Name: יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למד שיטת שתל גנטי ספציפי לאתר בתאים מדבקים באמצעות מערכי מיקרואלקטרודות. הטכניקה משתמשת באלקטרופורציה להכנסת siRNA לתאים ממוקדים ומאפשרת בקרה מרחבית מדויקת על התהליך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. MEA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEAs לשימוש בניסויי electroporation או יכול להיות מפוברק באמצעות טכניקת photolithography סטנדרטית כפי שתואר לעיל 18 או לרכוש ישירות מספקים של יצרני MEA כגון מערכות מרובות ערוצים <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> ואלפא MED מדעי, Inc <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com).</a> את MEAs משמש בניסויים שלנו היו מפוברק בתוך הבית במתקן החדר הנקי באוניברסיטת אריזונה, המנוהלת על ידי המרכז למחקר האלקטרוניקה של מצב מוצק (CSSER). את MEAs משמש בניסויים שלנו היה 32 אלקטרודות תחמוצת אינדיום בדיל ב8 על ידי 4 מערך עם גדלי קוטר אלקטרודה 50-200 מיקרומטר בתוך זכוכית 1 סנטימטר קוטר פנימית טובה. הזכוכית גם הייתה קשורה בMEA באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר MEA בחיטוי לפני התא שלeeding. שיטות אחרות של עיקור כגון השריה באתנול 70%, טיפול בקרינת UV וטיפול במים חם כמתואר במקום אחר יכולים לשמש גם כזמן הם לא מתפשרים על היושרה של MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MEA autoclaved למכסה מנוע זרימה למינרית ומניח אותו בצלחת פטרי סטנדרטית סטרילי קלקר. לפני זריעת תאים בMEA, לעקר את מכסה מנוע הזרימה למינרית ידי הפעלת אור UV במשך 20 דקות. אם MEA הוא רגיש לאור UV לכסות את צלחת פטרי המכילה MEA ברדיד האלומיניום סטרילי תוך מכסה מנוע הזרימה הוא תחת תאורת UV. </li></ol> 2. תאי זריעה על MEA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי אסיף משורת תאי הפעלה של תאי יונקי חסיד באמצעות טריפסין / EDTA ולהעלות אותם לריכוז של 100-200 תאים / μl ב1 תקשורת סלולרית מ&quot;ל לציפוי. בניסויים שלנו היינו מוצלח בקו culturing NIH 3T3 fibroblasts תא, שורת תאי הלה ונוירונים בקליפת מוח וההיפוקמפוס עיקריים על MEA. </li><li&gt; הנח טיפת 20-30 μl של תקשורת עם תאים בMEA. להעביר את צלחת פטרי עם MEA לחממה. חשוב לוודא שגודל טיפת התא הוא גדול מספיק כדי לכסות את כל אלקטרודות על MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 שעות לאחר זריעת התאים להעביר את צלחת פטרי עם MEA מהחממה למכסה מנוע זרימה למינרית ועדינות להוסיף μl 400-500 של תקשורת חממה מראש (37 ° C) לMEA היטב. בדקו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שתאים עדיין מחוברים ובאופן שווה על משטח MEA. להעביר בחזרה MEA לחממה. תקופת ההמתנה 2 שעות לפני התוספת של תקשורת מבטיחה מספיק זמן לתאים לדבוק עם משטח MEA. בנוסף לתקשורת סלולרית מוקדם מדי לאחר זריעת התאים יכול לשטוף את התאים. אם תאים אינם דבקים גם בMEA, פני השטח שלו יכולים להיות מטופלים עם גורמי התקשרות סלולרית aspolylysine כזה, פיברונקטין, וlaminin כדי לשפר את הידבקות תא. בניסויי תא הלה אנו בדרך כלל טיפול במשטח MEA עם fibronectin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עבור 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8-12 שעות לאחר זריעת התאים, לבצע 1-2 שטיפות עם PBS כדי להסיר את כל תאים מתים. מדיום סלולרי יכול להחליף כל 24-48 שעות לפי צורך. בניסוי טיפוסי, התאים הם בדרך כלל מוכנים ל24-48 שעות לאחר transfection זריעה. כדי לשמור על עקביות ביעילות electroporation מומלץ להמתין עד שהתרבות היא לפחות 80% confluent לפני electroporation. </li></ol> 3. Transfection אתר ספציפי של siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסת חומצת גרעין. לtransfection siRNA, להכין פתרון electroporation siRNA מיקרומטר 1-2 במאגר electroporation קרח קר כדי להשיג נפח סופי של 200-400 μl. במאמר זה אנו מדגימים וידאו transfection של תאי הלה עם מקושקש רצף מצומדת Alexa 488 של siRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MEA עם תאים מן החממה למכסה מנוע זרימה למינרית סטרילי. הסר את התקשורת הסלולרית מMEA ולבצע שטיפה עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 200-400 μl שליפתרון ספירה קרה 1 מיקרומטר siRNA electroporation לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פולסים חשמליים רבועים anodic את האלקטרודות הממוקדת (עיין בשלב 4 לקביעת פרמטרים אופטימליים של פולס החשמלי). בניסויים שלנו השתמשנו במכשירים פרגמטיים מחולל צורת הגל 2414A ליצור פולסים חשמליים ו- חבילה כפולה מוטבעת (מח&quot;ש) 16 קליפ סיכה ליצור קשר עם מגיני אג&quot;ח MEA. מחולל צורת הגל יכול להיות מחובר לקליפ מח&quot;ש באמצעות לוח מעגל מודפס demultiplexor לספק הסלקטיביות של אלקטרודות הבודדה. לאלקטרודה ההשוואתית, הנח קתודת פלדה בתקשורת הסלולרית. תוך הפחתת אלקטרודה השוואתי פלדה בתקשורת זה מאוד חשוב כדי לוודא שהוא לא עושה את המגע עם פני שטח MEA. עם הקשר, זה יכול לגרום לניזק לתאים ומאה. מומלץ להוריד את האלקטרודה ההתייחסות למיקום של 1 מ&quot;מ מעל לתאים. Spacer עם גובה של 1 מ&quot;מ ניתן להציב גם לסייע בהשמה של השופטהאלקטרודה העדפות. גישה חלופית לשימוש באלקטרודה הפניה חיצונית היא להשתמש באלקטרודות שכנות כמו זוגות קתודה-האנודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר החלה בפולסים החשמליים לאלקטרודות הממוקדת על MEA, להעביר בחזרה MEA לחממה. לאחר תקופת דגירה של 5 דקות, בעדינות להחליף 75% ממאגר electroporation עם (37 ° C) תקשורת סלולרית מראש טריה. מאוחר יותר, ניאון הדמיה ניתן לעשות כדי לאשר את המשלוח של siRNA מתויג fluorescently לתאים. </li></ol> 4. אופטימיזציה של פרמטרי electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את הפרמטרים החשמליים דופק האופטימליים לelectroporation, ניסויי electroporation עיצוב לטווח ערכים של משרעת דופק, דופק משך הזמן, ומספר הפעימות. מניסיוננו עם תאי הלה, שהבחנו כי דופק יחיד מתח של משרעת מ 3 עד 9 הוולט V, ומשך זמן מיום 1 באלפיות עד 10 אלפית לגודל של 100 מיקרומטר האלקטרודה הוביל לelectroporation המוצלח עם מייליםמוות של תאים nimal. ההמלצה שלנו הוא שפרמטר אחד להיות מגוון בזמן ואחרים נשארים קבוע. כדי לכמת את יעילות electroporation לכל אחד מהפרמטרים הדופקים, אנחנו משתמשים ביודיד propidium (PI), צבע impermeant תא שכתמי חומר גרעין, ומתודולוגיה מבוססת assay חייה, כפי שמתואר בצעדים 4.2-4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים תרבית תאים בMEA ביצוע ההוראות המפורטות בשלבי 1 ו 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני electroporation להכין 300-500 μl של פתרון PI מ&quot;ל 30 מיקרוגרם / במאגר electroporation קר כקרח ו400 μl של 4 מיקרומטר calcien AM פתרון ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MEA מהחממה למכסה מנוע הזרימה למינרית. הסר את התקשורת הסלולרית מMEA ולבצע שטיפה עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 300-500 μl למאגר electroporation הקר כקרח עם בלש פרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פולסים חשמליים עם משרעת דופק רצוי ואת משך זמן לאלקטרודות הממוקדות (ציוד המשמש בניסויים שלנו ליצירה ויישום elecדופק tric לMEA מתואר בשלב 3.3). לאלקטרודה ההשוואתית להנמיך האלקטרודה פלדה למאגר electroporation בMEA היטב או להשתמש באלקטרודה השכנה כהפניה. על ידי יישום סלקטיבי פולסים של אמפליטודות או משכים שונים לאלקטרודות שונות ניסויים מרובים יכולים להתבצע באותו המכשיר. לדוגמה, על האלקטרודה MEA 32, 8 ניסויים יכולים להתבצע על ידי פיצול 32 אלקטרודות ב8 קבוצות, כל אחד בהיקף של 4 אלקטרודות. כל אחד 8 קבוצות אז יכול להיות מגורה על ידי דופק יחיד מלבני מתח של משך 5 אלפיות עם עוצמות המשתנות בטווח 3 V V-6 במרווחים של 0.5 V וקבוצה אחת יכול לשמש כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר החלת פולסי המתח להעביר MEA לחממה למשך 5 דקות. לאחר מכן, בעדינות להסיר 75% ממאגר electroporation מMEA היטב ולהחליף אותו בתקשורת סלולרית החמה. להעביר בחזרה MEA לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה של 2-4 שעותלהחליף את התקשורת הסלולרית בMEA היטב עם 300-500 μl של 4 מיקרומטר Calcein AM הפתרון ב PBS. להעביר בחזרה MEA לחממה עבור 30 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של התאים עם Calcein הבוקר, להחליף Calcein AM פתרון בMEA היטב עם PBS לאחר שתי שטיפות עם PBS. להשיג תמונות ניאון של תאים באמצעות עם מיקרוסקופ אופטי עם פילטרים לצרכן (עירור / פליטה - 535 nm/617 ננומטר) וCalcein הבוקר (עירור / פליטה - 490 nm/520 ננומטר). הספיגה של PI, בשל electroporation, גורמת לתאים לזרוח אדומים וCalcein הבוקר גורם לתאים הנמצאים בחיים כדי לזרוח ירוק. שלושה תרחישים אפשריים שניתן לצפות הם 1) סלולריים electroporated וחיים (יהיה לזרוח גם אדום וירוק), 2) תאים בחיים אבל לא electroporated (יהיה לזרוח רק ירוק) ו3) תאים עקב electroporation מתים (יהיו לזרוח רק אדום) . כדאיויות התא הייתה מחושבת כאחוז מהמספר הכולל של תאי חיים על האלקטרודה וEFF ​​electroporationiciency חושב כאחוזים מהמספר הכולל של תאים העמוסים PI / siRNA. </li></ol> 5. נציג תוצאות איור 1 מציג את טעינת אתר הספציפית של תאי הלה עם בלש פרטי. זה יכול להיות ציין כי תאים יחידים על האלקטרודה להפגין ספיגה של PI (1B איור). Assay חיה המבוצע electroporation הודעה שמש להערכת הכדאיות של תאים (איור 1 א). יעילות electroporation וכדאיויות תא לדוגמה שמוצגת באיור 1 הם 81.8% ו96.1% בהתאמה. כדאיויות תא גבוהות ויעילות electroporation ניתן להשיג על ידי אופטימיזציה של פרמטרי דופק electroporation. transfection אתר ספציפי של תאי הלה עם siRNA מתויג fluorescently לדופק electroporation אופטימיזציה (8 V, 1 msec) מוצג באיור 2. יעילות electroporation לsiRNA בשעת 8 V, 1 msec נמצאה 74.4 ± 16.0% וכדאיויות תא נמצאו 87.9 ± 8.4% (כל הנתונים המיוצגים כמתכוון ± סטיית תקן, N = 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> איור 1. מסירת אתר ספציפי של צרכן בתאי הלה על האלקטרודה 200 מיקרומטר (6 V, 5 אלפיות השני). ) Calcien assay החי המבוסס בוצע electroporation הודעת שעות 2. תאי חיים מסומנים באמצעות פלואורסצנטי ירוקה. B) האדום פלואורסצנטי מדגים את הספיגה של PI על ידי תאים באלקטרודה. ג) תמונה של גבי וB. החיצים הלבנים מצביעה על תאים שelectroporated וחיים. החיצים השחורים מצביעים על תאים שמתו. העיגול הלבן ב, B ו-C מציין את קווי המתאר של האלקטרודה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> איור 2. Transfection של תאי הלה עם scrambl מתויג fluorescentlyרצף דואר של siRNA. א) תמונה של תאי הלה על האלקטרודה 100 מיקרומטר transfected עם אלכסה siRNA מתויג 488 (8 V, 1 אלפיות). B) תמונה של גרעיני תאים מוכתם בDAPI. העיגול הלבן מסמן את הקצה של האלקטרודה.

<ol><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).</li>
<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550(2002).</li>
<li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).</li>
<li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).</li>
<li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ%2C+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).</li>
<li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+%28ethyleneimine%29+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium%3F+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+%28MEA%29+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li>
<li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li>
<li>Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).</li>
<li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594(2005).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li>
<li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה וידאו שמדגימים את שימוש MEA לtransfection אתר ספציפי של תאי הלה עם מקושקש רצף של siRNA. אחד היתרונות של טכנולוגיה זו היא תחולתו לשורות תאים שונות, כוללים שורות תאים ראשוניות. המעבדה שלנו הוכיחה בעבר את השימוש בטכנולוגיה זו לtransfection אתר ספציפי של התרבות העצבית ביפוקמפוס העיקרית מעכברוש E18 יום ישן ותאי ה-NIH 3T3 עם רצפי siRNA המקושקש וGFP פלסמיד 18, 19. גם היו לנו הצלחה באספקה ​​הפונקציונלי siRNA כנגד מטרת אנדוגני בתאי הלה (נתונים שלא פורסמו). MEA טיפוסי זמ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> תקשורת סלולרית: המתקדם MEM L-גלוטמין 200 מ&quot;מ פניצילין / סטרפטומיצין סרום שור עוברי </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia מעבדות / VWR Lonza הקבוצה בע&quot;מ Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> הרכב תא תקשורת: 2% FBS, 2% L-גלוטמין ו% 2 בPennstrep המתקדם MEM </td></tr><tr><td> טריפסין EDTA </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 וrhodamine מתויג מקושקש sequsiRNA ence </td><td> Qiagen, Inc </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר electroporation </td><td> מעבדות Biorad </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> הגל גנרטור </td><td> פרגמטי </td><td> 2414A </td><td> כל גל / מחולל פעימות שיכולות לספק את הקטניות הרצויות יכול להיות בשימוש. </td></tr></table>

יעילות גבוהה transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם sirna שימוש במערכי microelectrode (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

הגילוי של מסלול RNAi באאוקריוטים והפיתוח הבא של סוכני RNAi, כגון siRNA וshRNA, השיג שיטה רבה עצמה להשתקת גנים מסוימים 1-8 לגנומיקה ותרופות תפקודיות. אתגר גדול המעורבים במחקרים מבוססים RNAi הוא המסירה של סוכני RNAi לתאים ממוקדים. טכניקות מסורתיות שאינן נגיפיות משלוח, כגון electroporation בתפזורת ושיטות transfection כימיים לעתים קרובות חוסר השליטה במרחב הנחוצה על משלוח ולהרשות יעילות transfection עניה 9-12. התקדמות בשיטות transfection כימיות כגון שומני קטיוני, פולימרי קטיוני חלקיקים הביאה ליעילות transfection משופרת מאוד 13. עם זאת, שיטות אלו עדיין לא הצליחו להציע שליטה מרחבית מדויקת במסירה שמאוד יכולים להועיל מיניאטורי טכנולוגיות תפוקה גבוהה, מחקרי תא בודדים וחקירות של אינטראקציות תא סלולרי. nt &quot;&gt; ההתקדמות טכנולוגית האחרונה במסירת הגן אפשר transfection תפוקה גבוהה של תאי חסיד 14-23, רובם משתמשים electroporation microscale. electroporation microscale מציע שליטה זמנית spatio מדויקת במסירה (עד תאים בודדים) והוכח כדי להשיג יעילות גבוהה, 19 24-26. בנוסף, גישות מבוססות electroporation אינן דורשות תקופה ממושכת של דגירה (בדרך כלל 4 שעות) עם קומפלקסי siRNA וה-DNA לפי צורך בשיטות transfection מבוססות כימיות ולגרום לכניסה ישירה של siRNA וDNA עירום מולקולות לתוך הציטופלסמה התא. כביטוי גני תוצאה יכולות להיות מושגת כבר בשש שעות לאחר transfection 27. המעבדה שלנו הוכיחה את השימוש במערכי microelectrode (MEA) עבור transfection אתר ספציפי בתרביות של תאי יונקי חסיד 17-19 בעבר. בגישה המבוססת MEA, מסירת המטען גנטי מושגת באמצעות electroporati המקומי מייקרו בקנה מידהבתאים. יישום של פולס חשמלי לאלקטרודות נבחרת יוצר שדה חשמלי מקומי שמוביל לelectroporation נוכחיים בתאים באזור של אלקטרודות מגורה. השליטה העצמאית של אלקטרודות מייקרו מספקת שליטת מרחב ובזמן על transfection וגם מאפשרת ניסויים מבוססים transfection מרובים להתבצע על אותה תרבות הגדלת התפוקה וההפחתה הניסיונית השתנות תרבות לתרבות. כאן אנו מתארים התקנה הניסיונית ופרוטוקול transfection הממוקד של תאי הלה חסיד עם siRNA מתויג fluorescently מקושקש רצף באמצעות electroporation. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם עבור transfection של וקטורי פלסמיד. בנוסף, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להרחיב בקלות למגוון רחב של שורות תאי יונקים עם שינויים קלים. זמינות מסחרית של MEAs עם דפוסים אלקטרודה מראש מוגדרים והן מותאמים אישית להפוך לא נגיש טכניקה זומעבדות o רוב המחקר עם ציוד תרבית תאים בסיסי.

את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

גילוי מסלול ה-RNAi באיקריוטים והפיתוח שבאהו של סוכני RNAi, כגון siRNA ו-shRNA, סיפקו שיטה רבת עוצמה ל...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג טרנספקציה ספציפית לאתר בתאים נצמדים. דבר זה מושג על ידי גידול של שכבה אחת של תאים על מערך מיקרו-אלקטרודות. כשלב שני, הפעלת פולס חשמלי על אלקטרודות נבחרות מובילה לאלקטרופורציה של התאים המותחמים הנצמדים מעל האלקטרודות.דבר זה מוביל ליצירת נקבים בממברנת התא המאפשרים כניסה של מולקולות אקסוגניות לתא. ניתן לאחר מכן לסנן את התאים המטרה כדי לזהות את הפנוטיפ שנוצר באמצעות בדיקה מתאימה. לטכניקת הטרנספקציה במיקרו-קנה מידה שתיארנו כאן יש מספר יתרונות מרכזיים על פני טכניקות טרנספקציה קונבנציונליות, כגון אלקטרופורציה של תרחיפים גדולים או טרנספקציה כימית.א, הדבר מאפשר לנו להשיג בקרה מרחבית מדויקת על תהליך הטרנספקציה עצמו ומסייע לנו לבצע טרנספקציה לתאים בודדים או למקבצי תאים ביעילות גבוהה, גם בשורות תאים שקשה לבצע להן טרנספקציה. ב, זוהי גישה הניתנת להרחבה בקלות ומסייעת לנו לממש בדיקות מולקולריות בתפוקה גבוהה. אחד היתרונות המרכזיים בשימוש במערך מיקרו-אלקטרודות לטרנספקציה ספציפית לאתר הוא שהדבר מאפשר הערכה פונקציונלית סימולטנית של התאים המיועדים, כגון אלקטרופיזיולוגיה כמותית ושינויים מורפולוגיים.כדי להתחיל את הפרוצדורה, עקרו את ה-MEA באוטוקלאב, לאחר מכן העבירו את ה-MEA שעקר באוטוקלאב למCב מזרם למינרי, והניחו אותו בצלחת פטרי סטנדרטית סטרילית מפוליסטירן. לפני זריעת

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש להקמת, טיפול, הקלטה מ - ו - גירוי חשמלי תרבויות על MEAs.

איך להקליט התרבות לעידוד רשתות נוירונים על מיקרו אלקטרודה מערכים (MEAs)

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

Reticulum endoplasmic ממלא תפקיד מרכזי ב biogenesis חלבון ו הומאוסטזיס הסידן. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו כתובת תפקידו של ערוצי Ca2 + לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המתרברבים שלהם. מערכת זו כוללת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca2 + הדמיה.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

מקור: Fuchs, M. ואח'. אדנופקציה: שיטה לחקר תפקידם של מלווים מולקולריים (Molecular Chaperones) במורפודינמיקה תאית באמצעות ניסויי דלל-הצלה (Depletion-Rescue). J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הובלה באמצעות אדנווירוס של טרנסגן פלואורסצנטי בשילוב עם טרנספקציית siRNA–calcium phosphate בתאי סרטן של צוואר הרחם. האדנווירוס מבטא חלבון מחליף פלואורסצנטי, בעוד שה-siRNA משרה דגרדציה ממוקדת של mRNA באמצעות קישור ל-RISC. קו-טרנספקציה רצפית זו מאפשרת knockdown סימולטני של החלבון האנדוגני והצלה (rescue)...

טרנסדוקציה אדנו-ויראלית משולבת עם השתקה מתווכת siRNA בתאי סרטן

הסרטון מדגים כיצד להשתמש במערך מיקרואלקטרודות (MEA) כדי להקליט את הפעילות האלקטרופיזיולוגית של תאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). פעילות אלקטרופיזיולוגית מ-MEA רב-באר המכיל תרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים נרשמת כדי לזהות פוטנציאלי פעולה מתאי עצב מרובים ברשת, מה שמאשר את ההתמיינות המוצלחת של hiPSCs לנוירונים.

מדידת הפעילות האלקטרופיזיולוגית של רשתות נוירונים באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות

אנו מתארים שיטה לניסויי הצלת דלדול המשמרת את שלמות התא ואת הומאוסטזיס החלבון. אדנופקציה מאפשרת ניתוחים פונקציונליים של חלבונים בתוך תהליכים ביולוגיים המסתמכים על דינמיקה מבוססת אקטין מכווננת היטב, כגון חלוקת תאים מיטוטיים ומיוגנזה, ברמת התא הבודד.

Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה

אנו לשנות וליישם פרוטוקול שפורסם בעבר המתאר את הבידול מהירה, לשחזור, ויעיל של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) לתוך נוירונים בקליפת המוח מעוררים 12. באופן ספציפי, השינוי שלנו מאפשר שליטה של ​​צפיפות תאים עצבית ושימוש על מערכים מיקרו-אלקטרודות למדוד תכונות אלקטרו ברמת הרשת.

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

השילוב של מערכי פורציות לייזר ומיקרו-אלקטרודות (MEA) מאפשר הקלטות דמויות פוטנציאל פעולה של קרדיומיוציטים מעובדים שמקורם בתאי גזע ראשוניים. צורת הגל מספקת תובנה טובה יותר לגבי אופן הפעולה של תרכובות הבדיקה מאשר הקלטות סטנדרטיות. הוא מקשר בין מהדק טלאים וקריאת MEA כדי לייעל עוד יותר את מחקר הבטיחות האירובי בעתיד.

מדידות דמויות פוטנציאל פעולה המושרה בלייזר של קרדיומיוציטים במערכי מיקרואלקטרודות לחיזוי מוגבר של פרמקולוגיה בטיחותית

פרוטוקול זה מתאר עריכת גנום CRISPR–Cas9 מוקטנת של קולטן TCRα/β בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות 'DMF-ection', פלטפורמת אלקטרופורציה דיגיטלית מיקרופלואידית (DMF). השיטה מאפשרת עריכת גנים מקבילה עם קלט נמוך עם יכולת היתכנות גבוהה, והיא גמישה עוד יותר להעברת mRNA לספירואידים תלת-ממדיים רב-תאיים.

פלטפורמת אלקטרופורציה מיקרופלואידית דיגיטלית לעריכת גנום CRISPR בקלט נמוך וטרנספקציה של mRNA בתאי T תלוי-תלת-ממדיים ובמודלים של תאי תלת-ממד

למד שיטת שתל גנטי ספציפי לאתר בתאים מדבקים באמצעות מערכי מיקרואלקטרודות. הטכניקה משתמשת באלקטרופורציה להכנסת siRNA לתאים ממוקדים ומאפשרת בקרה מרחבית מדויקת על התהליך.

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

גלה סרטונים נוספים