Name: פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: למד שיטה לבידוד תאי T אפיטופ-ספציפיים נדירים באמצעות טטרמרים מבוססי MHC וחרוזים מגנטיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח אוכלוסיות פוליקלונליות טבעיות של תאי T בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות לין לורנס אנדרה האן ולתמיכה טכנית, וחברים של ג&#39;נקינס המעבדה לעזרה בפיתוח של פרוטוקול זה.

1. בידוד תא מרקמת הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של הקרח הקר cEHAA (2-mercaptoethanol EHAA + 10%, עט / סטרפטוקוקוס, gentamycin, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 55 מ&quot;מ FBS) או בינוני תא אחר שווה ערך T, לצלחת התרבות 60 מ&quot;מימ המכילה ריבוע קטן של רשת 100 מיקרומטר ניילון ומניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הטחול ובלוטות לימפה כנגישות רבות ככל האפשר. אלו צריכות לכלול לפחות את הבלוטות מפשעתי, בית השחי, זרוע, בצוואר רחם, וmesenteric הלימפה. הנח אותם על גבי רשת הניילון בצלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגג השטוח של צינור microfuge סגור 1.5 מ&quot;ל, בעדינות מועך את רקמת הלימפה מעל רשת הניילון לשחרור לימפוציטים. הוסף עוד מיליליטר 1 מתוך cEHAA וpipet למעלה ולמטה כדי לעבוד תאים להשעיה. העברת התאים דרך עוד פיסת רשת ניילון מונחת על גבי צינור צנטריפוגה פוליפרופילן מ&quot;ל 15. יש לשטוף את הצלחת ואת הרשת עם עוד 1 מ&quot;ל של הקרח הקר cEHAA, פוoling הכרכים לתוך אותו הצינור. חזור על פעולה כדי להשיג נפח השעית תא סופי של 4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר (PBS + 2% FBS, יזיד 0.05%) לנפח סופי של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend התא גלול ב Fc בלוק (סדרן חיץ + 2.4G2 נוגדנים) להיקף השווה לכ כפול מזו של הכדור עצמו סופי. לדוגמה, בלוטות הלימפה והטחול של עכבר נאיבי בדרך כלל מייצרות תא גלולה של 100 μl. במקרה זה, להוסיף 100 μl של בלוק Fc להביא נפח עד 200 μl. אם מידה רבה של clumping תא התרחשה, להסיר בזהירות את גוש התא בשלב זה עם טיפ pipet. </li></ol> 2. כתמי tetramer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PE-APC או כותרתו pMHC tetramer לריכוז סופי של 10 ננומטר (או ריכוז מותאם באופן אמפירי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים וincubaטה לשעה 1 בטמפרטורת חדר (או זמן וטמפרטורה מותאמים באופן אמפירי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. שמור על דגימות קרח או ב 4 ° C מעתה והלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של 200 μl. להעשרת tetramer כפולה, resuspend לנפח סופי של 150 μl. </li></ol> 3. העשרה מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של microbeads Miltenyi אנטי PE או אנטי APC. להעשרת tetramer כפולה, להוסיף 50 μl של שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ודגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, להגדיר עמודה מגנטית Miltenyi LS על מגנט MidiMACS או QuadroMACS. מקם צינור פתוח 15 מ&quot;ל פוליפרופילן צנטריפוגה עללצבור ישירות מתחת לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של חיץ סדרן לראש הטור, מאפשר לנוזל להתנקז לתוך צינור המ&quot;ל 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח ריבוע 100 מיקרומטר ניילון רשת על גבי העמוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים שסיימו ספינינג, לשאוב בזהירות את supernatant ו resuspend גלול ב 3 מ&quot;ל של חיץ סדרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את השעית התא דרך רשת הניילון על החלק העליון של העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר השעית התא אזלה לחלוטין בעמודה, יש לשטוף את הצינור המקורי עם 3 מ&quot;ל נוסף של חיץ סדרן ולהעביר למאגר דרך רשת הניילון לעמודה, שטיפת הרשת בתהליך. השלך את רשת הניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המאגר אזל לחלוטין לעמודה, להוסיף 3 מ&quot;ל נוסף של חיץ סדרן לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 10 עבור סכום כולל של 3 3 כביסות x מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהמגנט והמקום מעל צינור חדש 15 מ&quot;ל פוליפרופילן צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חיץ סדרן לtהוא העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להכניס את הבוכנה לתוך חלק העליון של העמודה ובתנועה רציפה אחת, דוחף את הבוכנה כל הדרך למטה, ואלץ את החיץ את הטור לשפופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצינורות המכילים את שבר eluted הכבול וזרימה דרך השבריר המאוגד למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מהשבריר הכבול, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של בדיוק 95 μl. לשאוב וresuspend השבריר המאוגד לנפח סופי של 2 מ&quot;ל. </li></ol> 4. זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שבר, להסיר 5 μl ולהוסיף עד 200 μl של חרוזי ספירה (מותאם לריכוז של 200.000 מ&quot;ל / סדרן בחיץ) בצינור 5 מ&quot;ל FACS. מניחים בצד ב 4 ° C לניתוח מאוחר יותר. כדי לחסוך זמן, חרוזים יכולים להיות מראש aliquoted לצינורות שכותרתו לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן amתמהיל אסתר של נוגדנים לסמני כתם שעל פני התאים (טבלה 1). כדי לחסוך בזמן, ניתן לעשות זאת לפני תחילתו של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר הכבול, להוסיף מנה של קוקטייל נוגדן ישירות ל~ 90 μl של תאים בצינור. אם ניתוח של השבריר המאוגד הוא רצוי, להעביר 90 μl של תאים לצינור 5 מ&quot;ל FACS ולהוסיף מנה של קוקטייל נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפנל של בקרות פיצוי חד צבע לcytometer הזרימה. עבור כל fluorochrome לשמש, לערבב 50 μl של תאי שברים לא כרוכי שאריות בצינור 5 מ&quot;ל FACS עם μl 1 של נוגדן מצומד לfluorochrome המקביל אנטי CD4. זכור להגדיר שליטת כתם גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ודגירה כל הדגימות למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חיץ סדרן לכל צינור וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר הכבול, לשאוב supernatant ו resuspend בקפידה את התאים ב200 μl של buf סדרןfer. להעביר את התאים לmicrotube 1.2 מ&quot;ל FACS. שטוף את הצינור עם 200 μl אחר של חיץ סדרן וברכה לאותו microtube. אם גושים סלולריים הם לכאורה, עובר התאים דרך מסנן מיקרומטר 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר המאוגד ופקדי פיצויים, מזוג או לשאוב supernatant ו resuspend במאגר 2 מיליליטר הסדרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת cytometer הזרימה באמצעות פקדי הפיצוי חד הצבע. בחר צד פיזור רוחב (SSC-W) כפרמטר נוסף שיירשם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הדגימות המוכתמות באמצעות רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות CD4 + או CD8 + תאי T כפי שמודגם באיורי 1 ו 2. לשברים כפותים, לאסוף כמה שיותר תאים ככל האפשר עד למקסימום של 2,000,000 אירועים בסך הכל. לשברים לא כרוכים, לאסוף 1,000,000 אירועים בסך הכל. שמור את השיעור ברכישה או מתחת 3000 אירועים לשניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות אותן מכונות, לנתח את דגימות חרוזי ספירה. לאסוף 10,000 אירועים כלל. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור את כל הנתונים כקבצי FCS. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות חרוזי הספירה באמצעות תוכנת FlowJo. פיזור עלילה קדימה על ידי FITC ונקבע שער aroung חרוזי הספירה (ראה איורי 1 ו 2). לקבוע את המספר הכולל של ספירת חרוזים שהתגלו בכל דגימה. לחסר ממספר הכולל של אירועים שנאספו על מנת לקבוע את מספר האירועים סלולריים שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספר הכולל של כל התאים בכל דגימה באמצעות המשוואות שהותוו בתיבת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות השברים המאוגדות ולא מאוגדות המוכתמות. הגדר את רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות + הלימפה, lo צד פיזור רוחב, מזבלה-, CD3 +, CD4 + או CD8 +, tetramer + תאי T בכל דגימה כמוצג באיורי 1 ו 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הכולל של תאים במדגם על ידי התדרים של כל אחד משערי ההכללה משמשים להגדרת סוג CD4 + tetramer+ או CD8 + + תאי tetramer כדי לחשב את המספר הכולל של תאי T epitope ספציפיים (תיבה 1). </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+3+domain+mutants+of+peptide%2FMHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li>
<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת pMHC tetramer מבוססת תא ההעשרה הוצגה על ידי פרוטוקול זה היא כלי רב עצמה ללימוד תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר התאים T אנדוגני. השימוש בtetramers pMHC מאפשר זיהוי של תאי T epitope ספציפיים המבוססים ישירות על היכולת שלהם להיקשר TCRs ligands pMHC מאותו מקור. ההעשרה מספקת רמת רגישות כך שאוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן יכולות להיות מזוהות ברפרטוארים אנדוגניים של תאי T ללא כל מניפולציה של המבנה הגנטי שלהם או התדירות מבשרת. כתוצאה מכך, טכניקה זו מאפשרת לחוקר ישירות לעקוב...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; ספק</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE או APC מצומדת pMHC tetramer (או multimer)</td&gt;<td&gt; תוצרת חוקר, המתקבל מליבת tetramer NIH, או נרכשו ממקורות מסחריים</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE microbeads המגנטי מצומדות</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC microbeads המגנטי מצומדות</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טורים מגנטיים LS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS או מגנט QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 או 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; חרוזי ספירת תאים</td&gt;<td&gt; טכנולוגיות חיים</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס mhc של תאי t epitope ספציפיים

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

צורך בסיסי לחוקרים הלומדים חסינות אדפטיבית עם במודלי ניסויי vivo הוא יכולת לזהות תאי T המבוססים על קולטן תא T אנטיגן (TCR) הספציפי. שיטות עקיפות רבות זמינות שבחלק ארי של אוכלוסיית תאי T היא מגורה במבחנה עם תאי T epitope ספציפי אנטיגן ספציפי ומזוהים באמצעות המדידה של מענה פונקציונלי כגון הפצה, ייצור ציטוקינים, או ביטוי של סמני הפעלה 1. עם זאת, שיטות אלו רק לזהות תאי T ספציפיים epitope מציגים אחד מפונקציות אפשריות רבות, והם אינם רגישים מספיק כדי לזהות תאי T epitope ספציפיים בתדרים מבשרים נאיביים. אלטרנטיבה פופולרית היא מודל העברת מאמצת TCR המהונדס, שבו תאי T חד שבטיים מעכבר מהונדס TCR הם seeded לתוך מארחי histocompatible ליצור אוכלוסיית מבשר גדולה של תאי T epitope ספציפיים שיכול להיות easily מעקב עם השימוש בנוגדני סמן congenic 2,3. אמנם חזק, שיטה זו סובלת מממצאי ניסויים הקשורים בתדירות לא הפיזיולוגית של תאי T עם ייחוד לepitope 4,5 אחת. יתר על כן, מערכת זו אינה יכולה לשמש כדי לחקור את ההטרוגניות התפקודית של תאי T שיבוטי epitope ספציפיים בתוך אוכלוסיית polyclonal. הדרך האידיאלית ללמוד חסינות אדפטיבית צריכה לערב זיהוי הישיר של תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר תא T אנדוגני בשיטה המייחדת את הספציפיות TCR אך ורק על ידי הכריכה לאותו מקור פפטיד: מתחמי MHC (pMHC). השימוש בtetramers pMHC וcytometry זרימה משיג זאת 6, אך מוגבל לזיהוי של אוכלוסיות בתדירות גבוהה של תאי T epitope ספציפיים נמצאו התרחבות משובטת אנטיגן מושרה הבאה בלבד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שמתאמת את השימוש בtetramers pMHC וMagneטכנולוגיה להעשרת תאי טיק כדי לאפשר זיהוי של תאים מאוד נמוכים תדר epitope ספציפיים T מרקמות עכבר הלימפה 3,7. בעזרת טכניקה זו, ניתן לעקוב אחר אוכלוסיות שלמות מקיף epitope ספציפיים של תאי T אנדוגני בעכברים בכל שלבי התגובה החיסונית.

איור 1 מתאר עלילות cytometry זרימה מייצגות של טחול pMHCII tetramer מועשר ודגימות הלימפה מעכברים נאיביים, בעוד איור 2 מציג נתונים יציגים לעכברים שחוסנו בעבר עם פפטיד הרלוונטי + CFA. gating הסידורי מסיר אירועים לא רצויים autofluorescent ואחרים מניתוח מהסוג CD4 + אוכלוסיות תאי T. + אוכלוסיית תאי T CD8 משמשת כשליטה שלילית פנימית שימושית לצביעת pMHCII tetramer של CD4 + T לתאים. שים לב שברים המאוגדים מהעשרת בדרך כלל מכילים שיעור גבוה משמעותי של תאי auto...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין מ<em&gt; In vivo</em&gt; מערכות ניסיוניות.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

צורך בסיסי עבור חוקרים הבוחנים חסינות אדפטיבית באמצעות מודלים ניסויים in vivo הוא היכולת לזהות תאי T על בסיס ה-T cell...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות תאי T נדירים הספציפיים לאפיטופ מתוך רפרטואר תאי ה-T האנדוגניים של עכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי צביעת תאי לימפואידים שנאספו באמצעות ריאגנטים של טטראמר MHC-פפטיד, אשר יסמנו באופן פלואורסצנטי את תאי ה-T הרלוונטיים הספציפיים לאפיטופ. תאים אלו, המסומנים בטטראמר, נצבעים לאחר מכן בעזרת מיקרו-חרוצים מגנטיים המצומדים לנוגדנים הספציפיים לתג הפלואורסצנטי שעל הטטראמר.בשלב הבא, התאים המסומנים מגנטית מועברים דרך עמודה ממגנטת כדי להעשיר את הדגימה בתאי T ספציפיים לאפיטופ הקשורים לטטרמר. לבסוף, התאים נצבעים עבור סממני התאים הניסויים הרצויים, ומבוצעת ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית כדי לזהות ולכמת את אוכלוסיות תאי ה-T הנדירות הספציפיות לאפיטופ שהועשרו בטטרמר. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון מערכת העברה אדופטיבית של תאי T טרנסגניים ל-TCR, הוא שהמחקרים מבוצעים על אוכלוסיות פוליקלונליות אמיתיות של תאי T ספציפיים לאפיטופ המתפתחים באופן טבעי בתוך מערכת החיסון.יתרה מכך, הרגישות הגבוהה של הזיהוי המסופקת על ידי טכניקה זו מאפשרת מחקרים של אוכלוסיות אלו כאשר הן נוכחות בתדירויות נמוכות ביותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח רבות בתחום האימונולוגיה, כגון כמה תאי T נאיביים עשויים לזהות אנטיגן נתון של מיקרוב פתוגני, וכיצד הרכב השיבוט ש

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הליך זה מדגים את טיהור בהרחבת במבחנה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים מדם היקפי שלם להדמיה שלהם באמצעות MHC בכיתה tetramers השנייה. Tetramers לאפשר הדמיה ישירה של תאים T עם סגוליות לאנטיגן יחיד ומוגדר הגבלה MHC Class II.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבידוד תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן נדיר באמצעות תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים מבוססי ננו-חלקיקים מגנטיים (aAPCs) המתפקדים עם MHC-Igs אנטיגני ונוגדנים נגד CD28. אינטראקציה של aAPCs עם תאי CD8+ T המבטאים באופן ספציפי את קולטני תאי T הממוקדים בפפטידים, ולאחר מכן התרחבותם במבחנה, מביאה להעשרה והרחבה של אוכלוסיית תאי CD8+ T זו.

העשרה מבוססת ננו-חלקיקים והרחבה של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן

סרטון זה מדגים שיטה לאפיון תאי זיכרון CD8+ מסוג T ספציפיים לנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) באמצעות טטרמרים מסוג pMHC-I (pMHC-I). טטרמר pMHC-I הוא קומפלקס של ארבע מולקולות MHC-I הקשורות לפפטידים ספציפיים ל-SIV ומצומדות לפלואורופור. טטרמרים אלה נקשרים באופן סלקטיבי לקולטני תאי T (TCRs) על תאי T CD8+ ספציפיים ל- SIV, מה שמקל על אפיון תאים אלה.

טכניקת צביעת טטרמר פפטיד-MHC-I לניתוח תאי זיכרון מסוג CD8+ ספציפיים ל-SIV

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

כתב יד זה מתאר כיצד לבצע (מולקולה בודדת) Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - מבחנים מבוססי Förster למדידת דינמיקת הקישור בין קולטן אנטיגן של תאי T (TCR) ומולקולות MHC עמוסות פפטידים אנטיגניות כפי שהן מתרחשות בתוך הסינפסה האימונולוגית של תא T במגע עם שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת מישורית פונקציונלית.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian + T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

תאי T אנטיגן ספציפי קשים לאפיין או לנצל טיפולים עקב שלהם בתדר נמוך מאוד. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול לפתח חלקיק מגנטי אשר ניתן לאגד בתאי T אנטיגן ספציפי כדי להעשיר תאים אלה ולאחר מכן להרחיב אותם כמה פי100 אפיון וטיפול.

להעשיר ולהרחיב בתאי T אנטיגן ספציפי נדיר עם חלקיקים מגנטיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשם זיהוי איכותי vivo של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. ניתוח אפשרי עם המתלים תא בודד איברים או כמויות קטנות של דם. מגוון רחב של מחקרים דורשות הניתוח של תגובות תא T ציטוטוקסי (חיסון, מחקרים חיסוני סרטן).

כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטיהור של MHC class I ומתחמי פפטיד מדרגה II מקווי עכבר ותא אנושי המספקים נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. הפרוטוקול מתמקד בהכנת דגימה באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית.

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

למד שיטה לבידוד תאי T אפיטופ-ספציפיים נדירים באמצעות טטרמרים מבוססי MHC וחרוזים מגנטיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח אוכלוסיות פוליקלונליות טבעיות של תאי T בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

גלה סרטונים נוספים