכנת דגימה של תולעים מיקרוסקופיות. לאחר מכן, ההתקנה האופטית מוכנה.

לאחר מכן נרשמת תבנית העקיפה שהוצגה על ידי האורגניזמים החיים. לבסוף, הנתונים המוקלטים מנותחים כדי לקבוע את תדירות השחייה. בסופו של דבר, נעשה שימוש בניתוח עקיפה כדי להראות שינויים בדפוסי התנועה של תולעים בלתי מוגבלות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה מסורתית, הוא שניתן לצפות בדפוסי שחייה כאשר המין נע בחופשיות במרחב תלת מימדי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אלגנטיות ים בשחייה חופשית, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים שקופים, קטנים ומיקרוסקופיים אחרים החשופים לתנאים משתנים. כדי להגדיר אלגנטיות C לניתוח וידאו, התחל בשימוש בחוט פלטינה שטוח כדי להעביר 10 עד 20 נמטודות בוגרות ל-NGM טרי.

אגר מילא לוחות פטרי שהכילו כתמים עגולים קטנים של אי קולי. אפשרו לנמטודות להטיל ביצים במשך שלוש עד חמש שעות, ואז הסירו את הבוגרים. וכך, הקמת תרבית קטנה מסונכרנת התפתחותית של 50 עד 150 נמטודות לגידול הנמטודות לבגרות המוקדמת, דגירה על צלחות הפטרי ב-20 מעלות צלזיוס למשך ארבעה עד חמישה ימים.

ביום ניתוח הווידאו, השתמש במיליליטר אחד של מים מזוקקים נטולי יונים כדי לשטוף צלחת של נמטודות בוגרות צעירות, ובכך לאסוף 50 עד 150 תולעים מהתרבית המסונכרנת. השתמש במיקרו צנטריפוגה כדי לסובב את התולעים לתחתית הצינור או לאפשר להן להתיישב בכוח הכבידה למשך כ-15 דקות. הוא מסיר את רוב המים מהצינור ומחליף אותם במיליליטר אחד של מים מזוקקים נטולי יונים כדי לשטוף את כל החיידקים הדבקים מהנמטודות.

בעזרת מיקרו פיפטה העבירו חמש עד 10 נמטודות במים לקוורץ. הרכיבו את המערך האופטי כפי שמוצג כאן, באמצעות לייזר ניאון הליום 543 ננומטר לדגימת יתר של שתי מראות אלומיניום קדמיות המשמשות לניווט קרן הלייזר דרך ה-vete, מחזיק vete, מסך הקרנה ומצלמה במהירות גבוהה המסוגלת לצלם בכ-240 פריימים לשנייה. לאחר מכן, השתמש בחתיכת פרפורם כדי לכסות את החלק העליון של הווט והפוך אותו כדי לערבב את הנמטודות לתוך עמוד המים.

הנח את הווט במחזיק ווט כך שהתולעים יהיו בתחילה ליד החלק העליון של הווט. בעזרת המראות, נווטו את קרן הלייזר דרך מרכז הווטה. מכיוון שהנמטודות צפופות יותר ממים, הן ייפלו לאט לאט לתחתית הווט תוך כדי שחייה בתוך עמוד המים במסך ההקרנה, צבעו את הנקודה המתאימה לקרן הלייזר המשודרת בשחור כדי להפחית את הפיזור כאשר הקרן המשודרת פוגשת את מסך ההקרנה.

ביטול או הפחתה של פיזור מהקרן המשודרת ימנע ממערך ה-CCD של המצלמה להרוות עקב הקרן המשודרת. כדי ללכוד מדד של גודל דפוס העקיפה, צייר קו של כחמישה סנטימטרים על מסך ההקרנה ליד נקודת קרן הלייזר המשודרת מבלי להפריע לתמונת האור העקיפה. כבה את תאורת החדר והקלט תמונות עקיפה על המסך בזמן שהתולעים עוברות דרך קרן הלייזר.

כדי להכין את נתוני הווידאו, התקן את תוכנית ניתוח הווידאו הבאה וייבא את הסרטון לתוכנית. הגדר את המקור כך שיתאים לנקודת הלייזר המועברת באמצעות התוכנה. עקוב אחר התזוזה הזוויתית של תמונת העקיפה שנוצרת על ידי כל נמטודה.

העתק והדבק נתונים בגיליון אלקטרוני והוסף 180 מעלות או PI עבור כל הזוויות השליליות. כדי לייצר גרף רציף. באמצעות מערך ניתוח הווידאו, מקם דיודת צילום עם שטח קטן מחוץ למרכז בתבנית העקיפה ישירות מול מסך ההקרנה באמצעות יציאת USB.

חבר את דיודת הצילום לאוסילוסקופ הדיגיטלי שמתחבר למחשב. שימו לב לדפוסי החבטות על מסך המחשב. שמור ערכות נתונים בתבנית ASCI או טקסט כדי לנתח את הנתונים.

השתמש בווידאו או בתמונה כדי לייבא את הנתונים לתוכנית ניתוח נתונים המסוגלת להתאים צורות גל. שימוש במזעור צ'יקווה מתאים לעקומה סינוסואידית כדי לקבוע את תדירות החבטה. ממוצע תדירות השחייה מדגימות שונות, וקבע את השונות.

עבור מחקר זה הנתונים נותחו סטטיסטית באמצעות גורם יחיד Inova, ואחריו Bon Ferran. בדיקת השוואות מרובות ערך P של פחות מ-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית לדפוסי עקיפה של מודל. התחל בשימוש במיקרוסקופ כדי לצלם תמונות כדי לצלם תמונה.

גרור אותו ל-Mathematica. השתמש בפקודה עיניים בינאריות כדי להמיר אותו לשחור-לבן. לחלופין, השתמשו בפקודה 'זיהוי קצוות' ליצירת תמונה בשחור-לבן שבה שני המספרים הנגררים שולטים בגסות הקצוות שנוצרו.

לאחר מכן, באמצעות פקודת נתוני התמונה, המר את התמונה למטריצה של אפסים ואחדים. השתמש בפקודה forer כדי לקדם, לשנות את המטריצה, ואז לרבע את הערך המוחלט של המטריצה, ולהציג את התמונה המתקבלת, שהיא תבנית העקיפה המתאימה לתמונה המקורית. בנוסף, השתמש בפונקציית היומן כדי לשנות את קנה המידה של הניגודיות של התמונה.

לבסוף, השוו את דפוסי העקיפה של המודל עם דפוסי העקיפה המתקבלים מתולעים השוחות בחופשיות. בדוגמה זו, אלגנטיות ים נחקרה בווטרינר קוורץ Q, ברוחב של סנטימטר אחד, בעובי של חמישה מילימטרים ובגובה של ארבעה סנטימטרים. דגימת תולעת בודדת באמצעות ניתוח וידאו.

תדירות השחייה הממוצעת שהתקבלה מניתוח וידאו בווטרינר בעובי חמישה מילימטרים הייתה כ-2.5 הרץ. באופן דומה, דגימה של תולעת בודדת בשיטת רכישת נתונים בזמן אמת ואוסילוסקופ דיגיטלי הביאה לתדירות שחייה של כ-2.7 הרץ. ניתן לחזור על הליך זה עבור תולעים רבות.

מחקר מפורט של תולעים השוחות בחופשיות גילה תדירות שחייה ממוצעת של 2.37 הרץ ב-5 מילימטרים. כצפוי, תדירות השחייה גבוהה מזו של תולעת זוחלת. באמצעות שיטת עקיפה זו, נמצא כי תדירות השחייה הממוצעת של אלגנטיות ים, המוגבלת למגלשת מיקרוסקופ, תואמת את הערך שפורסם בעבר של שני הרץ.

בעקבות הסרטון. הכנת נתונים ומידול של דפוסי עקיפה המודגמים בסרטון זה מאפשרים מידול של דפוסי עקיפה בשחייה. בעזרת תמונות תולעת המתקבלות במיקרוסקופ קונבנציונאלי, דפוסי העקיפה המודלים משמשים להדמיית מחזור שחייה של אלגנטיות הים.

מודל מוצלח מורכב מהצלחה אפשרית פיזית של דפוסי שחייה, התואמים את תדירות השחייה. התולעת צריכה להיות באותה צורה בסוף מחזור השחייה כפי שהייתה בתחילת מחזור השחייה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מדקה עבור כל תולעת באמצעות דיאטת הצילום המהיר תוך התבוננות במחזורי השחייה על מסך המחשב.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך נמטודות שוחות בחופשיות.