קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

תקשורת קלאסית בין האלמנטים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים כרוכה בפוטנציאל פעולה המגיע לטרמינל הפרה-סינפטי, המופעל על ידי הגדלת הסידן, שחרור קולטנים פוסט-סינפטיים המפעילים גלוטמט. עם זאת, התצפית כי אסטרוציטים באים במגע אינטימי, סינופסיס ומבטאים קולטנים נוירוטרנסמיטורים שינתה את השקפתה למושג של שלושת הסינפים החלקיים. לכן העברה גלוטמטרגית מתמשכת תפעיל גם את האסטרוציט ותפעיל על ידי עליית סידן תוך תאית.

שחרור משדרי גליו, שיכולים לאחר מכן לקשור חוטים לקולטנים סינפטיים או סינפטיים נוספים מווסתים פעילויות לפני ואחרי סינפטיות. יתר על כן, אסטרוציטים ביטאו את מערכת הספיגה העיקרית של גלוטמט המשתחרר באופן סינפטי. בנוסף, הם מפנים אשלגן, המשתחרר במהלך פעולה, ירי פוטנציאלי והפעלה פוסט-סינפטית לאחר מכן מהקצה הקדם-סינפטי והפוסט-סינפטי דרך תעלות האשלגן שלהם.

אשלגן זה מועבר לאחר מכן תוך תאית לאתרים עם רמות אשלגן חוץ-תאיות נמוכות יותר, שם הוא משתחרר או מתפזר דרך צמתים מרווחים לאסטרוציטים סמוכים. לפיכך, על ידי שליטה בריכוז החוץ-תאי של חומרים נוירואקטיביים כמו גם על ידי שחרור משדרים שקופים, אסטרוציטים ממלאים תפקידים חשובים בהגדרת עוצמות הפעילות הסינפטית. המעבדה שלי חוקרת את התפקיד של אינטראקציות נוירו-גליאליות בפיזיופתולוגיה מוחית.

לכן השתמשנו ושיכללנו את הטכניקה הזו באופן נרחב כדי לחשוף את דופן האסטרוציטים בשידור סינפטי מרגע לרגע. ואכן, טכניקה זו עוצמתית מכיוון שהיא מאפשרת ניטור מקוון ובמקביל של התגובות האלקטרופיזיולוגיות הדינמיות של נוירונים. וכמרפאת אוסטאוציטים Evap היום, אש וג'רמי סיבל חברי המעבדה ידגימו לכם כיצד לבצע את הטכניקה הזו ויסבירו לכם כיצד היא עוזרת לנו, הצינג, דיאלוג אינטימי בין נוירונים לאסטרוציטים.

חקרתי את ההשפעה של רשתות אסטרוגלייד על נוירונים, העברה סינפטית ופלסטיות על ידי ביצוע הקלטות כפולות של פעילות נוירונים והתרחשות אסטרוגלי אשלגן והעברת גלוטם, ומצאתי שרשת אסלין מקלה על הסרת אשלגן וגלוטמט מחוץ לתאים במהלך פעילות עצבית. חקרתי את תכונות הטבע והפלסטיות של התרחשות אסטרוגליה ביחס לנוירופיזיולוגיה. במהלך רישום האסטרוגליה ופעילות הגירוי העצבי, הרשו לי לזהות את תגובת האסטרוציטים להפעלה עצבית, בעיקר על ידי זרמי אשלגן.

לזרם זה יש פלסטיות אלקטרופיזיולוגית משלו, שאינה מווסתת את הקבילות והפלסטיות העצבית. במילים אחרות, הספירה לאחור של האסטרוציטים, הנרגשת מאוד. נוירוס. נציג כאן שיטה חשובה לחקירת פעילות משתנה ואסטרוגליה בו זמנית בפרוסות היפוקמפוס חריפות על ידי ביצוע הקלטות כפולות של זרמי ממברנה אסטרוציטיים ופוטנציאל הזנת משתנה המעוררים על ידי גירוי סיבים פרה-סינפטיים.

יתר על כן, נבצע הקלטות זוגיות של נוירונים בודדים ואסטרוציטים סמוכים כדי לחקור תגובות ASTO gly במהלך פעילות עצבית. בחרנו בהיפוקמפוס מכיוון שאזור זה מציג מידור אנטומי ותפקודי חזק ומאופיין היטב במונחים של מעגלים עצביים כמו גם פעילות סינפטית ופלסטיות. התחילו את הניסויים על ידי הכנת פרוסות מוח בהיפוקמפוס עבור הקרח הראשון הזה שנקרא מחומצן.

נוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה, הרדמה עמוקה של העכברים שלך וחתך במהירות את הראש והעבירה ל- CSF. פתח את הגולגולת עם שלושה חתכים המופרדים כעת בין שני חצאי כדור. לבסוף, העבירו אותם ל-A CSF מחומצן.

תנו לו לקלוע באותה מידה במשך כחמש דקות. עכשיו התחילו עם חצי כדור אחד. דיסקציה של ההיפוקמפוס מתחילה בהסרת המוח האמצעי.

נתיחת ההיפוקמפוס המפורטת מומחשת כעת באיור זה. ראשית מקם את ההמיספרה המופרדת על אתר קליפת המוח שלה כדי לגשת למוח האמצעי. בעזרת שתי כפות, הסר את המוח האמצעי.

כעת ההיפוקמפוס יהיה גלוי כפי שמצוין על ידי קווי המקף. נתחו את ההיפוקמפוס בעזרת כף החל מה-fia, הנראה כמבנה רחב. הכניסו כף מתחת להיפוקמפוס ובעזרת כף שנייה חתכו את קליפת המוח הסמוכה להיפוקמפוס.

העבירו את ההיפוקמפוס לצלחת תרבית קטנה עם CSF מחומצן והמשיכו עם חצי הכדור השני מקמו את שני ההיפופוטמים על גוש AGA קטן כשצד המכתשית כלפי מעלה. עכשיו תמצוץ את DS A CSF. הדביקו את ההיפופוטם על מכשיר תא החיתוך שלכם.

מעבירים את ההיפוקמפוס לתא החיתוך וחותכים פרוסות של 300 או 400 מיקרומטר. אספו את הפרוסות בתא אחסון מחומצן ותנו להן לנוח לפחות שעה אחת של הקלטה מראש בטמפרטורת החדר כדי לבצע הקלטות סיטונאיות של אסטרוציטים בודדים. העבירו את פרוסת ההיפוקמפוס שלכם על פתק כיסוי מצופה פוליליזין.

יבש את עודפי ה-CSF כדי לאפשר הצמדה של פרוסת ההיפוקמפוס להחלקת הכיסוי המצופה פולי ולאחר מכן הוסף מחדש CSF על גבי הפרוסה. העבירו את הפרוסה לתא ההקלטה שלכם, שמתמלא כל הזמן ב-A CSF מחומצן במהירות זלוף של אחד עד שניים מיליליטר לדקה. כדי לזהות אסטרוציטים, עכברים המבטאים EGFP תחת האסטרוגליה, ניתן להשתמש במקדם GFAP ספציפי להקלטות מהדק תיקון.

מלאו צינור זכוכית בהתנגדות של ארבעה עד שישה מגה אוהם בתמיסה תוך-תאית קרה מסוננת באמצעות תמיסה תוך-תאית המכילה רודה דרון, תוכלו לדמיין באדום את האסטרוציט הטלאי בירוק. אתם רואים את האסטרוציטים השכנים מבטאים EGFP. תחת מקדם GFAP, ניתן לזהות אסטרוציטים על ידי גודל הסומה הקטן שלהם של כ-10 מיקרומטר והסתעפות התהליך העיקרי שלהם, כולל בדרך כלל שלושה עד ארבעה ענפים.

מזרק המחובר באמצעות צינור לפיפט מאפשר הפעלת לחץ חיובי תוך כדי ירידה לרקמה בחלון הפיקוד, מפעיל דופק בדיקה של 10 מילי-וולט ומחזיר את זרם ההחזקה. לאחר מכן העבירו את הפיפט בעזרת המניפולטור המיקרו לתוך הרקמה כדי להתקרב לתא. כאשר אנו מגיעים לפני השטח של התא, אנו מתקדמים הלאה עד שאנו רואים גומה הנראית כסטיית אור המצביעה על כך שאנו מעוותים מעט את פני התא.

בשל הפעלת הלחץ החיובי, קרום התא האסטרוציטי ייאטם כעת בחוזקה על פתח קצה החלילן מזכוכית, אותו ניתן לראות על ידי התנגדות גוברת כאשר מגיעים לאיטום ג'יגה. בצע פיצוי קיבול היכנס לתצורה הסיטונאית על ידי הפעלה עדינה של לחץ שלילי תוך התבוננות בחלקי הבדיקה בחלון הפקודה. הפריצה לתא תהיה גלויה על ידי זרם הזורם דרך הממברנה.

יישום סדרה של שלבי מתח היפרפולריזציה ודה-פולריזציה מאפשר אפיון של תכונות קרום התא אסטרוציטים בדרך כלל מציגים רק תגובות זרם פסיביות. הזרקת זרם במצב מהדק זרם אינה מביאה לפוטנציאל פעולה. ירי אישור נוסף שאכן תיקנת תוספת אסטרוציטים של עוקב כגון גופרית או דומין B לתיקון שלך, פיפט מאפשר הדמיה של האסטרוציט המתוקן.

יתר על כן, דיפוזיה פסיבית של העוקב במהלך 20 דקות במצב המהדק הנוכחי מאפשרת לדמיין את האסטרוציטים השכנים המחוברים לצומת הפער כדי לבצע הקלטות כפולות של שידור מעורר עצבי, ולאחר מכן זרמים אסטרוציטים. ראשית אנו חוסמים העברה מעכבת עם precor toin כדי למנוע ריגוש יתר, המתרחש בהיעדר העברת GABAergic. חתכנו את הבטחונות המתווכים בחיבורים בין CS 3 ל-C 1 בעזרת סכין קשתית קטנה.

לאחר מכן אנו ממקמים אלקטרודת גירוי שדה CSF, אלקטרודת הקלטת שדה ואלקטרודת מהדק טלאי אסטרוציטי. בפרוסה של ההיפוקמפוס, אנו בוחרים אסטרוציט וממקמים את אלקטרודת השדה במרחק של 5, 200 מיקרומטר ממנו כדי להבטיח שאכן האסטרוציט משלב את הפעילות שנרשמה עם גירוי אלקטרודות השדה של הביטחונות של שייפר יעורר פוטנציאל שדה מעורר. פוטנציאל שדה זה מורכב מדופן הסיבים המשקפת את מספר האקסונים המגורים והדפולריזציה הפוסט-סינפטית שלאחר מכן לביצוע הקלטות כפולות של פוטנציאל הזנה עצבי ותגובות זרם תא שלם אסטרוגליה.

ראשית, מקמו את אלקטרודת הקלטת השטח שלכם במרחק של כ-50 מיקרומטר מהאסטרוציט הנבחר. לאחר מכן העבירו את אלקטרודת התיקון שלכם לסומה האסטרוציטית ולמהדק הטלאי, התא הנבחר מאומת על ידי תכונות הממברנה הפסיביות שלו שהוא אכן אסטרוציטים. כעת, על ידי גירוי Shaer Cs, אנו יכולים לתעד בו זמנית פעילות עצבית וזרם אסטרוציטי שלאחר מכן, המורכב מתגובה ארוכת טווח של עד 50 תמונות בשל קישוריות הרשת שלהם והעובדה שאסטרוציט אחד יוצר קשר עם סינפסות של עד 100 נוירונים.

תאים אלה משלבים את הפעילות של מספר רב של סינפסות המופעלות בו זמנית כדי לבצע הקלטות כפולות של תאים שלמים של נוירונים בודדים ואסטרוציטים סמוכים יורדים עם שתי אלקטרודות טלאי לאזור השכבה של פרוסת ההיפוקמפוס. זהה באזור C נוירון מעניין, ובאותו עומק במרחק של כ-20 עד 60 מיקרומטר ואסטרוציטים ואז מקם את שתי הפיפטות בסביבות 10 מיקרומטר מעל כל תא תוך הפעלת לחץ חיובי. יש למקם את פיפטת ההקלטה האסטרוציטית קרוב ככל האפשר לאסטרוציט הממוקד כדי למנוע תנועות מכניות נוספות.

ראשית, השג את חותם ה-gga על הנוירון. כעת המשיכו עם תיקון האסטרוציטים, שבדרך כלל אוטמים לאט יותר מתאי עצב. לסיכום השלבים החשובים לביצוע הקלטות סיטונאיות כפולות, הורד תחילה את שני צינורות ההקלטה לתוך הפרוסה.

התקרבו לסומה של האסטרוציטים, ואז בצעו את חותם ה-gga על הנוירון וסיימו על ידי ביצוע חותם ה-gga על נוירוני האסטרוציטים בדרך כלל בעלי התנגדות ממברנה גבוהה בהרבה מאשר אסטרוציטים, כלומר עבור נוירונים פירמידליים בסביבות 200 עד 500 מגה שיש להם את שני התאים. כעת במצב מהדק מתח T והיפרפולריזציה, הממברנה מפעילה זרמי נתרן חולפים בנוירון ותגובות אשלגן פסיביות באסטרוציטים. אנו מראים כאן כי אינדוקציה של פוטנציאל שדה פוסט-סינפטי מעורר מהיר על ידי גירוי בטחונות שאא מעוררת תגובה נוכחית ארוכת טווח.

באסטרוציטים הסמוכים, עיכוב קולטני גלוטמט יונוטרופיים עם חומצה רמית מגלה שרוב זרם האסטו גלי נובע מהפעלה פוסט-סינפטית מעוררת. תגובת B AIC הנותרת מורכבת מהתרחשות הובלת גלוטמט חולפת מהירה הרגישה ל-TBOA והזרם הקטן לאורך זמן, ככל הנראה עקב שחרור האשלגן הפרה-סינפטי במהלך הפעולה. ירי פוטנציאלי של הזרם האסיטי עוקב באופן אמין מאוד אחר הפעילות הפוסט-סינפטית מכיוון ששניהם גדלו באופן ליניארי תוך הגברת הפעילות הפרה-סינפטית.

יתר על כן, זרמים אסטרוציטים מציגים כמו תגובות עצביות, הקלה על דופק מזווג. גירוי יחיד מתון של ביטחונות השאר גורם לזרם אסטו גלי גדול יחסית המעורר סינפטית בהשוואה לדפולריזציה הקטנה שנרשמה באותו תא במצב מהדק זרם. זאת בשל עמידות הממברנה הנמוכה של אסטרוציטים.

הקלטה של הדינמיקה הפוטנציאלית של ממברנת TTO gly המעוררת סינפטית היא מדד ישיר לרמות האשלגן החוץ-תאיות המקומיות על ידי ביצוע הקלטות זוגיות של נוירון ואסטרוציט סמוך, לא ראינו תגובת זרם אסטרוציטי בזמן שהנוירון ירה פוטנציאל פעולה המעיד על כך שהם לא היו מחוברים חשמלית, פוטנציאל פוסט-סינפטי מעורר באזור CS 3 מעורר גם תגובות זרם אסטרוציטי. כמו כן, ראשית, הגירוי שלה הגביר מאוד את התגובה העצבית באזור CS 3. זה רק הגביר את הזרם האסטרוציטי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אנו אמורים להבין טוב יותר כיצד להגדיר ולבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות כפולות מוצלחות של נוירונים וציטים. באמצעות טכניקה זו, אתה יכול לחקור איתות דינמי מקוון בין נוירונים לאסטרוציטים עבור התגובה האלקטרופיזיולוגית המעניינת שלך. בפרט, אתה יכול לחקור אם אינטראקציות GL חדשות הכוללות פונקציות ומודולציות של תעלת ברזל תורמות להגדרת מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.