Name: פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: למד שיטה לבידוד תאי T אפיטופ-ספציפיים נדירים באמצעות טטרמרים מבוססי MHC וחרוזים מגנטיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח אוכלוסיות פוליקלונליות טבעיות של תאי T בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לין לורנס אנדרה האן ולתמיכה טכנית, וחברים של ג&#39;נקינס המעבדה לעזרה בפיתוח של פרוטוקול זה.

1. בידוד תא מרקמת הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של הקרח הקר cEHAA (2-mercaptoethanol EHAA + 10%, עט / סטרפטוקוקוס, gentamycin, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 55 מ&quot;מ FBS) או בינוני תא אחר שווה ערך T, לצלחת התרבות 60 מ&quot;מימ המכילה ריבוע קטן של רשת 100 מיקרומטר ניילון ומניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הטחול ובלוטות לימפה כנגישות רבות ככל האפשר. אלו צריכות לכלול לפחות את הבלוטות מפשעתי, בית השחי, זרוע, בצוואר רחם, וmesenteric הלימפה. הנח אותם על גבי רשת הניילון בצלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגג השטוח של צינור microfuge סגור 1.5 מ&quot;ל, בעדינות מועך את רקמת הלימפה מעל רשת הניילון לשחרור לימפוציטים. הוסף עוד מיליליטר 1 מתוך cEHAA וpipet למעלה ולמטה כדי לעבוד תאים להשעיה. העברת התאים דרך עוד פיסת רשת ניילון מונחת על גבי צינור צנטריפוגה פוליפרופילן מ&quot;ל 15. יש לשטוף את הצלחת ואת הרשת עם עוד 1 מ&quot;ל של הקרח הקר cEHAA, פוoling הכרכים לתוך אותו הצינור. חזור על פעולה כדי להשיג נפח השעית תא סופי של 4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר (PBS + 2% FBS, יזיד 0.05%) לנפח סופי של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend התא גלול ב Fc בלוק (סדרן חיץ + 2.4G2 נוגדנים) להיקף השווה לכ כפול מזו של הכדור עצמו סופי. לדוגמה, בלוטות הלימפה והטחול של עכבר נאיבי בדרך כלל מייצרות תא גלולה של 100 μl. במקרה זה, להוסיף 100 μl של בלוק Fc להביא נפח עד 200 μl. אם מידה רבה של clumping תא התרחשה, להסיר בזהירות את גוש התא בשלב זה עם טיפ pipet. </li></ol> 2. כתמי tetramer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PE-APC או כותרתו pMHC tetramer לריכוז סופי של 10 ננומטר (או ריכוז מותאם באופן אמפירי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים וincubaטה לשעה 1 בטמפרטורת חדר (או זמן וטמפרטורה מותאמים באופן אמפירי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. שמור על דגימות קרח או ב 4 ° C מעתה והלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של 200 μl. להעשרת tetramer כפולה, resuspend לנפח סופי של 150 μl. </li></ol> 3. העשרה מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של microbeads Miltenyi אנטי PE או אנטי APC. להעשרת tetramer כפולה, להוסיף 50 μl של שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ודגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, להגדיר עמודה מגנטית Miltenyi LS על מגנט MidiMACS או QuadroMACS. מקם צינור פתוח 15 מ&quot;ל פוליפרופילן צנטריפוגה עללצבור ישירות מתחת לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של חיץ סדרן לראש הטור, מאפשר לנוזל להתנקז לתוך צינור המ&quot;ל 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח ריבוע 100 מיקרומטר ניילון רשת על גבי העמוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים שסיימו ספינינג, לשאוב בזהירות את supernatant ו resuspend גלול ב 3 מ&quot;ל של חיץ סדרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את השעית התא דרך רשת הניילון על החלק העליון של העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר השעית התא אזלה לחלוטין בעמודה, יש לשטוף את הצינור המקורי עם 3 מ&quot;ל נוסף של חיץ סדרן ולהעביר למאגר דרך רשת הניילון לעמודה, שטיפת הרשת בתהליך. השלך את רשת הניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המאגר אזל לחלוטין לעמודה, להוסיף 3 מ&quot;ל נוסף של חיץ סדרן לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 10 עבור סכום כולל של 3 3 כביסות x מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהמגנט והמקום מעל צינור חדש 15 מ&quot;ל פוליפרופילן צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חיץ סדרן לtהוא העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להכניס את הבוכנה לתוך חלק העליון של העמודה ובתנועה רציפה אחת, דוחף את הבוכנה כל הדרך למטה, ואלץ את החיץ את הטור לשפופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצינורות המכילים את שבר eluted הכבול וזרימה דרך השבריר המאוגד למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מהשבריר הכבול, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של בדיוק 95 μl. לשאוב וresuspend השבריר המאוגד לנפח סופי של 2 מ&quot;ל. </li></ol> 4. זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שבר, להסיר 5 μl ולהוסיף עד 200 μl של חרוזי ספירה (מותאם לריכוז של 200.000 מ&quot;ל / סדרן בחיץ) בצינור 5 מ&quot;ל FACS. מניחים בצד ב 4 ° C לניתוח מאוחר יותר. כדי לחסוך זמן, חרוזים יכולים להיות מראש aliquoted לצינורות שכותרתו לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן amתמהיל אסתר של נוגדנים לסמני כתם שעל פני התאים (טבלה 1). כדי לחסוך בזמן, ניתן לעשות זאת לפני תחילתו של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר הכבול, להוסיף מנה של קוקטייל נוגדן ישירות ל~ 90 μl של תאים בצינור. אם ניתוח של השבריר המאוגד הוא רצוי, להעביר 90 μl של תאים לצינור 5 מ&quot;ל FACS ולהוסיף מנה של קוקטייל נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפנל של בקרות פיצוי חד צבע לcytometer הזרימה. עבור כל fluorochrome לשמש, לערבב 50 μl של תאי שברים לא כרוכי שאריות בצינור 5 מ&quot;ל FACS עם μl 1 של נוגדן מצומד לfluorochrome המקביל אנטי CD4. זכור להגדיר שליטת כתם גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ודגירה כל הדגימות למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חיץ סדרן לכל צינור וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר הכבול, לשאוב supernatant ו resuspend בקפידה את התאים ב200 μl של buf סדרןfer. להעביר את התאים לmicrotube 1.2 מ&quot;ל FACS. שטוף את הצינור עם 200 μl אחר של חיץ סדרן וברכה לאותו microtube. אם גושים סלולריים הם לכאורה, עובר התאים דרך מסנן מיקרומטר 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר המאוגד ופקדי פיצויים, מזוג או לשאוב supernatant ו resuspend במאגר 2 מיליליטר הסדרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת cytometer הזרימה באמצעות פקדי הפיצוי חד הצבע. בחר צד פיזור רוחב (SSC-W) כפרמטר נוסף שיירשם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הדגימות המוכתמות באמצעות רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות CD4 + או CD8 + תאי T כפי שמודגם באיורי 1 ו 2. לשברים כפותים, לאסוף כמה שיותר תאים ככל האפשר עד למקסימום של 2,000,000 אירועים בסך הכל. לשברים לא כרוכים, לאסוף 1,000,000 אירועים בסך הכל. שמור את השיעור ברכישה או מתחת 3000 אירועים לשניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות אותן מכונות, לנתח את דגימות חרוזי ספירה. לאסוף 10,000 אירועים כלל. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור את כל הנתונים כקבצי FCS. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות חרוזי הספירה באמצעות תוכנת FlowJo. פיזור עלילה קדימה על ידי FITC ונקבע שער aroung חרוזי הספירה (ראה איורי 1 ו 2). לקבוע את המספר הכולל של ספירת חרוזים שהתגלו בכל דגימה. לחסר ממספר הכולל של אירועים שנאספו על מנת לקבוע את מספר האירועים סלולריים שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספר הכולל של כל התאים בכל דגימה באמצעות המשוואות שהותוו בתיבת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות השברים המאוגדות ולא מאוגדות המוכתמות. הגדר את רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות + הלימפה, lo צד פיזור רוחב, מזבלה-, CD3 +, CD4 + או CD8 +, tetramer + תאי T בכל דגימה כמוצג באיורי 1 ו 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הכולל של תאים במדגם על ידי התדרים של כל אחד משערי ההכללה משמשים להגדרת סוג CD4 + tetramer+ או CD8 + + תאי tetramer כדי לחשב את המספר הכולל של תאי T epitope ספציפיים (תיבה 1). </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+3+domain+mutants+of+peptide%2FMHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li>
<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת pMHC tetramer מבוססת תא ההעשרה הוצגה על ידי פרוטוקול זה היא כלי רב עצמה ללימוד תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר התאים T אנדוגני. השימוש בtetramers pMHC מאפשר זיהוי של תאי T epitope ספציפיים המבוססים ישירות על היכולת שלהם להיקשר TCRs ligands pMHC מאותו מקור. ההעשרה מספקת רמת רגישות כך שאוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן יכולות להיות מזוהות ברפרטוארים אנדוגניים של תאי T ללא כל מניפולציה של המבנה הגנטי שלהם או התדירות מבשרת. כתוצאה מכך, טכניקה זו מאפשרת לחוקר ישירות לעקוב...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; ספק</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE או APC מצומדת pMHC tetramer (או multimer)</td&gt;<td&gt; תוצרת חוקר, המתקבל מליבת tetramer NIH, או נרכשו ממקורות מסחריים</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE microbeads המגנטי מצומדות</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC microbeads המגנטי מצומדות</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טורים מגנטיים LS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS או מגנט QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 או 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; חרוזי ספירת תאים</td&gt;<td&gt; טכנולוגיות חיים</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס mhc של תאי t epitope ספציפיים

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

צורך בסיסי לחוקרים הלומדים חסינות אדפטיבית עם במודלי ניסויי vivo הוא יכולת לזהות תאי T המבוססים על קולטן תא T אנטיגן (TCR) הספציפי. שיטות עקיפות רבות זמינות שבחלק ארי של אוכלוסיית תאי T היא מגורה במבחנה עם תאי T epitope ספציפי אנטיגן ספציפי ומזוהים באמצעות המדידה של מענה פונקציונלי כגון הפצה, ייצור ציטוקינים, או ביטוי של סמני הפעלה 1. עם זאת, שיטות אלו רק לזהות תאי T ספציפיים epitope מציגים אחד מפונקציות אפשריות רבות, והם אינם רגישים מספיק כדי לזהות תאי T epitope ספציפיים בתדרים מבשרים נאיביים. אלטרנטיבה פופולרית היא מודל העברת מאמצת TCR המהונדס, שבו תאי T חד שבטיים מעכבר מהונדס TCR הם seeded לתוך מארחי histocompatible ליצור אוכלוסיית מבשר גדולה של תאי T epitope ספציפיים שיכול להיות easily מעקב עם השימוש בנוגדני סמן congenic 2,3. אמנם חזק, שיטה זו סובלת מממצאי ניסויים הקשורים בתדירות לא הפיזיולוגית של תאי T עם ייחוד לepitope 4,5 אחת. יתר על כן, מערכת זו אינה יכולה לשמש כדי לחקור את ההטרוגניות התפקודית של תאי T שיבוטי epitope ספציפיים בתוך אוכלוסיית polyclonal. הדרך האידיאלית ללמוד חסינות אדפטיבית צריכה לערב זיהוי הישיר של תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר תא T אנדוגני בשיטה המייחדת את הספציפיות TCR אך ורק על ידי הכריכה לאותו מקור פפטיד: מתחמי MHC (pMHC). השימוש בtetramers pMHC וcytometry זרימה משיג זאת 6, אך מוגבל לזיהוי של אוכלוסיות בתדירות גבוהה של תאי T epitope ספציפיים נמצאו התרחבות משובטת אנטיגן מושרה הבאה בלבד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שמתאמת את השימוש בtetramers pMHC וMagneטכנולוגיה להעשרת תאי טיק כדי לאפשר זיהוי של תאים מאוד נמוכים תדר epitope ספציפיים T מרקמות עכבר הלימפה 3,7. בעזרת טכניקה זו, ניתן לעקוב אחר אוכלוסיות שלמות מקיף epitope ספציפיים של תאי T אנדוגני בעכברים בכל שלבי התגובה החיסונית.

איור 1 מתאר עלילות cytometry זרימה מייצגות של טחול pMHCII tetramer מועשר ודגימות הלימפה מעכברים נאיביים, בעוד איור 2 מציג נתונים יציגים לעכברים שחוסנו בעבר עם פפטיד הרלוונטי + CFA. gating הסידורי מסיר אירועים לא רצויים autofluorescent ואחרים מניתוח מהסוג CD4 + אוכלוסיות תאי T. + אוכלוסיית תאי T CD8 משמשת כשליטה שלילית פנימית שימושית לצביעת pMHCII tetramer של CD4 + T לתאים. שים לב שברים המאוגדים מהעשרת בדרך כלל מכילים שיעור גבוה משמעותי של תאי auto...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין מ<em&gt; In vivo</em&gt; מערכות ניסיוניות.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

צורך בסיסי עבור חוקרים הבוחנים חסינות אדפטיבית באמצעות מודלים ניסויים in vivo הוא היכולת לזהות תאי T על בסיס ה-T cell...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות תאי T נדירים הספציפיים לאפיטופ מתוך רפרטואר תאי ה-T האנדוגניים של עכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי צביעת תאי לימפואידים שנאספו באמצעות ריאגנטים של טטראמר MHC-פפטיד, אשר יסמנו באופן פלואורסצנטי את תאי ה-T הרלוונטיים הספציפיים לאפיטופ. תאים אלו, המסומנים בטטראמר, נצבעים לאחר מכן בעזרת מיקרו-חרוצים מגנטיים המצומדים לנוגדנים הספציפיים לתג הפלואורסצנטי שעל הטטראמר.בשלב הבא, התאים המסומנים מגנטית מועברים דרך עמודה ממגנטת כדי להעשיר את הדגימה בתאי T ספציפיים לאפיטופ הקשורים לטטרמר. לבסוף, התאים נצבעים עבור סממני התאים הניסויים הרצויים, ומבוצעת ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית כדי לזהות ולכמת את אוכלוסיות תאי ה-T הנדירות הספציפיות לאפיטופ שהועשרו בטטרמר. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון מערכת העברה אדופטיבית של תאי T טרנסגניים ל-TCR, הוא שהמחקרים מבוצעים על אוכלוסיות פוליקלונליות אמיתיות של תאי T ספציפיים לאפיטופ המתפתחים באופן טבעי בתוך מערכת החיסון.יתרה מכך, הרגישות הגבוהה של הזיהוי המסופקת על ידי טכניקה זו מאפשרת מחקרים של אוכלוסיות אלו כאשר הן נוכחות בתדירויות נמוכות ביותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח רבות בתחום האימונולוגיה, כגון כמה תאי T נאיביים עשויים לזהות אנטיגן נתון של מיקרוב פתוגני, וכיצד הרכב השיבוט של אוכלוסיית תאי T ספציפית לאפיטופ משתנה במהלך התגובה החיסונית. לפני תחילת הנתיחה, הוסף 1 mL של מצע EHAA מלא לצלח תרבית של 60 mm המכיל ריבוע קטן של רשת ניילון של 100 micron, והנח את הצלח על קרח.לאחר מכן, הוצא את הטחול מעכבר שהורדם, וכן כמה שיותר קשרי לימפה שניתן להגיע אליהם בקלות. הנח את הרקמות על גבי רשת הניילון שבצלחת התרבית. השתמש בחלקו העליון והשטוח של מבחנת מיקרו-צנטריפוגה סגורה בנפח 1.5 מיליליטר כדי למעוך בעדינות את הרקמות הלימפואידיות על רשת הניילון.כדי לשחרר את הלימפוקיטים, הוסיפו מיליליטר נוסף של מצע לצלחת ולאחר מכן בצעו פיפטור של התמיסה למעלה ולמטה כדי להביא את התאים למצב של סספנסיות. כעת, הניחו רשת ניילון חדשה על גבי מבחנת צנטריפוגה חדשה מפּוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר, והעבירו את התאים דרך הרשת החדשה. שטפו את הצלחת ואת הרשת עם מיליליטר נוסף של מצע קר ושאבו את הנפחים דרך רשת הניילון החדשה אל תוך המבחנה בנפח 15 מיליליטר.חזור על השטיפה פעם אחת נוספת. לאחר הוספת בופר מיון קר לנפח סופי של 15 milliliters, סבב את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 times G ובטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. לאחר מכן, שאב בזהירות את ה-snat resus.השעו את משקע התאים ב-FC block לנפח סופי השווה לכמעט פעמיים מנפח המשקע עצמו. אם התרחשה רמה גבוהה של התקבצות תאים, הסירו בזהירות את גוש התאים בעזרת טיפ פפיטה כדי לצבוע תאי T ספציפיים לאנטיגן.הוסף טטרמר MHC של פפטיד המסומן פלואורסצנטית למשקע התאים שהושעה בריכוז המיטבי. לאחר מכן, ערבב את תרחיף התאים והדגס בזמן ובטמפרטורה המיטביים לקשירת הטטרמר. לאחר מכן, הוסף בופר מיון קר כדי להביא את הנפח ל-15 milliliters וסבב בצנטריפוגה תוך שמירת התאים בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius.כעת, שאבו בזהירות את הנוזל העליון. לאחר מכן, השעיקו מחדש את משקע התאים בבופר מיון לנפח סופי של 200 microliters. כעת הוסיפו 50 microliters של חרוזי מיקרו מגנטיים מצומדים לנוגדני Miltenyi, אשר נקשרו באופן ספציפי לתג הפלואורסצנטי של תערובת הטטרמרים, ולאחר מכן דגרו את התאים והחרוזים הקשורים לטטרמרים בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.לאחר 20 דקות, שטפו את התאים בבופר מיון (sorter buffer) בעודם בצנטריפוגה. הניחו עמודת מגנט Milani LS על מגנט Quadro Max ומיקמו מבחנה חדשה של 15 מיליליטר מפוליפרופילן לצנטריפוגה. ממש מתחת לעמודה, הוסיפו שלושה מיליליטר של בופר מיון לחלק העליון של העמודה, ואפשרו לו להתנקז אל תוך המבחנה של 15 מיליליטר.לאחר מכן, הנח ריבוע רשת ניילון של 100 מיקרון על גבי העמודה. כאשר סבב הצנטריפוגה של התאים הסתיים, שאב בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשהה מחדש את המשקע (pellet) בשלושה מיליליטר של sorter buffer, והעבר את תרחיף התאים דרך רשת הניילון אל חלקו העליון של העמודה. כאשר תרחיף התאים התנקז לחלוטין לתוך העמודה, שטוף את המבחנה המקורית עם שלושה מיליליטר נוספים של sorter buffer והעבר אותם דרך הרשת אל העמודה.לאחר איסוף נוזל השטיפה לשפופרת האיסוף, השליכו את רשת הניילון. כאשר הבאפר התנקז לחלוטין לשפופרת, שטפו את העמוד פעמיים נוספות עם 3 mL של באפר מיון בכל פעם. לאחר מכן, הסירו את העמוד מהמגנט והניחו אותו מעל שפופרת צנטריפוגה חדשה מפוליפרופילן בנפח 15 mL.כעת הוסיפו חמישה מיליליטרים נוספים של בופר מיון (sorter buffer) לעמודה. הכניסו מיד את הבוכנה לחלק העליון של העמודה, ובתנועה אחת רציפה, דחפו את הבוכנה עד למטה, כדי לדחוק את הבופר מהעמודה אל השפופרת. לאחר סבוב (spin down) של השפופרת המכילה את פראקציית התאיים הקשוריים ששוללו (eluded bound fraction) והשפופרת המכילה את פראקציית התאיים שאינם קשורים שעברו דרך העמודה (flow through unbound fraction), שאבו בזהירות את העלייה (supernatant) מפראקציית הקשוריים ותלו את משקע התאים (cell pellet) בבופר מיון לנפח סופי של בדיוק 95 µL; שאבו ותלו את פראקציית התאיים שאינם קשוריים לנפח סופי של 2 mL לפני המשך צביעת פראקציות התאים. הוסיפו 200 µL של חרוזי ספירה (counting beads) לשפופרת fax של 5 mL והעבירו 5 µL של תאים לשפופרת זו.הצמידו את המבחנות הללו בצד בטמפרטורה של 4 °C לצורך אנליזה. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר (master mix) של נוגדנים לצביעת סממני שטח על התאים בהתאם לטבלה. עבור הפראקציה הקשורה, הוסיפו מנה של תערובת הנוגדנים ישירות לתאים עבור הפראקציה הבלתי קשורה.העבר 90 µL של התאים לשפופרת fax של 5 mL והוסף לדגימה שהועברה מנה של תערובת נוגדנים עבור כל פלואורוכרום שיבוא לשימוש. ערבב 50 µL מהחלק הבלתי קשור שנותר של התאים בשפופרת fax של 5 mL עם 1 µL של נוגדן anti CD4 המשורשר לפלואורוכרום המתאים. הקצה בנפרד גם בקרת אי-צביעה, בצע vortex ולאחר מכן הדגר את כל הדגימות בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות.לאחר שטיפת כל מבחנה בחמישה מיליליטר של sorter buffer, שאבו בזהירות את העלייה (supernatant) מדגימות הפракציה הקשורה והשעיו את התאים ב-200 microliters של sorter buffer. העבירו את התאים למבחנות מיקרו מסוג fax בנפח 1.2 milliliter, ואז שטפו את המבחנות הקודמות ב-200 microliters נוספים של sorter buffer, תוך איסוף השטיפות למבחנות המיקרו המתאימות. אם נצפים גושים, העבירו את התאים דרך מסנן של 50 micron עבור הפракציה הבלתי קשורה ובקרות הפיצוי (compensation controls), שפכו את העלייה והשעיו את המשקעים במיליליטר אחד של sorter buffer.נתחו את הדגימות הצבועות באמצעות רצף של שערי הכללה (inclusion gates) עוקבים לזיהוי תאי T חיוביים ל-CD4 או חיוביים ל-CD8, כפי שמוצג כאן עבור דגימות הפראקציה הקשורה. אספו כמה שיותר תאים עד למקסימום של 2 מיליון אירועים סה"כ עבור דגימות הפראקציה הלא-קשורה. אספו 1 מיליון אירועים סה"כ.לבסוף, תוך שימוש באותן הגדרות מכשיר, אספו 10,000 אירועים מדגימות חרוזי הספירה. איור ראשון זה מציג תרשימי ציטומטריה של זרימה מייצגים של דגימות טחול וקשרי לימפה מועשרות בטטראמר peptide MHC two מעכברים נאיביים, עבור פראקציות של תאים קשורים ולא קשורים. סדרת שערים הוגדרה כדי לבחור אירועים עם פיזור לימפואידי חיובי, פיזור צדי עם dump נמוך ושלילי, ו-CD three חיובי; מתוך אלה, אירועים של CD four חיובי או CD eight חיובי סווגרו לניתוח של תאי T ספציפיים לאפיטופ או לצביעת רקע.מנות (Aliquots) של תאים לא צבועים מהפракציות הקשורות והבלתי קשורות עורבבו עם חרוזי ספירה פלואורסצנטיים ונבדקו בנפרד. תרשימי צפיפות אלו מציגים נתונים מייצגים עבור עכברים שחוסנו בעבר עם הפפטיד הרלוונטי בתוספת עזר (adjuvant) מלא. אותה אסטרטגיית סינון (gating) רציפה כבניסוי הקודם שימשה להסרת אוטופלואורסצנציה ואירועים בלתי רצויים אחרים.מניתוח אוכלוסיות תאי ה-T החיוביים ל-CD4, שימשה אוכלוסיית תאי ה-T החיוביים ל-CD8 כביקורת פנימית שלילית יעילה לצביעת טטרמר של peptide MHC II בתאי T חיוביים ל-CD4. המספרים המוחלטים של תאי T ספציפיים לאפיטופ בדגימה מחושבים על ידי הכפלת המספר הכולל של כל התאים בחלק הקשור של הדגימה המועשרת, כפי שנקבע מניתוח ספירת החרו지를, בחלקם של תאים אלו שהם חיוביים לטטרמר כפי שנקבע מניתוח צביעת התאים. עבור נתוני העכבר הנאיבי המייצגים המוצגים בסדרה הראשונה של תרשימי הצפיפות, ספירת התאים הכוללת הייתה 4,411 וספירת החרו지를 הייתה 5,589. ריכוז מלאי החרוזים היה 2×10⁵ למילליליטר.נפח החרוצים היה 0.2 milliliters ונפח התאים היה 0.005 milliliters. לפיכך, נתונים אלו שימשו לחישוב ריכוז תאים של 6.31 times 10 to the sixth ל-milliliter. לאחר מכן, ריכוז התאים הוכפל בנפח הדגימה הכולל כדי לקבל את מספר התאים הכולל.נתונים אלו הוכפלו בתורם באחוז האירועים החיוביים לטטמר מניתוח התאים, כדי לקבוע שמספר תאי ה-T החיוביים ל-CD4 הספציפיים לאפיטופ מעכבר נאיבי זה היה 98. עבור נתוני העכבר המחוסן המייצגים בסדרה השנייה של תרשימי הצפיפות, המספר הכולל של תאי T חיוביים ל-CD4 הספציפיים לאפיטופ היה 1.53 × 10⁴. יעילות ההעשרה פוחתת ככל שמספר תאי ה-T הספציפיים לאפיטופ עולה.לפיכך, ניתן להבחין בתאים חיוביים לטטראמר בחלק הבלתי קשור של דגימות המכילות תדירויות גבוהות מאוד של תאי T ספציפיים לאפיטופ. במקרים כאלו, ניתן לחשב בנפרד את מספר תאי ה-T הספציפיים לאפיטופ שנמצאים בחלק הבלתי קשור ולהוסיפו למספר שנמצא בחלק הקשור. לדוגמה, בחלק התאים הבלתי קשור של עכבר מחוסן מייצג, המספר הכולל של תאי T חיוביים ל-CD4 הספציפיים לאפיטופ היה 8.97 × 10³.כך, על ידי חיבור המספרים בחלקים הקשורים והלא-קשורים, היו 2.43 × 10⁴ תאי T חיוביים ל-CD4 ספציפיים לאפיטופ בסך הכל במדגם השלם של העכבר המחוסן. למעשה, אם התרחבות התאים הספציפיים לאפיטופ היא חזקה מספיק, ניתן לדלג על תהליך ההעשרה. לאחר הליך ההעשרה, ניתן לבצע שלבי קיבוע וחדירה (permeation) כדי לאפשר צביעה של חלבונים תוך-תאיים כגון ציטוקינים וגורמי שעתוק.בעוד ששיטה זו תוכננה במקור למחקרי T cells מהטחול ומקשרי הלימפה, ניתן להחיל אותה גם על רקמות אחרות כמו הטימוס והמעי. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי לחקור T cells ספציפיים לאפיטיפ בדגימות דם ורקמות אנושיות.

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הליך זה מדגים את טיהור בהרחבת במבחנה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים מדם היקפי שלם להדמיה שלהם באמצעות MHC בכיתה tetramers השנייה. Tetramers לאפשר הדמיה ישירה של תאים T עם סגוליות לאנטיגן יחיד ומוגדר הגבלה MHC Class II.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבידוד תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן נדיר באמצעות תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים מבוססי ננו-חלקיקים מגנטיים (aAPCs) המתפקדים עם MHC-Igs אנטיגני ונוגדנים נגד CD28. אינטראקציה של aAPCs עם תאי CD8+ T המבטאים באופן ספציפי את קולטני תאי T הממוקדים בפפטידים, ולאחר מכן התרחבותם במבחנה, מביאה להעשרה והרחבה של אוכלוסיית תאי CD8+ T זו.

העשרה מבוססת ננו-חלקיקים והרחבה של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן

סרטון זה מדגים שיטה לאפיון תאי זיכרון CD8+ מסוג T ספציפיים לנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) באמצעות טטרמרים מסוג pMHC-I (pMHC-I). טטרמר pMHC-I הוא קומפלקס של ארבע מולקולות MHC-I הקשורות לפפטידים ספציפיים ל-SIV ומצומדות לפלואורופור. טטרמרים אלה נקשרים באופן סלקטיבי לקולטני תאי T (TCRs) על תאי T CD8+ ספציפיים ל- SIV, מה שמקל על אפיון תאים אלה.

טכניקת צביעת טטרמר פפטיד-MHC-I לניתוח תאי זיכרון מסוג CD8+ ספציפיים ל-SIV

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

כתב יד זה מתאר כיצד לבצע (מולקולה בודדת) Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - מבחנים מבוססי Förster למדידת דינמיקת הקישור בין קולטן אנטיגן של תאי T (TCR) ומולקולות MHC עמוסות פפטידים אנטיגניות כפי שהן מתרחשות בתוך הסינפסה האימונולוגית של תא T במגע עם שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת מישורית פונקציונלית.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian + T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

תאי T אנטיגן ספציפי קשים לאפיין או לנצל טיפולים עקב שלהם בתדר נמוך מאוד. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול לפתח חלקיק מגנטי אשר ניתן לאגד בתאי T אנטיגן ספציפי כדי להעשיר תאים אלה ולאחר מכן להרחיב אותם כמה פי100 אפיון וטיפול.

להעשיר ולהרחיב בתאי T אנטיגן ספציפי נדיר עם חלקיקים מגנטיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשם זיהוי איכותי vivo של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. ניתוח אפשרי עם המתלים תא בודד איברים או כמויות קטנות של דם. מגוון רחב של מחקרים דורשות הניתוח של תגובות תא T ציטוטוקסי (חיסון, מחקרים חיסוני סרטן).

כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטיהור של MHC class I ומתחמי פפטיד מדרגה II מקווי עכבר ותא אנושי המספקים נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. הפרוטוקול מתמקד בהכנת דגימה באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית.

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

למד שיטה לבידוד תאי T אפיטופ-ספציפיים נדירים באמצעות טטרמרים מבוססי MHC וחרוזים מגנטיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח אוכלוסיות פוליקלונליות טבעיות של תאי T בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

גלה סרטונים נוספים