Name: מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: למד שיטת נידות כמותית של C. elegans בשחייה חופשית באמצעות ליזר עקיף. טכניקה זו מאפשרת מעקב תלת-ממדי בזמן אמת של תנועת הנמטודות ומספקת כלי יקר ערך לחקר התנהגות שחייה במיקרו-אורגניזמים שקופים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לצליל רוזנבלט, אלכסנדרה בלו וקרל Spuhler לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מכללת סאר מחקר מכון הקיץ לתואר הראשון (URSI), קרן מחקר סלמון מיינרד וסי ונאס&quot;א הפרס # NX09AU90A, קרן מדע המרכז הלאומי למחקר מצוינות במדע והטכנולוגיה (NSF-CREST) ​​פרס # 0630388 וNSF הפרס # 1058385.

1. ג הכנה לניתוח elegans וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 10-20 נמטודות מבוגרים הרות לצלחות NGM טריות אגר מלאות פטרי באמצעות נקר דק, שטוח פלטינת תיל. את צלחות פטרי מלא באגר NGM מכילות כתם עגול קטן של א &#39; coli (זן צמיחה מוגבל, OP50, נותן את התוצאות הטובות ביותר) לנמטודות לאכול. לאפשר לנמטודות להטיל ביצים במשך 3-5 שעות ולאחר מכן להסיר את המבוגרים, ובכך לבסס תרבות קטנה, מסונכרנת-התפתחותית של 50-150 נמטודות. לאפשר לנמטודות לגדול לבגרות המוקדמת של צלחות פטרי דוגר על 20 מעלות צלזיוס במשך 4-5 ימים. שיטות התרבות אלה מבוססים על נהלים שנקבעו (Stiernagle 2006). 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של ניתוח וידאו, שטוף את צלחת של נמטודות הצעירה המבוגרת עם 1 מיליליטר מי deionized, מזוקקים, ובכך לאסוף 50-150 תולעים מהתרבות המסונכרנת. פתרון חיץ כמו M9 או PBS יכול לשמש גם. השתמש microcentrifuge להסתובב worms לתחתית של תחתית, או לאפשר להם להתיישב על ידי הכח הכביד לכ 15 דקות. הסר את רוב המים מהצינור ולהחליף אותו עם 1 מיליליטר מי deionized, מזוקקים כדי לשטוף את כל חיידקים דבקים מנמטודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נמטודות במים או חיץ לקוורץ קובט באמצעות micropipette. חשוב לעבוד עם מספר קטן, על נמטודות 5-10 בסך הכל בפעם אחת או אפילו פחות, כך שנמטודות אחד בכל פעם עשויות להיות מואר על ידי הליזר. אם מספר נמטודות על צלחות התרבות הוא גדול מדי, לדלל את התולעים במים או חיץ עד צפיפות רצויה הוא הגיע. כמו כן ניתן לאסוף נמטודות הבודדה לטיפה של מים או בולם בצלחת אגרה טריה לשטוף אותם ולהעביר את התולעים בודדים לקובט. במחקר שלנו, בשימוש 1 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ ו 5 גדלי קובט מ&quot;מ כדי לבחון את ההשפעות של מגבלות פיסיות על חי התנהגות. </li></ol> 2. התקנה אופטית לווידאו Analysiשל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע התקנה כפי שמוצגת באיור 1 שמשתמשת ב543 ננומטר (ירוק) הליום ניאון (HeNe) בליזר, שתי מראות קדמי משטח אלומיניום, בעל קובט, מסך הקרנה, ומצלמה במהירות גבוהה (Casio Exilim מהירות הגבוהה) המסוגלים בצילום ב~ 240 תמונות בשניות. שתי המראות משמשות לנווט את קרן הליזר באמצעות קובט. גדלים שונים של cuvettes ניתן להשתמש בהתאם לאופי של המחקר. כדוגמה, השתמשתי cuvettes כי הם 5 מ&quot;מ עבה כדי להראות את ההשפעות של אילוצים המרחביים על תדרים שחייה. קרן הליזר חייבת למלא את הדרישות לoversampling;. כלומר, האורגניזם צריך להפריע לא יותר משליש מקרן הליזר. לג elegans, קרן הליזר צריך להיות על 2 מ&quot;מ בקוטר כאשר הוא מקיים אינטראקציה עם נמטודות. קרן הליזר לא צריכה להיות גדולה יותר מ 5 מ&quot;מ בקוטר מאז הדפוס העקיף יהיה קשה לאתר. המרחק בין האורגניזם לdiffracting המסך צריך להיות הרבה יותר גדול מאשרהאורגניזם עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום parafilm מעל קובט ולהפוך אותו כדי לערבב את נמטודות בעמודת המים. הנח את קובט בבעל קובט כך שתולעים הם בתחילה בחלק העליון של קובט. שימוש במראות, לכוון את קרן הליזר דרך מרכז קובט. בגלל נמטודות צפופה יותר מים, הם נופלים לאט לתחתית קובט, בעוד באותו הזמן חיו בתוך עמודת המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הקרנת המסך, צבע במקום המתאים לקרן הליזר מועבר השחורה כדי לצמצם פיזור כקורה מועבר פוגש מסך הקרנה (איור 2). לחלופין לשים פתיחה במסך הקרנה כדי לאפשר את הקורה מועבר לעבור מסך. ביטול או צמצום פיזור מהקורה מועבר ישמור CCD המערך של מצלמה מלהרוות בשל הקרן המשודרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד את מדד לגודל של התבנית העקיפה, לצייר קוכ 5 סנטימטרים ממסך ההקרנה ליד נקודת קרן הליזר המשודר בלי להתערב בתמונת האור מתפזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט עם המצלמה בעת שהאור בחדר הוא בכך ששורת 5 הסנטימטר היא באותה המד כמו את התמונות העקיפות. כבה את האור בחדר. תמונות שיא התאבכות על המסך עם המצלמה כתולעים עוברים קרן הליזר. </li></ol> 3. הכנת נתוני וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן תוכנת ניתוח וידאו (וגר Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/)</a> במחשב. יבוא הווידאו לתוך תכנית ניתוח וידאו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המקור יעלה בקנה אחד עם כתם הליזר המשודר. הגדר את היקף שימוש בקו 5 סנטימטרים על מסך הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר העקירה הזוויתי של תמונת ההתאבכות נוצרת על ידי כל נמטודות באמצעות תוכנת ניתוח וידאו (איור 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למצוא את angulaעקירת r על ידי לקיחת arctan (y / x), להעתיק ולהדביק נתונים לגיליון אלקטרוני (Excel) ולהוסיף 180 מעלות או π לכל הזוויות השליליות לייצר גרף רציף (Figure. 4). </li></ol> 4. רכישת נתוני זמן אמת לתצפית מיידית של תדרים שחייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אותה ההגדרה כלניתוח וידאו, הנח photodiode (DET10A מThorLabs) עם שטח קטן (~ מ&quot;מ 1 2) מחוץ למרכז בתבנית העקיפה ממש מול מסך הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר photodiode לאוסצילוסקופ הדיגיטלי (PicoScope נעשה על ידי טכנולוגית פיקו) המתחבר למחשב דרך יציאת USB. לבחון את הדפוסים נמרצות על מסך מחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור ערכות נתונים שנרכשו בפורמט ASCII או טקסט. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את הנתונים שנרכשו באמצעות וידאו או photodiode לתכנית לניתוח נתונים מסוגלים גל הולם באמצעות מזעור צ&#39;י מרובע. התכנית ששמשה כאן היא מוצא <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">(http://www.originlab.com/).</a> Fit עקום סינוסי לקבוע תדירות חבטות (איורים 4 ו 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע תדרי שחייה מדגימות שונות וקובעים את השונות. לצורך המחקר, נתונים סטטיסטיים נותחו באמצעות ANOVA-גורם אחד ואחריו במבחן ההשוואות המרובה Bonferroni. P-value של &lt;0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית. </li></ol> 6. דפוסי התאבכות מודל באמצעות Mathematica כדוגמה הערה: דפוסי התאבכות יכולים להיות מודל שימוש בכלים חישוביים רבים ושונים. הליך זה יהיה שונה לכלים שונים כגון Matlab חישוביים, Excel, מוצא וכו &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תמונה: קח תמונות של נמטודות בשקופית מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ מסורתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Binarize תמונה: ייבא &quot;התולעת&quot; דימוי תולעתיn בMathematica ידי גרירת התמונה לתוך Mathematica. המר את התמונה לתמונה בשחור לבן (binarize). זו יכולה להיות מושגת עם הפקודה &#39;Binarize&#39; בMathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [תולעת]. התמונה לאחר מכן ניתן לראות בתמונה בשחור לבן. לחלופין, השתמש בפקודה &#39;EdgeDetect&#39; כדי ליצור BlackandWhiteImage: EdgeDetect [תולעת, 6.0,0.035], שבו שני מספרים עוקבים לשלוט בגסות של הקצוות שהתקבלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונה למטריצה ​​של אפסים ואחדים: זו יכולה להיות מושגת עם הפקודה &#39;ImageData&#39; בMathematica: מטריקס = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתמרה מטריקס: השתמש בפקודה &#39;הפורה&#39; בMathematica להתמרה פורה המטריצה ​​באמצעות FourierParameters המצוין: FTransform = הפורה [מטריקס, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודולוס כיכר של מטריצה ​​כדי לקבל את המטריצה ​​העקיפה ולשפר את ניגוד תמונה: כיכר המוחלטתערך של המטריצה ​​ולהציג התמונה שתתקבל, שהוא הדפוס העקיף המקביל לתמונה המקורית. כמו כן, נעשה שימוש בפונקציה &#39;התחבר&#39; לקנה מידת החדות של התמונה: ImageContrast = תמונה [התחבר [1 + (שרירי בטן [FTransform]) ^ 2] / 0.5]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי גודל תמונה לצפייה קלה: יבול הדפוס העקיף המרכזי ולשנות את הגודל כרצון: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את דפוסי התאבכות הדמיית המחשב עם דפוסי התאבכות המתקבלים מתולעים בחופשיות שחייה. (איור 6) </li></ol>

<ol><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+student%27s+guide+to+Fourier+transforms+with+applications+in+physics+and+engineering%22">A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering</a>. , Cambridge Univ. Press. (1995).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, W. ormB. ook, , (2006).</li>
<li>Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22O.+J.+Biphys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FEnaC+channel+modulates+DAF-16%2FFoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
<li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550(2008).</li>
<li>Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+HE+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).</li>
<li>Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf">http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf</a> (2011).</li>
<li>Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פתחנו גישה חדשנית למדידה בזמן אמת של תנועה והתנהגויות locomotory פשוטות באורגניזמים מיקרוסקופים כמו נמטודות שאינו דורש שימוש במיקרוסקופים. 8 גישה המתודולוגית זה גם יכולה להיות מנוצלת ללימוד אורגניזמים מיקרוסקופים רבים כמו הפרוטיסטים. שיטה זו מוגבלת רק על ידי אורך הגל של אור המשמש. האורגניזם לא צריך להיות קטן יותר מאורך הגל של האור. בנוסף לחיסכון והניידות של כל הציוד הדרוש, יתרון מרכזי אחד של גישה זו היא היכולת למדוד התנהגות בזמן אמת ובשלושה ממדים, ללא אילוצים הצרים של מטוסי תמונה תחת המיקרוסקופ. אפשר גם עם טכניקה זו כדי לבחון את ההשפעות של כוח משיכה או תנאים רבים אחרים בהתנהגות שלא ניתן ללמוד באמצעות גישות המיקרוסקופ מבוססים. 9 לפיכך, אנו יכולים להגיע להבנה טובה יותר של מיקרואורגניזם הטבעי locomotory Behaviors המשוחרר מגבולות שקופיות מיקרוסקופ טיפין או בתאי microfluidic מיוחדים (הפרק et al, 2008). 10 חוסר המידע בשלב דפוס עקיף אינו מאפשר שהליפה הישירה של התמונה המקבילה לאובייקט diffracting מאז הדפוס העקיף השדה רחוק הוא פרופורציונלי לריבוע הערך המוחלט של ההתמרה. לכן אנחנו חישוב דפוסי התאבכות מתמונות תולעת, כך שהם יכולים להיות מתאימים עם את דפוסי ההתאבכות של נמטודות חופשיות חייה (איור 6). שיטה זו הניבה תוצאות עבור באמת שוחה בחופשיות ג elegans ויכול להיות מיושם על כל מין מיקרוסקופי שתמרונים בסביבה שקופה אופטית כמו מים או פתרונות רבים יוניים שונים. מיקרוסקופים קונבנציונליים רק לאפשר לימודים עם עומק מוקד על סדר מיקרומטרים. 11 זאת בשל מוגבלעומק השדה כאשר התמקדות אור: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> שם מספר F N יש יחסי גומלין עם המעגל של בלבול (ג) כך שאורך מוקד קצר קשור בג גדול. 12,13 אמנם השיטה העקיפה הזה היא בהחלט לא תחליף למיקרוסקופיה הקונבנציונלית, הוא מסוגל כדי לספק תוצאות כמותיות במהירות, כך שמינים יכולים אפילו לטפל בזמן אמת בעלות נמוכה. את דפוסי ההתאבכות ניתן לקבל עם כל מצביע ליזר. את דפוסי ההתאבכות ניתן צולם ברזולוציה של זמן מופחתת שימוש במצלמה דיגיטלית רגילה. בזמן שהמשתמש לא יכול להיות מיקרוסקופ או photodiode זמין, חלקים מרכזיים של ניסוי זה כגון מדידת תדרי חבטות והערכת דפוסי התאבכות יכולים להסתיים בעלות הנמוכה ביותר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> 543 ננומטר HeNe ליזר </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> כל ליזר בטווח הנראה לעין עם פחות מ 5 mW ניתן להשתמש. </td></tr><tr><td> 2 מראות אלומיניום משטח קדמיות </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמת Exilim מהירות גבוהה </td><td> קאסיו </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קוורץ קובט </td><td> תאי Starna </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (תוכנה) </td><td> רניה </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> וולפרם </td><td></td><tד&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

קרקע ואורגניזמים מיקרוסקופים חיים במים לחיות ולהתנהג בסביבה מורכבת בתלת ממד. רוב המחקרים של התנהגות אורגניזם מיקרוסקופית, בניגוד לכך, נערכו תוך שימוש בגישות המיקרוסקופ מבוסס, אשר מגבילות את התנועה והתנהגות לשדה צר, כמעט דו ממדי מוקד. 1 אנו מציגים גישה אנליטית רומן המספקת ניתוח בזמן אמת של חופשיות חי ג elegans בקובט ללא תלות בציוד המיקרוסקופ מבוסס. גישה זו כוללת מעקב המחזוריות הזמנית של דפוסי התאבכות נוצרים על ידי הפניית אור ליזר דרך קובט. אנו מודדים את תדרי תנודה לנמטודות חופשיות שחייה. ניתוח של דפוסי התאבכות השדה רחוק מגלה רמזים על הגל של נמטודות. עקיפה היא התהליך של כיפוף אור מסביב לאובייקט. במקרה זה הוא אור מתפזר על ידי אורגניזמים. גלי האור מפריעים ויכולים ליצור מודעהדפוס iffraction. שדה רחוק, או Fraunhofer, דפוס עקיף נוצר אם מרחק מסך לאובייקט הוא הרבה יותר גדול מאובייקט diffracting. במקרה זה, הדפוס העקיף ניתן לחשב (הדמיית מחשב) באמצעות התמרה פורה. 2 סי אלגנס הן נמטודות קרקע המתגוררת בבני חיות שמנווטות בשלושה ממדים. הם עוברים גם על מטריצה ​​מוצקה כמו אדמה או אגר בדפוס locomotory סינוסי נקרא זחילה ובנוזל בדפוס שונה נקרא שחייה. 3 התפקידים שמלאו מידע חושי המסופק על ידי mechanosensory, chemosensory, ותאי thermosensory ששולטים שינויים פלסטיים בlocomotory דפוסים ומתגים בדפוסים רק מתחילים הובהרו. 4 אנו מתארים גישה אופטית למדידת תנועת נמטודות בשלושה ממדים שאינו דורשים מיקרוסקופ וייאפשרו לנו להתחיל לחקור את המורכבות של תנועת נמטודות תחת שיתוף שונהnditions.

<html> כדוגמה, למדו ג elegans ב1 סנטימטר קוורץ קובט רחב, 5 מ&quot;מ ועובי 4 הסנטימטר קובט הגבוה. דגימת תולעת אחת באמצעות ניתוח וידאו, תדר החייה הממוצעת המתקבל מניתוח וידאו בקובט עבה 5 מ&quot;מ הוא כ -2.5 הרץ (איור 4). כמו כן, דגימת תולעת אחת בשיטת רכישת נתונים בזמן האמת, תקבלו תדירות שחייה של כ -2.7 הרץ (איור 5), באמצעות אוסצילוסקופ הדיגיטלי (PicoScope). הליך זה ניתן לחזור לתולעים רבים. מחקר מפורט של תולעי חופשיות חייה חשף תדירות חייה ממוצעת של 2.37 הרץ בקובט 5 מ&quot;מ. 6, כצפוי, את תדירות שהחייה גבוהה יותר מזה של תולעת זוחלת (~ 0.8 הרץ). 3 השימוש בשיטה עקיפה זו, תדרי שחייה ממוצע של ג elegans, שמוגבל לשקופית מיקרוסקופ, כבר מצא כדי להתאים את הערך שפורסם בעבר של 2 הרץ. 1,7 ve_content &quot;&gt; הנהלים הבאים 3.) ולאחר מכן 6.) מאפשר לדוגמנות של שחי דפוסי התאבכות בעזרת תמונות תולעת שהושגו עם מיקרוסקופ קונבנציונלי. את דפוסי התאבכות הדגם משמשים כדי לדמות מחזור שחייה של סי אלגנס ( איור 6). מודל מוצלח מורכב מדפוסי חייה רצופים אפשריים פיזי התואמים את תדרי שהחייה. התולעת צריכה להיות באותה הצורה בסוף מחזור חייה כפי שהיה בתחילתו של מעגל לשחות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> איור 1. ירוק HeNe ליזר נעשה שימוש כדי ליצור תבנית עקיפה דינמית באמצעות חי ג elegans. דפוס עקיף זה צולם ב240 תמונות בשניות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> איור 2. DRA<html> כנף נקודה שחורה מגבירה את הספיגה של הקרן המשודרת. רוויה של המצלמה בגלל אור מפוזר מצטמצמת והתבנית העקיפה הופכת לגלויה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> איור 3. צילום מסך של תוכנת ניתוח וידאו (וגר Pro) עם תבנית עקיפת תולעת שהוא במעקב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> איור 4. נתוני וידאו מתאימים למעגל השחייה של נמטודות בקובט 5 מ&quot;מ. נכון העקומה חושפת תדירות חייה של ~ 2.5 הרץ. &quot;/&gt; איור 5. נתונים בזמן אמת מתאים למעגל השחייה של נמטודות בקובט 5 מ&quot;מ. נכון העקומה חושפת תדירות חייה של ~ 2.7 הרץ. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> איור 6. השורה העליונה מייצג את דפוסי התאבכות בפועל ומותאמת לדפוסי התאבכות המודל בשורה התחתונה. את דפוסי התאבכות הדגם הופקו באמצעות תולעים בשקופית מיקרוסקופ (שורה אמצעית).

אורגניזמים מיקרוסקופים כמו נמטודות שוחים החופשיים<em&gt; ג elegans</em&gt;, לחיות ולהתנהג בסביבה מורכבת בתלת ממד. אנו מדווחים על גישה חדשנית המספקת ניתוח של<em&gt; ג elegans</em&gt; באמצעות דפוסי התאבכות. גישה זו כוללת מעקב המחזוריות הזמנית של דפוסי התאבכות נוצרים על ידי הפניית אור ליזר דרך קובט.

מיקרואורגניזמים בקרקע ובמים חיים ומתנהגים בסביבה תלת-ממדית מורכבת. מרבית המחקרים על התנהגותם של מיקרואורגניזמים, ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד תדרי רעד (thrashing frequencies) של אורגניזמים מיקרוסקופיים השוחים בחופשיות. זאת על ידי הכנה ראשונית של דגימת תולעים מיקרוסקופיות, ולאחר מכן, הכנת המערך האופטי.לאחר מכן, נרשמת תבנית העקיפה שנוצרה על ידי האורגניזמים החיים. לבסוף, הנתונים הרשומים מנותחים כדי לקבוע את תדרי השחייה. בסופו של דבר, ניתוח העקיפה משמש להצגת שינויים בדפוסי התנועה של תולעים שאינן מוגבלות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה מסורתית, הוא שניתן לצפות בדפוסי שחייה בעוד המין נע בחופשיות במרחב תלת-ממדי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שחייה חופשית של C. elegans, ניתן להחיל אותה גם על אורגניזמים שקופים, קטנים ומיקרוסקופיים אחרים החשופים לתנאים משתנים. כדי להכין C. elegans לניתוח וידאו, התחילו בשימוש בפינצטה של חוט פלטינה שטוח להעברת 10 עד 20 נמטודות בוגרות ל-NGM טרי.צלחות פטרי מלאות באגר המכילות נקודות מעגליות קטנות של e coli. אפשרו לנמטודות להטיל ביצים במשך שלוש עד חמש שעות, ולאחר מכן הסירו את הפרטים הבוגרים. כך תוכסו תרבית קטנה ומסונכרנת התפתחותית של 50 עד 150 נמטודות; כדי לגדל את הנמטודות לשלב הבגרות המוקדמת, דגרו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 20 °C למשך ארבעה עד חמישה ימים.ביום ניתוח הווידאו, השתמשו במיליליטר אחד של מים מזוקקים דה-יוניזים כדי לשטוף צלחת של נמטודות בוגרות צעירות, ובכך אספו 50 עד 150 תולעים מהתרבית הסנכרונית. השתמשו במיקרו-צנטריפוגה כדי לסובב את התולעים לתחתית המבחנה או אפשרו להן לשקוע בכוח המשיכה למשך כ-15 דקות. הסירו את מרבית המים מהמבחנה והחליפו אותם במיליליטר אחד של מים מזוקקים דה-יוניזים כדי לשטוף חיידקים הדבקים לנמטודות.בעזרת מיקרופיפטה, העבירו חמישה עד 10 נמטודות במים לתוך ויתה (vete) קוורץ. הרכיבו את מערך האופטיקה כפי שמוצג כאן, תוך שימוש בלייזר הליום-ניאון ב-543 nanometer, שתי מראות אלומיניום בעלות פני שטח קדמיים להכוונת קרן הלייזר דרך הויתה, מחזיק ויתה, מסך הקרנה ומצלמה במהירות גבוהה המסוגלת לצלם בכ-240 frames per second. לאחר מכן, השתמשו בחתיכת פאראפילם כדי לכסות את חלקו העליון של הויתה והפכו אותה כדי לערבב את הנמטודות בעמוד המים.הניחו את ה-vete במחזיק vete כך שהתולעים יהיו בתחילה קרוב לראש ה-vete. בעזרת המראות, כוונו את קרן הלייזר כך שתעבור במרכז ה-vete. מכיוון שהנמטודות דחוסות יותר ממים, הן ינפלו לאט לתחתית ה-vete תוך כדי שחייה בעמוד המים; על מסך ההקרנה, צבעו בשחור את הנקודה המתאימה לקרן הלייזר המועברת כדי להפחית את הפיזור כאשר הקרן המועברת פוגעת במסך ההקרנה.ביטול או הפחתה של פיזור מהקרן המועברת ימנעו מהמערך של ה-CCD במצלמה להגיע לרוויה עקב הקרן המועברת. כדי להשיג מדד לגודלו של תבנית העקיפה, שרטטו קו באורך של כחמישה סנטימטרים על מסך ההקרנה לצד נקודת קרן הלייזר המועברת, באופן שלא יפריע לתמונת האור העקיף. כבו את תאורת החדר והקליטו תמונות עקיפה על המסך בעוד התולעים עוברות דרך קרן הלייזר.כדי להכין את נתוני הווידאו, התקינו את תוכנת ניתוח הווידאו הבאה וייבאו את הסרטון לתוכה. הגדירו את נקודת הראשית כך שתחפף את נקודת הלייזר המועברת באמצעות התוכנה. עקבו אחר ההעתק הזוויתי של תמונת העקיפה שנוצרה על ידי כל נמטודה.העתיקו והדביקו את הנתונים לגיליון אלקטרוני והוסיפו 180 מעלות או PI לכל הזוויות השליליות, כדי להפיק גרף רציף. באמצעות מערך ניתוח הווידאו, מקמו פוטודיודה בעלת שטח קטן מחוץ למרכז תבנית העקיפה, ישירות מול מסך ההקרנה, באמצעות יציאת USB.חברו את הפוטודיודה לאוסצילוסקופ הדיגיטלי המחובר למחשב. צפו בדפוסי ההסתה על מסך המחשב. שמרו את מערכי הנתונים בפורמט ASCI או בפורמט טקסט כדי לנתח את הנתונים.השתמשו בווידאו או בתמונה כדי לייבא את הנתונים לתוכנה לניתוח נתונים המסוגלת לבצע התאמה של צורמות גל. השתמשו במינימיזציה של ריבועים פחותים כדי להתאים עקומה סינוסואידלית לצורך קביעת תדירות הרעידה. חשבו את הממוצע של תדירויות השחייה מדגימות שונות, וקבעו את השונות.במחקר זה נותחו הנתונים סטטיסטית באמצעות ניתוח סבסטיות במימד אחד (single factor ANOVA), ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Bonferroni. ערך P נמוך מ-0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית עבור דפוסי העקיפה של המודל. התחל בשימוש במיקרוסקופ לצילום תמונות כדי להפיק תמונה.גררו את התמונה לתוך Mathematica. השתמשו בפקודה binary eyes כדי להמירה לשחור ולבן. לחלופין, השתמשו בפקודה edge detect כדי ליצור תמונה בשחור ולבן, כאשר שני המספרים העוקבים שולטים במידת הגסות של הקווים שיתקבלו.לאחר מכן, באמצעות הפקודה image data, המיר את התמונה למטריצה של אפסים ואחדים. השתמש בפקודת forer כדי לבצע טרנספורמציה למטריצה, לאחר מכן העלה בריבוע את הערך המוחלט של המטריצה והצג את התמונה שהתקבלה, שהיא תבנית העקיפה המתאימה לתמונה המקורית. בנוסף, השתמש בפונקציית log כדי לכייל את הניגודיות של התמונה.לבסוף, השוו את תבניות העקיפה של המודל לתבניות העקיפה שהתקבלו מתולעים השוחות בחופשיות. בדוגמה זו, נחקרו *C. elegans* בתוך תא קוורץ (Q-vet), ברוחב של סנטימטר אחד, בעובי של חמישה מילימטרים ובגובה של ארבעה סנטימטרים. דגימת תולעת בודדת באמצעות ניתוח וידאו.תדירות השחייה הממוצעת שהתקבלה מניתוח וידאו בתעלה בעובי חמישה מילימטרים הייתה כ-2.5 hertz. באופן דומה, דגימה של תולעת בודדת באמצעות שיטת רכישת נתונים בזמן אמת ואוסצילוסקופ דיגיטלי הניבה תדירות שחייה של כ-2.7 hertz. ניתן לחזור על הליך זה עבור תולעות רבות.מחקר מפורט של תולעים השוחות בחופשיות חשף תדירות שחייה ממוצעת של 2.37 hertz בתוך vete של חמישה מילימטרים. כצפוי, תדירות השחייה גבוהה מזו של תולעה זוחלת. באמצעות שיטת עקיפה זו, נמצא כי תדירויות השחייה הממוצעות של sea elegance, המוגבלת למסגרת של תוכנית מיקרוסקופ, תואמות את הערך שפורסם בעבר של שני hertz.בעקבות הסרטון. הכנה של נתונים ומידול של תבניות עקיפה כפי שהודגמו בסרטון זה, מאפשרים מידול של תבניות עקיפה בזמן שחייה. בעזרת תמונות של תולעים שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי, נעשה שימוש בתבניות העקיפה הממודלות כדי לסמל מחזור שחייה של ה-sea elegance.מודל מוצלח מורכב מהצלחה פיזית הפיכה של דפוסי שחייה, התואמים את תדרי השחייה. התולעת צריכה להיות באותה צורה בסוף מחזור השחייה כפי שהייתה בתחילתו. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בפחות מדקה עבור כל תולעת באמצעות הדיאטה הצילומית המהירה, תוך צפייה במחזורי השחייה על מסך המחשב.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להעריך נמטודות השוחות באופן חופשי.

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ייצור של ערוצי microfluidic ויישומן ניסויים לחקר התנהגות ליקוט chemotactic של חיידקים ימיים בתוך נוף ים מזין אחידה והתנהגות שחייה של חיידקים בתוך זרם גזירה מתוארים.

תגובת Chemotactic של מיקרו אורגניזמים ימיים כדי Micro-Scale שכבות מזין

מקור: שיידוויילר, ד., ואחרים. שילוב מכשירים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה לחקר הובלה מיקרוביאלית במדיה נקבובית בקנה מידה מרחבי. J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לכימות תנועתיות חיידקית באמצעות מטריצה נקבובית המורכבת מעמודים מסודרים באקראי. חיידקים מסומנים פלואורסצנטית מוכנסים למכשיר, מצולמים במיקרוסקופיה כשהם נעים דרך המטריצה הנקבובית אל ערוץ התצפית, ומנותחים ליצירת עקומת פריצת דרך (BTC).

הערכת תנועתיות חיידקית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה...

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

הטכניקה המוצגת כאן מודדת את דרכו של שחייה באופן חופשי מינים מיקרוסקופיים באמצעות חשיפת אורך גל יחידה. ג elegans משמשים כדי להדגים הדמיה צל כחלופה זולה למיקרוסקופים יקרים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי להתאים את אוריינטציות, סביבות ומינים שונות כדי למדוד את הכיוון, מהירות, תאוצה וכוחות.

אחת אורך גל צל הדמיה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; נידות כולל כוח אומדנים

מוצגת שיטה להכנת קולואידים פעילים קטליטית של ג'אנוס שיכולים "לשחות" בנוזלים ולקבוע את מסלולם התלת-ממדי.

מעקב הכנה 3D של התקנים שחייה קטליטי

כתב יד זה מתאר כיצד להבחין בין נמטודות שונים באמצעות שדה רחוק עקיפה חתימות. אנו משווים את ומכניקה של 139 108 "רולר" C. elegans וסוג הפרוע מאת ממוצע של תדרים המשוייך לחתימה עקיפה פראונהופר טמפורלית במקום אחד באמצעות לייזר מתמשך wave.

מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans

3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

פרוטוקול לדור של נופים כימיים דינמיים על ידי פוטוליזה בתוך microfluidic והגדרות מיליפלואידיג מוצג. מתודולוגיה זו מתאימה לחקר תהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל התנהגות נעים, ספיגת מזינים, או הסתגלות לכימיקלים של מיקרואורגניזמים, הן בתא יחיד ברמת האוכלוסייה.

יצירת מבוקרת, נופים כימיים דינמי ללמוד התנהגות מיקרוביאלית

כאן, אנו מתארים את השימוש בלוחות הדרגתיים ממריצים כדי להעריך את תנועתיות נחיל החיידקים ובו זמנית להשיג תגובות ריכוז מרובות.

כימות תנועתיות נחיל משטח חיידקי על לוחות הדרגתיים ממריץ

הליך זה מתאר כיצד לדמיין, לעקוב ולכמת Acanthamoeba spp. תנועתיות.

כימות של Acanthamoeba spp. תנועתיות

מחקר זה בוחן את השפעת הגיל על התנועה ב-C. elegans על ידי מדידת מעריך ליאפונוב הגדול ביותר (LLE). ככל שהם מתבגרים, C. elegans מראים עלייה וירידה בשליטה המוטורית. התוצאות מראות שיא LLE לאחר חמישה ימים, ואחריו ירידה ככל שהתולעים מזדקנות.

דינמיקה תלוית גיל של תנועה ב- Caenorhabditis elegans: ניתוח מעריך ליאפונוב

למד שיטת נידות כמותית של C. elegans בשחייה חופשית באמצעות ליזר עקיף. טכניקה זו מאפשרת מעקב תלת-ממדי בזמן אמת של תנועת הנמטודות ומספקת כלי יקר ערך לחקר התנהגות שחייה במיקרו-אורגניזמים שקופים.

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

גלה סרטונים נוספים