יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)
13 בספטמבר 2012
את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג טרנספקציה ספציפית לאתר בתאים נצמדים. דבר זה מושג על ידי גידול של שכבה אחת של תאים על מערך מיקרו-אלקטרודות. כשלב שני, הפעלת פולס חשמלי על אלקטרודות נבחרות מובילה לאלקטרופורציה של התאים המותחמים הנצמדים מעל האלקטרודות.
דבר זה מוביל ליצירת נקבים בממברנת התא המאפשרים כניסה של מולקולות אקסוגניות לתא. ניתן לאחר מכן לסנן את התאים המטרה כדי לזהות את הפנוטיפ שנוצר באמצעות בדיקה מתאימה. לטכניקת הטרנספקציה במיקרו-קנה מידה שתיארנו כאן יש מספר יתרונות מרכזיים על פני טכניקות טרנספקציה קונבנציונליות, כגון אלקטרופורציה של תרחיפים גדולים או טרנספקציה כימית.
א, הדבר מאפשר לנו להשיג בקרה מרחבית מדויקת על תהליך הטרנספקציה עצמו ומסייע לנו לבצע טרנספקציה לתאים בודדים או למקבצי תאים ביעילות גבוהה, גם בשורות תאים שקשה לבצע להן טרנספקציה. ב, זוהי גישה הניתנת להרחבה בקלות ומסייעת לנו לממש בדיקות מולקולריות בתפוקה גבוהה. אחד היתרונות המרכזיים בשימוש במערך מיקרו-אלקטרודות לטרנספקציה ספציפית לאתר הוא שהדבר מאפשר הערכה פונקציונלית סימולטנית של התאים המיועדים, כגון אלקטרופיזיולוגיה כמותית ושינויים מורפולוגיים.
כדי להתחיל את הפרוצדורה, עקרו את ה-MEA באוטוקלאב, לאחר מכן העבירו את ה-MEA שעקר באוטוקלאב למCב מזרם למינרי, והניחו אותו בצלחת פטרי סטנדרטית סטרילית מפוליסטירן. לפני זריעת התאים על ה-MEA, עקרו את תא המזרם הלמינרי על ידי הדלקת אור UV למשך 20 דקות. אם ה-MEA רגיש לאור UV, כסו את צלחת הפטרי המכילה את ה-MEA בנייר אלומיניום סטרילי בזמן שתא המזרם נמצא תחת קרינת UV. לאחר מכן, טפלו את פני השטח של ה-MEA ב-10 µg/mL של פיברונקטין למשך שעה עד שעתיים עבור תאי helo.
בצעו שטיפה עם DI water והניחו ל-MEA להתייבש באוויר בתוך מנדף זרימה למינרית. לאחר מכן, אספו תאים משורת תאים רצה של תאי יונקים נצמדים באמצעות trypsin ETTA והעלו אותם לריכוז של 100 עד 200 תאים למיקרוליטר במיליליטר אחד של מצע גידול תאים לצורך זריעה. לאחר מכן, הניחו טיפה של 20 עד 30 מיקרוליטר של מצע עם תאים על ה-MEA.
וודאו שגודלו מספיק כדי לכסות את כל האלקטרודות ב-MEA. לאחר מכן, העבירו את צלחת הפטרי עם ה-MEA לאנקובטור לח עם 37 °C ו-5% carbon dioxide. למשך שעתיים עד ארבע שעות.
לאחר זריעת התאים, העבירו את צלחת הפטרי עם ה-MEA מהאינקובטור למכסה הזרימה הלמינרית. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 400 עד 500 µL של מצע שחומם מראש ל-37 °C לבאר ה-MEA, ולאחר מכן בדקו תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים עדיין צמודים ומפוזרים באופן אחיד על פני השטח של ה-MEA. לאחר מכן, העבירו את ה-MEA בחזרה לאינקובטור. שמונה עד 12 שעות לאחר זריעת התאים, בצעו שטיפה אחת עד שתיים עם PBS כדי להסיר תאים מתים.
בניסוי טיפוסי, התאים בדרך כלל מוכנים לטרנספקציה 24 עד 48 שעות לאחר ההזרעה. כדי לשמור על עקביות ביעילות האלקטרופורציה, מומלץ להמתין עד שהתרבית תהיה קרובה לקונפלואנציה לפני ביצוע האלקטרופורציה. כדי להשיג טרנספקציית sarna יעילה ביותר, יש לקבוע תחילה את פרמטרי פולס המתח האופטימליים לאלקטרופורציה עבור MEA נתון.
כאן אנו מתארים רצף של שלבים ניסיוניים הכוללים שימוש ב-propidium iodide כדי לקבוע את פרמטרי האלקטרופורציה האופטימליים לפני ביצוע האלקטרופורציה. הכינו תמיסה של 300 עד 500 µL של 30 µg/mL PI בבופר אלקטרופורציה קר (בקרח), ו-400 µL של תמיסת calcium AM בריכוז 4 µM ב-PBS. לאחר מכן, העבירו את ה-MEA מהאינקובטור למנדף זרימה למינרית.
הסר את מצע התרבית מה-MEA ובצע שטיפה עם PBS. לאחר מכן, הוסף 300 עד 500 µL של בופר אלקטרופורציה קר מהקרח עם pi. לאחר מכן, הנח ספייסר בגובה של 1 mm ב-MEA.
חשוב מאוד להבטיח שזה לא יגע בתאים במרכז ה-MEA. לאחר מכן, חברו את ה-MEA למקשר החשמלי ובחרו את האלקטרודות הרצויות לאלקטרופורציה. לאחר מכן, החילו את הפולסים החשמליים עם אמפליטודת הפולס ומשך הזמן הרצויים על האלקטרודות שהוגדרו לשלב האלקטרופורציה.
הורד את הקתודת הפלדה המכוסה בנייר אלומיניום אל תוך באר ה-MEA עד למגע עם הספייסר בעובי מילימטר אחד. מיד לאחר מכן, החל בהפעלת פולסים חשמליים על האלקטרודות המיועדות. לאחר מכן, חזור על הפעולה עם סט אלקטרודות שונה, בהתאם לתכנון הניסוי.
בניסויים שערכנו עם תאי helo, הבחנו כי פולס מתח בודד בעוצמה של 3 V עד 9 V ובמשך של 1 ms עד 10 ms, עבור אלקטרודה בגודל של 100 µm, הוביל לאלקטרופורציה מוצלחת עם מוות תאי מינימלי. מיד לאחר יישום פולסי המתח, העבירו את ה-MEA לאינקובטור למשך חמש דקות.
לאחר תקופת דגירה של חמש עד 10 דקות, הסר בעדינות את המרווח מה-MEA. לאחר מכן, הסר 75% מתוספת האלקטרופורציה מבאר ה-MEA והחלף אותה במצע תרבית תאים חם. לאחר מכן, העבר את ה-MEA בחזרה לאנקובטור.
לאחר תקופת דגירה של שעתיים עד ארבע שעות, החליפו את מצע התאים בבאר ה-MEA ב-300 עד 500 µL של תמיסת calcium AM בריכוז 4 µM ב-PBS. העבירו את ה-MEA בחזרה לאנקובטור למשך 30 דקות נוספות לאחר דגירת התאים עם calcium AM. החליפו את ה-calcium AM בבאר ב-PBS לאחר שלב שטיפה, ולאחר מכן השגיחו תמונות פלואורסצנטיות של התאים באמצעות מיקרוסקופ אופטי עם פילטרים עבור pi.
ספיגת PI עקב אלקטרופורציה גורמת לתאים לזהור באדום, ו-calcium am גורם לתאים החיים לזהור בירוק. ניתן להעריך את חיוניות התאים עבור כל אלקטרודה באמצעות משוואה זו, ואת יעילות האלקטרופורציה עבור כל אלקטרודה באמצעות משוואה זו. ברגע שנקבעים פרמטרי האלקטרופורציה האופטימליים, ניתן להשתמש בהם למסירה ספציפית לאתר של מולקולת a, והליך האלקטרופורציה עבור מולקולות siRNA זהה להליך האלקטרופורציה עבור pi.
מוצג כאן הובלה ספציפית לאתר של propidium iodide בתאי helo על אלקטרודה של 200 micrometer. בדיקת החיות המבוססת על סידן בוצעה שעתיים לאחר האלקטרופורציה. תאים חיים מסומנים כאן בפוטיסנציה ירוקה, והפוטיסנציה האדומה כאן מדגימה את הספיגה של pi על ידי תאים שעל האלקטרודה.
להלן התמונה המורכבת. תאים אלה עברו אלקטרופורציה והם חיים, בעוד שתאים אלה מתים. איור זה מראה טרנספקציה של siRNA מסומן בתאי rumine על אלקטרודה בקוטר 200 µm, ואיור זה מראה טרנספקציה של תאי hela עם siRNA מסומן ב-Alexa 488 על אלקטרודה בקוטר 100 µm.
החצים הלבנים מצביעים על התאים שעברו טרנספקציה עם irna, בעוד שהחצים השחורים מצביעים על תאים מתים. ניתן להרחיב את הטכניקה שהדגמנו כאן לקווי תאים שונים, כולל קווי תאים ראשוניים שקשה לבצע בהם טרנספקציה, ולהשתמש בה לטרנספקציה של מולקולות גדולות יותר כגון פלסמידים וחלבונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להשגת טרנספקציה ספציפית לאתר בתאי יונקים נצמדים באמצעות מערך מיקרו-אלקטרודות (MEA). השיטה כוללת אלקטרופורציה כדי להקל על כניסתם של מולקולות אקסוגניות לתאים המיועדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- טרנספקציה ספציפית לאתר היא חיונית להחדרה ממוקדת של גנים.
- מערכי מיקרו-אלקטרודות מאפשרים בקרה מדויקת על תהליך האלקטרופורציה.
- שיטות טרנספקציה קונבנציונליות עלולות להיות חסרות ספציפיות.
- טכניקה זו משפרת את היעילות של החדרת siRNA לתאים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לטרנספקציה ספציפית לאתר.
- שיפור הולכת siRNA לתאים דבקים.
- הערכת השינויים הפנוטיפיים הנובעים מכך בתאים המטרה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של שכבה אחת (monolayer) של תאים נצמדים על מערך מיקרו-אלקטרודות.
- הפעלת פולסים חשמליים על אלקטרודות נבחרות לצורך אלקטרופורציה.
- יצירת נקבים בממברנת התא כדי להקל על כניסת מולקולות.
- סריקת תאים לשינויים פנוטיפיים באמצעות בדיקות (assays) מתאימות.
תוצאות עיקריות
- טרנספקציה מוצלחת באתר ספציפי של תאים מטרתים.
- ספיגה מוגברת של siRNA בהשוואה לשיטות קונבנציונליות.
- יכולת מוכחת לסריקת פנוטיפים נגזרים.
- הדגשת היתרונות של טכניקות טרנספקציה בקנה מידה מיקרוסקופי.
מסקנות
- השיטה המתוארת מציעה גישה מדויקת להחדרת גנים.
- היא מספקת יתרונות משמעותיים על פני טכניקות טרנספקציה מסורתיות.
- ניתן ליישם טכניקה זו בתחומי מחקר שונים בביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טרנספקציה ספציפית לאתר באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות פותרת צוואר בקבוק קריטי בגנומיקה פונקציונלית ובתיקוף מטרות, על ידי מתן שליטה מרחבית מדויקת על הובלת siRNA באוכלוסיות תאים נצמדים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הפחתת השפעות חוץ-מטרה ושיפור השחזוריות של הבדיקה, ובכך תומכת ישירות בהפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות. התאימות של השיטה לתהליכי עבודה בעוצמה גבוהה ולסוגים שונים של תאי שורש ממצבת אותה כיכולת ניתנת להרחבה לזיהוי מובילים ולאישור מטרות פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הובלה ממוקדת מרחבית של siRNA, ובכך מבהיר את תפקוד הגן בהקשרים תאיים ספציפיים.
- ערך תפעולי: מפחית רעש ביולוגי על ידי טרנספקציה של תאים מטרות בלבד, ובכך משפר את יחס האות לרעש במבחני סריקה פנוטיפיים.
- ערך ניבוי: תומך בהורדת סיכונים של מטרות טיפוליות על ידי קישור השתקה גנטית מקומית לפנוטיפים תאיים נצפים, מה שמחזק את ההסקה הסיבתיות בתיקוף של מסלולים ביולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של יעילות טרנספקציה הספציפיים לאלקטרודה, מה שמאפשר השוואה סטנדרטית בין תנאים ניסיוניים שונים.
- ערך תפעולי: מאפשר ביצוע ניסויים מרובי-דגימות (multiplexed) בתרבית אחת, ובכך מפחית שונות בין בארות ומגביר את התפוקה עבור סריקות של ספריות siRNA.
- מוכנות הבדיקה: מפיק תוצאות בינאריות של חי/מת באמצעות propidium iodide ו-calcium AM, התומכות בדירוג אוטומטי מבוסס-תמונה של חיוניות ויעילות טרנספקציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת הערכה פונקציונלית של תאים שעברו טרנספקציה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה או מורפולוגיה משולבות, ובכך מגשרת בין התערבות מולקולרית לתוצאה פנוטיפית.
- מידול פרה-קליני: תומכת במערכות רלוונטיות למחלה על ידי מתן siRNA ספציפי לאתרים בתאי היצמדות ראשוניים או תאים שקשה לבצע בהם טרנספקציה, ובכך משפרת את נאמנות המודל.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת מדדי טרנספקציה הניתנים לשחזור, המשמשים לקבלת החלטות של go/no-go בתהליכי תיקוף מטרות (target validation).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), כאשר נדרשת הפרעה מולקולרית מדויקת להפחתת הסיכונים במנגנונים ביולוגיים לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בתיקוף מטרות מונחה-השערה על ידי מתן siRNA מבוקר לבחינת תפקוד גנים במודלים של תאים נצמדים.
- סריקה: מספק טרנספקציה הניתנת לשחזור ומוכנה לבדיקה עם יעילות מדידה, מה שמאפשר סריקה אמינה של תרכובות או הפרעות גנטיות.
- אנליטיקה: מספק מדדי טרנספקציה וחיוניות ספציפיים לאלקטרודה, ובכך מקל על השוואה מונחית-נתונים של יעילות siRNA בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הפרעה מולקולרית לבין תוצאות תפקודיות (למשל, אלקטרופיזיולוגיה), ובכך תומך בעיגון פנוטיפי במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להעברה ספציפית של חומצות גרעין לאתרים מסוימים במגוון פרויקטים וקווי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות הובלת siRNA בעלת יעילות גבוהה ובשליטה מרחבית, עם מינימום השפעות חוץ-מטרה (off-target).
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרמטרי אלקטרופורציה סטנדרטיים וריבוי אלקטרודות (multiplexing).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת מספר הניסויים שנכשלו עקב טרנספקציה לקויה או שונות ביולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון, המבוסס על תגובות פנוטיפיות שחזירות להשתקה גנטית (gene knockdown) ספציפית לאתר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, בעקרונות האלקטרופורציה ובבדיקות חיות מבוססות פלואורסצנציה.
- תלוי בגישה למערכי מיקרו-אלקטרודות (microelectrode arrays), גנרטורים של פולסים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם סטים של מסננים מתאימים.
- מחייב סטנדרטיזציה של בחירת האלקטרודות, פרמטרי הפולס ותנאי הבאפר בין משתמשים וניסויים שונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור תכונות היצמדות של קווי תאים שונים ותנאי ציפוי אופטימליים של פיברונקטין.
- מוגבל בשל הצורך באופטימיזציה אמפירית של המתח ומשך הפולס עבור כל MEA וסוג תא, כדי לאזן בין יעילות הטרנספקציה לבין חיות התאים.
